A análise de deslocamento quadrado médio (iMSD) derivada de imagem é aplicada a macropinossos para destacar sua natureza intrínseca em termos de propriedades estruturais e dinâmicas. Os macropinossomos são então comparados aos grânulos secretos de insulina (ISGs) como referência para estruturas subcelulares com propriedades estruturais/dinâmicas médias invariantes.
O deslocamento quadrado médio derivado da imagem (iMSD) é usado para abordar as propriedades estruturais e dinâmicas das nanoestruturas subcelulares, como vesículas envolvidas no tráfico endo/exotótico de solútes e biomoléculas. O iMSD conta com imagens padrão de lapso de tempo, é compatível com qualquer configuração óptica e não precisa se debruçar sobre objetos únicos para extrair trajetórias. A partir de cada traço iMSD, um trigêmeo único de parâmetros estruturais e dinâmicos médios (ou seja, tamanho, difusividade local, coeficiente anômulo) é calculado e combinado para construir a “assinatura iMSD” da nanoestrutura em estudo.
A potência dessa abordagem é comprovada aqui com o caso exemplar de macropinossomos. Essas vesículas evoluem no tempo, alterando seu tamanho médio, número e propriedades dinâmicas passando dos estágios iniciais para o final do tráfico intracelular. Como controle, os grânulos secretores de insulina (ISGs) são usados como referência para estruturas subcelulares que vivem em um estado estacionário no qual as propriedades estruturais e dinâmicas médias de toda a população de objetos são invariantes no tempo. A análise do iMSD destaca essas características peculiares quantitativamente e abre caminho para aplicações semelhantes no nível subcelular, tanto nos estados fisiológicos quanto patológicos.
As nanoestruturas subcelulares (por exemplo, vesículas endocíticas/secretas, organelas) desempenham um papel fundamental na regulação de sinalizaçãocelular 1. A sintonia adequada de suas características estruturais (por exemplo, tamanho) e/ou dinâmica (por exemplo, difusividade) determina como a célula responde a estímulos internos ou externos 2,3,4. Com base nessas evidências, não é de surpreender que alterações dessas características sejam encontradas em muitas condições patológicas. Exemplos englobam o papel da endocitose mal regulamentada no câncer 2,3, as alterações estruturais e dinâmicas encontradas no nível de ISGs em células β expostas às condições de Diabetes Tipo 25, a desregulamentação das propriedades estruturais e de transporte lysosomal na leucodistrofia de células globoid ou lipidose de galactosylceramida6, e disfuncionalidades na via endo-lyosomal em distúrbios neurodegenerativos (por exemplo, doença de Alzheimer)7.
Nesse contexto, pesquisadores provaram recentemente que o desempenho dos métodos de microscopia óptica padrão pode ser aprimorado, afinando adequadamente a resolução de amostragem espacial e temporal8. Isso, por sua vez, pode fornecer mais informações sobre processos biológicos de relevância. Na prática, isso é possível por um algoritmo de análise de flutuação espiotemporal, que extrai simultaneamente as propriedades estruturais e dinâmicas médias de objetos difundidores diretamente da pilha padrão de imagens de microscopia óptica sem qualquer necessidade de conhecimento preliminar sobre o objeto biológico de interesse e extração de trajetórias de um único objeto. Todas essas informações estão incluídas em uma única saída do método: um traço iMSD9 (detalhes sobre a derivação e análise do traço iMSD são fornecidos no Arquivo Suplementar 1).
O protocolo experimental resultante consiste em alguns passos. Em primeiro lugar, a imagem da região de interesse é realizada em alta resolução temporal. Em seguida, as funções médias de correlação espaço-temporal são calculadas a partir da pilha de imagens. Finalmente, pelo encaixe gaussiano da série de funções de correlação, a “lei de difusão” média é obtida diretamente a partir de imagens e analisada para reconhecer o modo de difusão do objeto. O potencial do método já foi comprovado para uma variedade de objetos biológicos, variando de moléculas a nanopartículas e até organelas/estruturas subcelulares inteiras 9,10,11,12,13,14,15.
