JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Spatiotemporal Dalgalanma Spektroskopisi ile Kaçakçılık Yapan Hücre Altı Nanoyapıların Yapısal ve Dinamik Özelliklerinin İncelenmesi

Published: August 16, 2021
doi:
10.3791/62790
, , ,
1NEST Laboratory,Scuola Normale Superiore, 2Center for Nanotechnology Innovation@NEST CNI@NEST

Summary

Görüntüleme kaynaklı ortalama kare yer değiştirme (iMSD) analizi, makropinozomlara yapısal ve dinamik özellikler açısından içsel zaman evrimleşen doğalarını vurgulamak için uygulanır. Makropinozomlar daha sonra zaman değişmez ortalama yapısal / dinamik özelliklere sahip hücre altı yapılar için bir referans olarak insülin salgı granülleri (ISG’ler) ile karşılaştırılır.

Abstract

Görüntüleme kaynaklı ortalama kare yer değiştirmesi (iMSD), çözünenlerin ve biyomoleküllerin endo / ekzositotik kaçakçılığında rol oynayan veziküller gibi hücre altı nanoyapıların yapısal ve dinamik özelliklerini ele almak için kullanılır. iMSD standart hızlandırılmış görüntülemeye dayanır, herhangi bir optik kurulumla uyumludur ve yörüngeleri ayıklamak için tek nesneler üzerinde durması gerekmez. Her bir iMSD izinden, ortalama yapısal ve dinamik parametrelerin (yani, boyut, yerel difüzyon, anormal katsayı) benzersiz bir üçlüsü hesaplanır ve incelenen nanoyapının “iMSD imzasını” oluşturmak için birleştirilir.

Bu yaklaşımın gücü, burada örnek makropinozomlar vakası ile kanıtlanmıştır. Bu veziküller zamanla gelişir ve hücre içi kaçakçılığın erken ve geç aşamalarından geçen ortalama boyutlarını, sayılarını ve dinamik özelliklerini değiştirir. Bir kontrol olarak, insülin salgı granülleri (ISG’ler), tüm nesne popülasyonunun ortalama yapısal ve dinamik özelliklerinin zaman içinde değişmez olduğu sabit bir durumda yaşayan hücre altı yapılar için bir referans olarak kullanılır. iMSD analizi, bu tuhaf özellikleri nicel olarak vurgulamakta ve hem fizyolojik hem de patolojik durumlarda hücre altı düzeyde benzer uygulamalara yol açmaktadır.

Introduction

Hücre altı nanoyapılar (örneğin, endositik / salgı vezikülleri, organeller) hücre sinyal regülasyonunda çok önemli bir rol oynar1. Yapısal (örneğin, boyut) ve / veya dinamik (örneğin, difüzyon) özelliklerinin uygun şekilde ayarlanması, hücrenin iç veya dış uyaranlara nasıl tepki verdiğini belirler 2,3,4. Bu kanıtlara dayanarak, bu özelliklerin değişikliklerinin birçok patolojik durumda bulunması şaşırtıcı değildir. Örnekler, yanlış düzenlenmiş endositozun kanser 2,3’teki rolünü,Tip-2 Diyabet koşullarına maruz kalan β hücrelerde ISG’ler düzeyinde bulunan yapısal ve dinamik değişiklikleri5, globoid hücreli lökodistrofi veya galaktosilseramidlipidozda lizozomal yapısal ve taşıma özelliklerinin yanlış düzenlenmesini ve nörodejeneratif bozukluklarda endolizozomal yolaktaki işlev bozuklukları (örneğin, Alzheimer hastalığı)7’yi kapsamaktadır.

Bu bağlamda, araştırmacılar yakın zamanda standart optik mikroskopi yöntemlerinin performansının, mekansal ve zamansal örnekleme çözünürlüğü8’in uygun şekilde ayarlanmasıyla geliştirilebileceğini kanıtlamışlardır. Bu da, biyolojik ilgili süreçler hakkında daha fazla bilgi sağlayabilir. Uygulamada, bu, yayılan nesnelerin ortalama yapısal ve dinamik özelliklerini, ilgilenilen biyolojik nesne hakkında ön bilgiye ve tek nesneli yörüngelerin çıkarılmasına gerek kalmadan doğrudan standart optik mikroskopi görüntüleri yığınından eşzamanlı olarak çıkaran bir uzaysal zamansal dalgalanma analizi algoritması ile mümkün olmaktadır. Tüm bu bilgiler yöntemin tek bir çıktısına dahil edilmiştir: bir iMSD izleme9 (iMSD iz türetme ve analizi ile ilgili ayrıntılar Ek Dosya 1’de verilmiştir).

Ortaya çıkan deneysel protokol birkaç adımdan oluşur. İlk olarak, ilgilenilen bölgenin görüntülenmesi yüksek zamansal çözünürlükte gerçekleştirilir. Daha sonra, ortalama uzaysal-zamansal korelasyon fonksiyonları görüntü yığınından hesaplanır. Son olarak, korelasyon fonksiyonları serisinin Gauss uydurma yoluyla, ortalama ‘difüzyon yasası’ doğrudan görüntülemeden elde edilir ve nesne difüzyon modunu tanımak için analiz edilir. Yöntemin potansiyeli, moleküllerden nanopartiküllere ve hatta tüm hücre altı organellere / yapılara kadar çeşitli biyolojik nesneler için zaten kanıtlanmıştır 9,10,11,12,13,14,15.

Bu makale, makropinozomlara iMSD uygulamasını, ortalama (yani tüm popülasyon düzeyinde) yapısal ve dinamik özellikleri açısından içsel, geri dönüşümsüz zaman evrimleşen doğalarını vurgulamak için bildirmektedir. Ayrıca, bu endositik veziküller, ‘durağan bir durumdaki’ hücre altı yapılar için bir referans olarak ISG’lerle karşılaştırılır, yani tüm granül popülasyonunun ortalama yapısal / dinamik özelliklerinin herhangi bir zaman noktasında sabit kaldığı bir durum. Makropinositoz, plazma zarının genişletilmiş yeniden düzenlenmesi (veya karıştırılması) ile başlatılan ve daha sonra içselleştirilen harici bir makropinositik yapı oluşturmak için başlatılan bir dizi olayı tanımlar16. Oluşan erken evre makropinozomlar fagozomlara çok benzer. Aynı zamanda, karakteristik büyük boyutları, morfolojik heterojenlikleri ve protein kaplama yapılarının eksikliği nedeniyle diğer endositik vezikül formlarından ayırt edilebilirler.

Biyokimyasal tahliller, içselleştirildikten sonra, makropinozomların giderek diğer endositik yolların protein belirteçleri ile zenginleştiğini ve bunun da insan ticareti sırasında kimliklerinin sürekli değiştiğini gösterdiğini ortaya koymuştur17. Endozomal yolun bilinen belirteçlerine karşı antikorlar kullanılarak, makropinozomların klasik endozomal özellikleri aşamalı olarak benimsedikleri gösterilmiştir: boyut olarak küçülürler, geç endositik yapılara (örneğin, lizozomlar) dönüşürler veya sonunda spesifik moleküler belirteçlerin membran aracılı olarak alınması yoluyla kimliklerini kaybederler (örneğin, neksinlerin sıralanması)18,19 . Genel senaryo, hücre içindeki her bir makropinozomun, plazma zarından nihai hücre içi kaderine kaçakçılık sırasında yapısal ve dinamik (ve aynı zamanda moleküler) kimliğini geri dönüşümsüz olarak değiştirmesidir. Sonuç olarak, makropinozomların tüm popülasyonunun yapısal/dinamik/moleküler özellikleri de aynı zamansal yol boyunca değişmektedir. Gözlemlenen nesnelerin tüm popülasyonunun ortalama özelliklerine içsel olarak duyarlı olan iMSD yöntemi, anahtar ortalama parametrelerin, yani yerel difüzyon ve anormal katsayının (dinamik özellikler) ve makropinozomların ortalama büyüklüğünün (yapısal özellikler) hücre içi kaçakçılığının herhangi bir aşamasında nicelleştirilmesiyle ‘evrimleşen doğayı’ nicel olarak tasvir eder.

Karşılaştırma için, benzer ölçümler, β hücreli bir modelde, iyi bilinen hücre içi membranla çevrili bir yapı olan ISG üzerinde gerçekleştirildi. Makropinozomlar gibi, ISG’lerin yapısal ve dinamik özelliklerinin düzenlenmesi, Trans Golgi Ağı’ndaki (TGN) oluşumlarından plazma zarındaki ekzositozlarına kadar, ISG fonksiyonunun20’nin düzgün bir şekilde yürütülmesi için çok önemlidir. Bununla birlikte, makropinozomların aksine, ISG’ler, herhangi bir zamanda, ISG ömrünün tüm işlevsel / yapısal / moleküler aşamalarının hücre içinde aynı anda mevcut olduğu ve her birinin ISG’lerin belirli bir alt popülasyonu ile temsil edildiği ‘durağan bir durumda’ yaşar. Bu, her bir granülün biyogenezden sekresyona geri dönüşümsüz bir şekilde evrimleşmesine rağmen, tüm granül popülasyonunun ortalama yapısal/dinamik özelliklerinin herhangi bir zaman noktasında sabit kalması beklendiği anlamına gelir (durağan durum koşulları, örneğin glikoz, kolesterol ve sitokinler gibi dış uyaranlar tarafından değiştirilmediği sürece, 13). Bu, iMSD analizi ile doğrulanır.