Este artigo relata a aplicação do IMSD aos macropinossmos para destacar sua natureza intrínseca e irreversível em termos de suas propriedades estruturais e dinâmicas médias (ou seja, em todo o nível populacional). Além disso, essas vesículas endocíticas são comparadas aos ISGs como referência para estruturas subcelulares em um “estado estacionário”, ou seja, um estado em que as propriedades estruturais/dinâmicas médias de toda a população de grânulos permanecem constantes a qualquer momento. A macropinocistose define uma série de eventos iniciados pela extensa reorganização (ou babados) da membrana plasmática para formar uma estrutura macropinocítica externa que é então internalizada16. Os macropinossos em estágio inicial formados são muito semelhantes aos fagosmosos. Ao mesmo tempo, eles podem ser distinguidos de outras formas de vesículas dotícticas devido ao seu tamanho grande característico, heterogeneidade morfológica e falta de estruturas de proteína-revestimento.
Ensaios bioquímicos revelaram que, após a internalização, os macropinosos são progressivamente enriquecidos com marcadores proteicos de outras vias endocíticas, por sua vez, sugerindo que suas identidades estão mudando continuamente durante o tráfico17. Usando anticorpos contra marcadores conhecidos da via endossomal, foi demonstrado que os macropinossos adotam progressivamente características endossomais clássicas: diminuem de tamanho, desenvolvem-se em estruturas endócticas tardias (por exemplo, lysosomes), ou eventualmente perdem sua identidade através da recuperação mediada por membrana de marcadores moleculares específicos (por exemplo, classificando nexins)18,19 . O cenário geral é que cada macropinosome dentro da célula muda irreversivelmente sua identidade estrutural e dinâmica (assim como molecular) durante o tráfico da membrana plasmática para seu destino intracelular final. Como resultado, as propriedades estruturais/dinâmicas/moleculares de toda a população de macropinossomos também estão mudando ao longo do mesmo caminho temporal. Sendo intrinsecamente sensível às propriedades médias de toda a população de objetos observados, o método iMSD retrata quantitativamente a “natureza em evolução” pela quantificação dos principais parâmetros médios, ou seja, a difusividade local e coeficiente anômulo (propriedades dinâmicas) e o tamanho médio dos macropinosos (propriedade estrutural) em qualquer estágio de seu tráfico intracelular.
Para comparação, medidas semelhantes foram realizadas em uma conhecida estrutura intracelular fechada por membrana, o ISG, em um modelo de células β. Assim como os macropinossomos, a regulação das propriedades estruturais e dinâmicas dos ISGs, desde sua gênese na Rede Trans Golgi (TGN) até sua exocitese na membrana plasmática, é fundamental para a execução adequada da função ISG20. No entanto, ao contrário dos macropinossomos, os ISGs vivem em um “estado estacionário” no qual, a qualquer momento, todos os estágios funcionais/estruturais/moleculares da vida útil do ISG estão simultaneamente presentes dentro da célula, e cada um é representado por uma subpopulação específica de ISGs. Isso significa que, embora cada grânulo evolua irreversivelmente da biogênese para a secreção, espera-se que as propriedades estruturais/dinâmicas médias de toda a população de grânulos permaneçam constantes a qualquer momento (a menos que as condições estacionárias do estado sejam alteradas, por exemplo, por estímulos externos como glicose, colesterol e citocinas13). Isso é confirmado pela análise do iMSD.
As propriedades e vantagens do iMSD são evidentes quando comparadas com as técnicas disponíveis para recuperar informações análogas. Para informações estruturais, a escolha preferida é a análise de microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Por este método, detalhes ultraestruturais em resolução molecular e até além podem ser recuperados, mesmo para nanoestruturas subcelulares. No entanto, a peculiar resolução espacial do TEM é alcançada em detrimento das informações na dimensão temporal, o que é de interesse aqui. Para compensar isso, os recentes avanços nas tecnologias de imagem de células vivas são de particular interesse. Estes incluem novos marcadores fluorescentes com desempenhos aumentados (por exemplo, brilho e fotoestabilidade), procedimentos de rotulagem otimizados e detectores mais sensíveis. Além disso, ferramentas analíticas estão disponíveis para abordar tanto estruturalmente (por exemplo, ‘tamanho’ por análise baseada em phasor de espectroscopia de correlação de imagem local, PLICS23, agregação/oligomerização pela análise Number&Brightness24) e dinâmica (por exemplo, lei de difusão por rastreamento de partículas únicas, ou seja, (SPT)25,26,27,28 ) parâmetros na escala subcelular. O método SPT permite acesso direto à trajetória do objeto e ao seu MSD. No entanto, a desvantagem é a necessidade de uma baixa densidade da sonda e rótulos muito brilhantes e muitas trajetórias de objeto único a serem medidas para satisfazer critérios estatísticos. Com relação à resolução temporal da medição, sondas inorgânicas e fotostíveis (por exemplo, pontos quânticos ou nanopartículas metálicas) podem aumentar o desempenho do SPT, mas em detrimento de procedimentos complexos de produção e rotulagem.