Protocol

1. Numune hazırlama Mikroskopi deneyinden önce, mikroskopi uygulamaları için uygun olan tabaklardaki alt kültür hücreleri. 10 cm’lik doku kültürü ile muamele edilmiş bir konfluent HeLa veya INS 1E (insülinoma β hücre benzeri) hücre kabını 0.01 M 1x PBS ile iki kez yıkayın, 1 mL% 0.05 tripsin-EDTA (1x) ekleyin ve 37 °C, nemlendirilmiş,% 5 CO2 inkübatöre 5 dakika boyunca yerleştirin. 9 mL tam DMEM (HeLa hücreleri için) veya RPMI 1640 (INS-1E hücreleri için) ortamı ekleyerek ayrılan hücreleri yeniden askıya alın ve santrifüj tüplerinde son 10 mL’yi toplayın. Her35 mm x 10 mm tabakta yaklaşık 2 × 10 5 hücre, ortamın 1 mL’lik son hacminde tohumlanır. Hücreleri 37 ° C’de 24 saat ve% 5 CO2’de inkübe edin. Lizozomları floresan olarak etiketlemek için LysoTracker Red DND-99 kullanın. Stok çözeltisini 1 mL önceden ısıtılmış ortamda 70 nM’lik son boya konsantrasyonuna kadar seyreltin. Çanaktaki ortamı taze LysoTracker içeren ortamla değiştirin. LysoTracker içeren ortamdaki hücreleri% 5 CO 2 atmosferinde 37 ° C’de20 dakika boyunca inkübe edin ve deneyden önce iki kez taze ortamla yıkayın. Makropinozomları floresan olarak etiketlemek için, 70-kDa floresein izotiyosiyanat-dekstran kullanın. Alt kültürlenmiş hücreleri 0.01 M 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez yıkayın, dekstran içeren ortam (1 mg / mL) ile değiştirin ve 30 dakika boyunca 37 ° C’de inkübe edin. Mikroskopi deneyine devam etmeden önce, hücreleri taze ortamla üç kez yıkayın. INS-1E hücrelerinde ISG’leri floresan olarak etiketlemek için, üreticinin protokolüne göre transfeksiyon reaktifi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve C-peptid ile güçlendirilmiş yeşil floresan protein (EGFP) plazmid13 kullanarak hücreleri transfekte edin ve deneyden önce% 5’lik bir CO2 atmosferinde 24 saat boyunca 37 ° C’de inkübe edin. 2. Veri Toplama Mikroskopun istenen sıcaklık ve atmosferde dengelenmesini sağlamak için, mikroskop inkübatör kontrol sistemini deneyden en az 2 saat önce açın.NOT: Her edinme hızlandırılmış bir seridir. 60x, 1.2 Sayısal Diyafram (NA) suya daldırma hedefi ile donatılmış ters çevrilmiş bir konfokal mikroskop kullanarak görüntüleri elde edin. EGFP (transfekte hücreler) ve floresein etiketli makropinozomların uyarılması için 488 nm Argon lazer kullanın. Standart bir fotoçarpan tüp dedektörü kullanarak 500 ila 600 nm arasındaki floresan emisyonunu toplayın. Lysotracker’ı heyecanlandırmak ve floresan emisyonunu 555 ila 655 nm arasında toplamak için 543 nm HeNe lazer kullanın. Algılama iğne deliğinin çapını 1 Airy boyutuna ayarlayın. Her edinme için 1000 sıralı çerçeveden oluşan bir seri toplayın. 129 ms’lik bir kare süresi için piksel bekleme süresini 2 μs/piksel olarak ayarlayın.NOT: Her kare, yaklaşık 17 μm x 17 μm’lik bir alana karşılık gelen 69 nm/piksel fiziksel boyuta sahip 256 x 256 pikselden (16 bit/piksel) oluşuyordu. 3. iMSD hesaplama NOT: Hesaplamayı düzgün bir şekilde yürütmek için, sayısal hesaplama ve komut dosyası programlama yeteneğine sahip bir yazılım kullanın. Belirli bir komut dosyası (yani, ‘iMSD.m’ komut dosyası için bkz. Destek Dosyası 1), işlenecek görüntü serisini içeren aynı dizinde bulunmalıdır. Serinin her görüntüsü ayrı bir ‘.tif’ dosyası olarak kaydedilmelidir. Edinimler için kullanılan araçsal parametreleri düzgün bir şekilde başlatmak için, iMSD.m’yi yazılım metin düzenleyicisiyle açın ve ilk bölümünü aşağıdaki gibi değiştirin. N’yi zaman serisindeki kare sayısı olarak ayarlayın (örneğin, bu protokolde 1000). px_size ayarlayın: μm cinsinden ifade edilen piksel boyutu (ör. bu protokolde 0,069). f kümesi: saniye cinsinden ifade edilen her karenin zamansal çözünürlüğü (örneğin, bu protokolde 0,129). Filtreyi Ayarla: arka plan düzeltmesi için ikili giriş, ham görüntüleri işlemek için değeri ‘0’ olarak ayarlayın veya eşik tabanlı bir arka plan çıkarma işlemi gerçekleştirmek için değeri ‘1’ olarak ayarlayın. av_toll ayarlayın: arka plan düzeltmesi için eşik; yoğunluğu bu değerden düşük olan herhangi bir piksel, Filter=1 ise 0 olarak ayarlanır. Biti, yoğunluk örneklemesini belirleyen tamsayı sayısı olarak ayarlayın (ör. 8 bit, 16 bit). Düzenlenen iMSD.m komut dosyasını kaydedin ve çalıştırın. Komut dosyası yürütmeyi kontrol edin.NOT: Hesaplama işleme durumu komut penceresinden kontrol edilebilir; önemli bir sorun oluşursa, işlem kesintiye uğrar ve hata türünü ve ilgili satır kodunu göstermek için bir uyarı iletisi görüntülenir. Aksi takdirde, 3.3.1-3.3.3 arasındaki adımları izleyin. Görüntü yığınını içe aktarın ve arka planı çıkarın (gerekirse). Fourier yöntemini kullanarak uzaysal zamansal korelasyon fonksiyonu G(ξ,η,τ)’yi hesaplayın. Uzaysal zamansal korelasyon fonksiyonunu 2B Gauss fonksiyonuyla eşleştirin.NOT: İşlemin sonunda, σ 2 (τ) montaj prosedürlerinin çıkış değerleri komut penceresinde gösterilecektir: ortalamalar, hata ve buna karşılık gelen iyilik (R2) bildirilir. Grafik çıktıyı kontrol edin.NOT: iMSD eğrisi ve buna karşılık gelen bağlantı eğrileri, her biri kullanılan farklı türde bir montaj denklemi için üç ayrı panelde gösterilir: Brownian difüzyonu, anormal difüzyon veya sınırlı difüzyon. Her eğri için, R2 değeri grafik göstergesinde bildirilir. Metin çıktısını kontrol edin.NOT: İşlemin sonunda, orijinal hızlandırılmış ‘.xls’ dosyasıyla aynı ada sahip bir ‘.tif’ dosyası oluşturulur. İlk sayfa, her zaman gecikmesi için hesaplanan ξ, η, τ ve σ2 değerlerini içerir. Giriş parametreleri ve esas olarak hesaplanan çıkış değerleri ikinci sayfada raporlanır, yani difüzyon katsayısı, anormal katsayı ve y ekseni σ20 kesişmesi.

Representative Results

Yöntemin genel iş akışı Şekil 1’de sunulmuştur. Protokol bölümünde sunulan ana adımları, numune hazırlamadan (Şekil 1A) hücre içi nanoyapıların hızlandırılmış görüntülemesine (Şekil 1B), uzaysal zamansal korelasyon fonksiyonları serisinin hesaplanması için dalgalanma analizine (Şekil 1C) ve incelenen nesnenin ortalama yapısal/dinamik özelliklerinin türetilmesine (Şekil 1D) kadar özetlemektedir. Kritik bir parametre, ilgilenilen hücre altı nesneyi görüntülemek için benimsenen zaman çözünürlüğüdür. Bu deneysel değer, ilgilenilen nesnelerin minimum ortalama yer değiştirmesinin ölçüleceği zaman eşiğini belirleyecektir. Bununla birlikte, tercih edilen koşul, ilgilenilen nesnenin yakalanan çerçeve içinde ‘hareketsiz’ göründüğü bir görüntüleme zaman çözünürlüğü ayarlamaktır, yani görüntüleme hızı nedeniyle ortalama olarak deforme olmayan karakteristik bir boyut gösterir. Bu, ilgilenilen nesne membranla çevrili bir hücre altı yapı veya organel ise teknik olarak mümkündür (bu durumda olduğu gibi). Tipik olarak, hücre altı yapılar, sitoplazmadaki izole edilmiş tek moleküllerinkinden (örneğin, GFP21) birkaç büyüklük sırasına göre daha düşük olan lokal difüzyon katsayıları (D, μm 2 / s, bakınız Tablo 1) sergiler. Doğrulama, ilgilenilen organelin yapay olarak hareketsiz hale getirilmesiyle (örneğin, kimyasal fiksasyon yoluyla) gerçekleştirilebilir. Gerçekten de, bu koşul, kullanılan deneysel koşullar altında gerçek organel boyutunu belirlemek için bir referans görevi görebilir (örneğin, uyarma dalga boyu, piksel boyutu, nesnel). Burada, lizozomlar bu prosedür için test organelleri olarak kullanılmasına rağmen, sonuçlar hedef yapıdan bağımsız olarak geçerlidir. Şekil 2A, canlı hücreler üzerinde uygun zamansal çözünürlükte (yani, tipik olarak 100 ms / çerçevenin altında; örneğin, Şekil 2B’deki örnekte 65 ms / çerçeve) gerçekleştirilen bir edinimle birlikte sabit (yani hareketsiz) bir lizozomun görüntüsünü ve çok düşük zamansal çözünürlükte kasıtlı olarak gerçekleştirilen bir edinimi (örneğin, Şekil 2C’deki örnekte 10 s / çerçeve) göstermektedir. ). Her koşul için, dağınık nesnenin boyutu aşağıdaki gibi çıkarılır: i) ImageJ yazılımındaki çizgi aracı tarafından noktanın yoğunluk profili türetilir; ii) yoğunluk profili, tam genişliği yarı maksimum (FWHM) değerinde hesaplamak için bir Gauss fonksiyonu tarafından çizilir ve interpolasyon yapılır ve bu da spot çapının bir tahmini olarak kullanılır (Şekil 2D). Beklendiği ve Şekil 2E’nin grafiğinde gösterildiği gibi, çok yüksek zamansal çözünürlükte (yani, 65 ms / kare) elde edilen kazanım, yukarıda açıklanan standart aracı kullanarak veya i MSD y eksenikesişimini çıkararak, sabit numunede elde edilene yakın bir yapının ortalama boyutunu verir. Bunun yerine, yavaş hızda edinim, görüntüleme sırasındaki doğal yapı dinamikleri nedeniyle yapının görünür boyutunda bir artış sağlar. Optimal olmayan deneysel koşullar altında, çıkarılan yapısal/dinamik bilgi, incelenen nesnenin içsel özelliklerini sadık bir şekilde yansıtmaz. Ana deneysel parametreler seçildikten sonra, hedef hücre içi yapılar için veri kümeleri üretilebilir. Makropinozomlar için, hücrelerin 70 kDa dekstra ile 20 dakikalık inkübasyonundan sonra, etiketli hücre içi yapıların zaman serileri, tedaviden sonra farklı zaman noktalarında, 30 dakikadan yaklaşık 180 dakikaya kadar elde edildi. İlginçtir ki, kaçakçılık sırasında makropinozomların yapısal ve dinamik özelliklerinde kademeli bir değişiklik tespit edilir (Şekil 3; σ02, Dm, α ve N’nin dağılımları soldaki grafiklerde bildirilmiştir). İnsan ticareti sırasında makropinozomların lokal difüzyonunda (Dm) belirgin bir değişiklik tespit edilmemekle birlikte, hem karakteristik boyut (σ02) hem de genel hareket modu (α) zamanla gelişir. Özellikle dikkat edilmesi gereken bir nokta, kaçakçılık sırasında makropinozomların ortalama boyutunda bir azalma gözlenir (Şekil 3A, solda), hareketlerinin alt difüzyon doğasında eşzamanlı bir artışla birlikte (yani, α değerlerinde bir azalma olarak gösterilir, Şekil 3C, sol panel). Ek olarak, her bir kazanımdan makropinozomların sayısı çıkarılmıştır: Şekil 3D, sol panelde bildirilen sonuçlar, zaman içinde makropinozom sayısında bir artış olduğunu açıkça ortaya koymaktadır. Tüm bu sonuçlar beklentilerle iyi bir uyum içindedir, çünkü dekstran etiketli makropinozomların plazma zarında izole edilmiş, büyük zarla kaplı veziküller (aynı zamanda sitoiskelet bileşenleri boyunca hareket için de yetkindir) olarak ortaya çıkması beklenir, ancak yavaş yavaş daha küçük ve rastgele yayılan yapıların büyük bir popülasyonundan oluşan endolizozomal yolla iletişim kurması beklenir. Yukarıda öngörüldüğü gibi, makropinozomların sonuçları, ISG’lerde yapılan benzer ölçümlerin aksinedir (Şekil 3, sağ sütun). İnsülin granülleri, makropinozomlar için gözlemlenen aynı zaman penceresinde iMSD kaynaklı yapısal/dinamik parametrelerin (ve hücre içindeki ortalama sayılarının) zaman içinde gelişen bir eğilimini göstermez. Dahası, σ02, D m ve α karakteristik değerleri, tekrar referans olarak kullanılan lizozomlarınkinden oldukça farklıdır. Bu sonuç, yukarıda öngörüldüğü gibi, granüllerin, herhangi bir