Em comparação com esses padrões, o método iMSD descrito aqui mostra algumas vantagens fundamentais. Primeiro, essa abordagem pode ser usada em conjunto com tags fluorescentes relativamente fracas, como proteínas fluorescentes geneticamente codificadas (por exemplo, a aplicação aos ISGs). Assim, em comparação com o SPT, é alcançada uma maior resolução temporal (utilizando o mesmo rótulo) devido à menor quantidade de fótonsnecessários 8. Em segundo lugar, o método iMSD é limitado apenas pela resolução temporal, mas não pela difração. De fato, apesar da configuração óptica limitada à difração utilizada, deslocamentos moleculares médios mesmo abaixo do limite de difração podem ser medidos, como já demonstrado para fluxos moleculares usando STICS29. A resolução real na medição dos deslocamentos depende de quão precisamente (em termos de sinal para ruído) a função de correlação pode ser medida, explicando assim por que não é limitada pela difração. Assim, parece claro que o deslocamento mínimo que pode ser medido depende da difusividade do objeto de interesse e da resolução temporal da configuração da imagem.
Nesse sentido, é importante considerar que a aplicação a nanoestruturas subcelulares, como macropinossomos ou grânulos de insulina, com um microscópio de varredura a laser é ótima: a velocidade de digitalização disponível é significativamente maior do que a dinâmica do objeto de interesse. Nesse caso, o movimento dos objetos durante a aquisição é insignificante, e a função de correlação pode ser aproximada por uma função gaussiana. Finalmente, a abordagem iMSD pode ser facilmente aplicada a uma ampla gama de configurações comerciais de microscopia óptica com base em varredura raster ou imagens baseadas em câmeras de campo largo, sem necessidade de calibração do sistema (necessário apenas se uma estimativa precisa do tamanho das partículas precisar ser alcançada). Um parâmetro importante para o método funcionar é a amostragem espacial adequada. Como regra geral, para alcançar uma convergência satisfatória do algoritmo de montagem, o tamanho mínimo da região de interesse para imagem deve ser pelo menos 3 vezes maior do que o deslocamento máximo de juros.
Em conclusão, o método iMSD requer apenas um microscópio equipado para aquisição rápida. A estrutura de interesse pode ser marcada para qualquer fluoróforo geneticamente codificado ou orgânico, permitindo assim imagens multicanais. Prevê-se que a análise cross-iMSD será usada em um futuro próximo para selecionar subpopulações de nanoestruturas subcelulares e revelar suas interações e co-difusão dentro da célula, sendo esta última um tópico quente na biofísica celular. Se algum detalhe for perdido pela análise do iMSD, isso certamente está relacionado com a grande quantidade de informações moleculares dentro de nanoestruturas subcelulares dinâmicas. Essas informações são inevitavelmente mediadas durante a medição devido à má resolução temporal. Teoricamente, porém, não há limite técnico devido à possibilidade de recuperação de informações moleculares, desde que velocidades de aquisição suficientes possam ser alcançadas8. Devido às melhorias contínuas na velocidade/sensibilidade do detector e tecnologias de imagem, prevê-se que informações sobre todo o compartimento subcelular e seus constituintes moleculares serão extraídas de um único conjunto de dados.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho recebeu financiamento do Conselho Europeu de Pesquisa (ERC) no âmbito do Programa de Pesquisa e Inovação Horizon 2020 da União Europeia (acordo de concessão no 866127, projeto CAPTUR3D).
100x Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378-016 | Cell medium supplement |
C-peptide-EGFP | Plasmid | ||
DMEM High Glucose | Gibco | 31053028 | Cell medium (HeLa) |
FBS | Gibco | 10082147 | Cell medium supplement |
Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma Aldrich | 46945-100MG-F | Reagent |
HeLa | ATCC | CCL-61 | Cell Line |
Lipofectamine 2000 | TermoFisher | 11668019 | Trasfection reagent |
Lysotracker Red DND-99 | Gibco | L7528 | Reagent |
Matlab | MathWork | Software | |
Microscope-suitable cell dishes | Willco | GWSt-3522 | Petri dishes |
Olympus FV1000 | Olympus Japan | Confocal microscope | |
RPMI 1640 | Gibco | 11835063 | Cell medium (INS-1E) |