zamanda, tüm ISG popülasyonunun ortalama yapısal/dinamik özelliklerinin değişmediği (yani, durağan durum koşulları değişmedikçe, örneğin dış uyaranlar nedeniyle sabit kaldıkları bir ‘durağan durumda’ araştırıldığı fikrini doğrulamaktadır. Şekil 1: Deneysel iş akışı . (A) Hücreler, mikroskobik uygulamalar için uygun hücre kapları üzerinde konfokal deneylerden önce 24 saat (transfeksiyon deneyleri için 48 saat) kaplandı. Hücreler daha sonra ilgilenilen sitoplazmik organeli boyamak için etiketleme yöntemine (protokole bakınız) göre uygun şekilde muamele edildi. (B) Tipik bir konfokal kazanım, canlı bir hücrenin sitoplazmik bir kısmının bir yığın görüntüsünden (hızlandırılmış) oluşur ve etiketli organel dinamiklerinin zaman evrimini tanımlar. (C) Hızlandırılmış film, özel yapım bir Matlab senaryosu ile analiz edilir, ilk önce iMSD eğrilerini (D) çizmek için uzaysal zamansal görüntü korelasyon fonksiyonunu ve Gauss uydurma fonksiyonunu ve görüntülenen organellerin yapısal dinamik parametrelerini tanımlayan ilgili ekstrakte edilmiş uydurma parametrelerini hesaplar. Kısaltmalar: iMSD = görüntüleme kaynaklı ortalama kare yer değiştirme; STICS = uzaysal zamansal görüntü korelasyon spektroskopisi; α = anormal difüzyon katsayısı; Dm = yerel difüzyon; σ2(τ) = varyans. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Uygun deneysel parametreler . (A) Sabit bir numunedeki lekeli lizozomların örnek görüntüsü. Ölçek çubuğu = 2 μm. (B) Uygun parametrelerle elde edilen canlı bir hücredeki lekeli lizozomların görüntü yığınının ilk karesi. Zamansal çözünürlük: 65 ms/kare. Ölçek çubuğu = 2 μm. (C) Canlı bir hücredeki lekeli lizozomların görüntü yığınının düşük hızda elde edilen ilk karesi: görüntüleme sırasında organel hareketine bağlı görünür lizozom boyutunun yapay deformasyonu görülebilir. Zamansal çözünürlük: 10 s/kare. Ölçek çubuğu = 2 μm. (D) (A), (B) ve (C) mavi ROI’sinde görüntülenen lizozomlar için boyut hesaplama örneği. Mavi çizgi boyunca yoğunluk profili, FWHM’yi, yani spot büyüklüğünün bir tahminini almak için bir Gauss fonksiyonu ile donatıldı. Her bağlantı parçası için FWHM değerleri raporlanır. (E) Görüntülenen tüm lizozomlar (siyah kare, ortalama değer ve standart sapma) için panel (D)’de açıklanan görüntü analizi ile elde edilen boyut değerlerinin, mavi ROI (mavi üçgen) içine alınmış lizozomlar için elde edilen ve iMSD analizi (kırmızı daire) ile alınan boyut değerlerinin grafiksel gösterimi. Bu rakam 22’den. Kısaltmalar: ROI = ilgilenilen bölge; FWHM = maksimum yarıda tam genişlik; iMSD = görüntüleme kaynaklı ortalama kare yer değiştirme. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Etiketli organellerin zamansal evrimi . (A) 10 dakikalık bir zaman penceresinde gerçekleştirilen edinimlerde ölçülen değerlerin ortalaması olarak temsil edilen iMSD ile ekstrakte edilen boyut değerlerinin grafikleri ile sonraki edinimlerin zaman ilerlemesi. Solda, makropinozomların ortalama boyutunda (siyah daireler) ilerleyici azalma ve sağda, insülin salgı granüllerinin (siyah kareler) lizozomlara kıyasla zaman değişmez boyutu, standart sapma (kesikli kırmızı çizgiler) ± ortalama boyut değeri (daha kalın kırmızı çizgi) olarak temsil edilir. (B) ve (C) iMSD analizi ile ekstrakte edilen makropinozomlar (solda) ve insülin granülleri (sağda) için Dm ve α katsayılarının zaman ilerlemesi. (D) Elde edilen her hızlandırılmış filmin ilk karesinde ölçülen etiketli makropinozomların ve insülin granüllerinin sayılarının zaman evrimi. Kısaltmalar: iMSD = görüntüleme kaynaklı ortalama kare yer değiştirme; α = anormal difüzyon katsayısı; Dm = yerel difüzyon, N = sayı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Organel Etiketleme Hücre Hattı Boyut (nm) Dm ( × 10-3 μm2/s) α N Ref. Erken Endozom (EE) CellLight Erken Endozom GFP Hela 395±74 3.0±2.4 1.02±0.20 40 10 Geç Endozom (LE) CellLight Geç Endozom GFP Hela 693±102 15.4±10.6 0.57±0.16 58 10 Lizozom (LY) LysoTracker DND-99 Hela 471±76 15.3±9.0 0.49±0.13 143 10, 14 Caveola (CAV) Kaveolin-EGFP Hela 405±49 3.1±1.8 1.00±0.22 15 10 Clathrin Kaplamalı Vezcicle (CCV) Transferrin-Alexa 488 Hela 513±62 16.2±9.9 0.48±0.17 33 10 İnsülin Granülü (IG) C-peptid-EGFP INS-1E 335±56 3.0±1.7 0.70±0.14 107 11 Erken Makropinozom (EMCR) Floresein-Dextran 70 kDa Hela 979±423 8.3±9 0.79±0.27 36 10 Orta Makropinozom (IMCR) Floresein-Dextran 70 kDa Hela 702±180 13.7±19.9 0.60±0.38 29 10 Geç Makropinozom (LMCR) Floresein-Dextran 70 kDa Hela 592±127 5.8±4.7 0.39±0.21 21 10 Tablo 1: Yapısal ve dinamik iMSD ile ayıklanmış parametreler. Tablo, farklı organeller için ölçülenboyut, D m ve α katsayısı değerlerini göstererek, etiketleme stratejilerini, kullanılan hücre hattını ve analiz edilen edinimlerin sayısını belirtir. Değerler ortalama ± standart sapma olarak raporlanır. Kısaltmalar: iMSD = görüntüleme kaynaklı ortalama kare yer değiştirme; α = anormal difüzyon katsayısı; Dm = yerel difüzyon, N = sayı; GFP = yeşil floresan protein; EGFP = gelişmiş yeşil floresan proteini. Ek Dosya 1: iMSD iz türetme ve analizi ile ilgili ayrıntılar. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. Destekleyici Dosya 1: Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

iMSD’nin özellikleri ve avantajları, benzer bilgileri almak için mevcut tekniklerle karşılaştırıldığında belirgindir. Yapısal bilgi için tercih edilen seçenek transmisyon elektron mikroskobu (TEM) analizidir. Bu yöntemle, moleküler çözünürlükte ve hatta ötesindeki ultrayapısal detaylar, hücre altı nanoyapılar için bile elde edilebilir. Bununla birlikte, TEM’in kendine özgü mekansal çözünürlüğü, burada ilgi çekici olan zamansal boyuttaki bilgilerin pahasına elde edilir. Bunu telafi etmek için, canlı hücre görüntüleme teknolojilerindeki son gelişmeler özellikle ilgi çekicidir. Bunlar arasında daha yüksek performansa sahip yeni floresan işaretleyiciler (örneğin, parlaklık ve fotostabilite), optimize edilmiş etiketleme prosedürleri ve daha hassas dedektörler bulunur. Ek olarak, hem yapısal (örneğin, yerel görüntü korelasyon spektroskopisinin fazör tabanlı analizi ile ‘boyut’, PLICS23, Sayı ve Parlaklık analizi 24 ile toplama/oligomerizasyon) hem de dinamik (örneğin, tek parçacık izleme ile difüzyon yasası, yani (SPT) 25,26,27,28 ) hücre altı ölçekte parametreler. SPT yöntemi, nesne yörüngesine ve MSD’sine doğrudan erişim sağlar. Bununla birlikte, dezavantajı, probun düşük yoğunluğuna ve çok parlak etiketlere ve istatistiksel kriterleri karşılamak için ölçülecek birçok tek nesneli yörüngeye duyulan ihtiyaçtır. Ölçümün zamansal çözünürlüğü ile ilgili olarak, inorganik, fotoğraflanabilir problar (örneğin, kuantum noktaları veya metal nanopartiküller) SPT performansını artırabilir, ancak karmaşık üretim ve etiketleme prosedürleri pahasına.

Bu standartlarla karşılaştırıldığında, burada açıklanan iMSD yöntemi bazı önemli avantajlar göstermektedir. İlk olarak, bu yaklaşım genetik olarak kodlanmış floresan proteinler (örneğin, ISG’lere uygulama) gibi nispeten loş floresan etiketlerle birlikte kullanılabilir. Böylece, SPT ile karşılaştırıldığında,8 gereken daha düşük foton miktarı nedeniyle daha yüksek bir zamansal çözünürlük elde edilir (aynı etiket kullanılarak). İkincisi, iMSD yöntemi sadece zamansal çözünürlükle sınırlıdır, kırınım ile sınırlandırılmaz. Aslında, kullanılan kırınım sınırlı optik kuruluma rağmen, STICS29 kullanılarak moleküler akışlar için daha önce gösterildiği gibi, kırınım sınırının altında bile ortalama moleküler yer değiştirmeler ölçülebilir. Yer değiştirmelerin ölçümündeki gerçek çözünürlük, korelasyon fonksiyonunun ne kadar doğru (sinyalden gürültüye kadar) ölçülebileceğine bağlıdır, böylece neden kırınım ile sınırlı olmadığını açıklar. Bu nedenle, ölçülebilen minimum yer değiştirmenin, ilgilenilen nesnenin difüzyonuna ve görüntüleme kurulumunun zamansal çözünürlüğüne bağlı olduğu açıktır.

Bu bağlamda, makropinozomlar veya insülin granülleri gibi hücre altı nanoyapılara lazer tarama mikroskobu ile uygulamanın optimal olduğunu düşünmek önemlidir: mevcut tarama hızı, ilgilenilen nesnenin dinamiklerinden önemli ölçüde daha yüksektir. Böyle bir durumda, edinim sırasında nesnelerin hareketi ihmal edilebilir düzeydedir ve korelasyon fonksiyonu bir Gauss fonksiyonu ile yaklaştırılabilir. Son olarak, iMSD yaklaşımı, sistem kalibrasyonuna gerek kalmadan raster taramasına veya geniş alan kamera tabanlı görüntülemeye dayalı çok çeşitli ticari optik mikroskopi kurulumlarına kolayca uygulanabilir (yalnızca partikül boyutunun doğru bir tahmininin elde edilmesi gerektiğinde gereklidir). Yöntemin çalışması için önemli bir parametre, uygun uzamsal örneklemedir. Genel bir kural olarak, uygun algoritmanın tatmin edici bir yakınsamasına ulaşmak için, görüntüleme için ilgilenilen bölgenin minimum büyüklüğü, ilginin maksimum yer değiştirmesinden en az 3 kat daha büyük olmalıdır.

Sonuç olarak, iMSD yöntemi sadece hızlı elde etmek için donanımlı bir mikroskop gerektirir. İlgilenilen yapı, genetik olarak kodlanmış veya organik floroforla etiketlenebilir, böylece çok kanallı görüntüleme sağlanır. Çapraz iMSD analizinin yakın gelecekte hücre altı nanoyapıların alt popülasyonlarını seçmek ve hücre içindeki etkileşimlerini ve birlikte difüzyonlarını ortaya çıkarmak için kullanılacağı, ikincisinin hücresel biyofizikte sıcak bir konu olduğu öngörülmektedir. iMSD analizi ile herhangi bir ayrıntı kaybolursa, bu kesinlikle dinamik hücre altı nanoyapılar içindeki büyük miktarda moleküler bilgi ile ilgilidir. Bu tür bilgiler, zayıf zamansal çözünürlük nedeniyle ölçüm sırasında kaçınılmaz olarak ortalamasını alır. Bununla birlikte, teorik olarak, yeterli elde etme hızlarına ulaşılabilmesi koşuluyla, moleküler bilgi alma olasılığı nedeniyle teknik bir sınır yoktur8. Dedektör hızı/duyarlılığı ve görüntüleme teknolojilerindeki sürekli gelişmeler nedeniyle, tüm hücre altı bölmesi ve moleküler bileşenleri hakkındaki bilgilerin tek bir veri kümesinden çıkarılması öngörülmektedir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Avrupa Birliği’nin Horizon 2020 Araştırma ve İnovasyon Programı (hibe anlaşması No 866127, proje CAPTUR3D) kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi’nden (ERC) finansman almıştır.

Materials

100x Penicillin-Streptomycin-Glutamine Gibco 10378-016 Cell medium supplement
C-peptide-EGFP Plasmid
DMEM High Glucose Gibco 31053028 Cell medium (HeLa)
FBS Gibco 10082147 Cell medium supplement
Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa Sigma Aldrich 46945-100MG-F Reagent
HeLa ATCC CCL-61 Cell Line
Lipofectamine 2000 TermoFisher 11668019 Trasfection reagent
Lysotracker Red DND-99 Gibco L7528 Reagent
Matlab MathWork Software
Microscope-suitable cell dishes Willco GWSt-3522 Petri dishes
Olympus FV1000 Olympus Japan Confocal microscope
RPMI 1640 Gibco 11835063 Cell medium (INS-1E)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murphy, J. E., Padilla, B. E., Hasdemir, B., Cottrell, G. S., Bunnett, N. W. Endosomes: a legitimate platform for the signaling train. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17615-17622 (2009).
  2. Mosesson, Y., Mills, G. B., Yarden, Y. Derailed endocytosis: an emerging feature of cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (11), 835-850 (2008).
  3. Mellman, I., Yarden, Y. Endocytosis and cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (12), 016949 (2013).
  4. Di Fiore, P. P. Endocytosis, signaling and cancer, much more than meets the eye. Preface. Molecular Oncology. 3 (4), 273-279 (2009).
  5. Bogan, J. S., Xu, Y., Hao, M. Cholesterol accumulation increases insulin granule size and impairs membrane trafficking. Traffic. 13 (11), 1466-1480 (2012).
  6. Ballabio, A., Gieselmann, V. Lysosomal disorders: From storage to cellular damage. Biochimica et Biophysica Acta. 1793 (4), 684-696 (2009).
  7. Hu, Y. -. B., Dammer, E. B., Ren, R. -. J., Wang, G. The endosomal-lysosomal system: from acidification and cargo sorting to neurodegeneration. Translational Neurodegeneration. 4, 18 (2015).
  8. Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. Spatiotemporal fluctuation analysis: a powerful tool for the future nanoscopy of molecular processes. Biophysical Journal. 111 (4), 679-685 (2016).
  9. Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. Fast spatiotemporal correlation spectroscopy to determine protein lateral diffusion laws in live cell membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12307-12312 (2013).
  10. Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. From fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51994 (2014).
  11. Digiacomo, L., et al. Dynamic fingerprinting of sub-cellular nanostructures by image mean square displacement analysis. Scientific Reports. 7 (1), 14836 (2017).
  12. Durso, W., et al. Lysosome dynamic properties during neuronal stem cell differentiation studied by spatiotemporal fluctuation spectroscopy and organelle tracking. International Journal of Molecular Sciences. 21 (9), 3397 (2020).
  13. Ferri, G., et al. Insulin secretory granules labelled with phogrin-fluorescent proteins show alterations in size, mobility and responsiveness to glucose stimulation in living β-cells. Scientific Reports. 9 (1), 2890 (2019).
  14. Durso, W., D’Autilia, F., Amodeo, R., Marchetti, L., Cardarelli, F. Probing labeling-induced lysosome alterations in living cells by imaging-derived mean squared displacement analysis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (4), 2704-2709 (2018).
  15. Digiacomo, L., Digman, M. A., Gratton, E., Caracciolo, G. Development of an image Mean Square Displacement (iMSD)-based method as a novel approach to study the intracellular trafficking of nanoparticles. Acta Biomaterialia. 42, 189-198 (2016).
  16. Swanson, J. A., Watts, C. Macropinocytosis. Trends in Cell Biology. 5 (11), 424-428 (1995).
  17. Jones, A. T. Macropinocytosis: searching for an endocytic identity and role in the uptake of cell penetrating peptides. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11 (4), 670-684 (2007).
  18. Falcone, S., et al. Macropinocytosis: regulated coordination of endocytic and exocytic membrane traffic events. Journal of Cell Science. 119, 4758-4769 (2006).
  19. Kerr, M. C., et al. Visualisation of macropinosome maturation by the recruitment of sorting nexins. Journal of Cell Science. 119, 3967-3980 (2006).
  20. Rorsman, P., Renstrom, E. Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells. Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).
  21. Di Rienzo, C., Piazza, V., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. Probing short-range protein Brownian motion in the cytoplasm of living cells. Nature Communications. 5 (1), 5891 (2014).
  22. Ferri, G., et al. Time-lapse confocal imaging datasets to assess structural and dynamic properties of subcellular nanostructures. Scientific Data. 5 (1), 180191 (2018).
  23. Scipioni, L., Gratton, E., Diaspro, A., Lanzanò, L. Phasor analysis of local ICS detects heterogeneity in size and number of intracellular vesicles. Biophysical Journal. 111 (3), 619-629 (2016).
  24. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
  25. Li, C. H., Bai, L., Li, D. D., Xia, S., Xu, T. Dynamic tracking and mobility analysis of single GLUT4 storage vesicle in live 3T3-L1 cells. Cell Research. 14 (6), 480-486 (2004).
  26. Donovan, K. W., Bretscher, A. Tracking individual secretory vesicles during exocytosis reveals an ordered and regulated process. Journal of Cell Biology. 210 (2), 181-189 (2015).
  27. Westphal, V., et al. Video-rate far-field optical nanoscopy dissects synaptic vesicle movement. Science. 320 (5873), 246-249 (2008).
  28. Tabei, S. M. A., et al. Intracellular transport of insulin granules is a subordinated random walk. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 4911-4916 (2013).
  29. Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophysical Journal. 88 (5), 3601-3614 (2005).

Tags

Trafficking Subcellular NanostructuresSpatiotemporal Fluctuation SpectroscopyImaging The Right Mean Square DisplacementSubcellular Nano-structuresCell LabelingTime-lapsed Series AcquisitionFluorescence ImagingEGFPMacropinesomes

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ferri, G., Azzarello, F., D’Autilia, F., Cardarelli, F. Probing Structural and Dynamic Properties of Trafficking Subcellular Nanostructures by Spatiotemporal Fluctuation Spectroscopy. J. Vis. Exp. (174), e62790, doi:10.3791/62790 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image