イメージングによる二乗平均変位(iMSD)解析をマクロピノソームに適用し、構造的および動的特性の観点から、マクロピノソームの固有の時間進化的性質を強調します。次いで、マクロピノソームは、時間不変の平均構造的/動的特性を有する細胞下構造の基準として、インスリン分泌顆粒(ISG)と比較される。
イメージング由来の二乗平均変位(iMSD)は、溶質および生体分子のエンド/エキソサイトーシス輸送に関与する小胞などの細胞内ナノ構造の構造的および動的特性に対処するために使用される。iMSDは、標準のタイムラプスイメージングに依存しており、あらゆる光学セットアップと互換性があり、軌道を抽出するために単一のオブジェクトにこだわる必要はありません。各iMSDトレースから、平均構造パラメータおよび動的パラメータ(すなわち、サイズ、局所拡散性、異常係数)の一意のトリプレットが計算され、組み合わされて、研究中のナノ構造の「iMSDシグネチャ」が構築される。
このアプローチの効力は、マクロピノソームの例示的な症例でここで証明される。これらの小胞は時間とともに進化し、細胞内トラフィッキングの初期段階から後期にかけて、その平均サイズ、数、および動的特性を変化させる。対照として、インスリン分泌顆粒(ISG)は、物体の全集団の平均構造的および動的特性が時間的に不変である静止状態で生きる細胞下構造の基準として使用される。iMSD分析は、これらの特異な特徴を定量的に強調し、生理学的および病理学的状態の両方で、細胞内レベルで同様の応用への道を開く。
細胞内ナノ構造(例えば、エンドサイト/分泌小胞、細胞小器官)は、細胞シグナル伝達調節において極めて重要な役割を果たしている1。それらの構造的(例えば、サイズ)および/または動的(例えば、拡散性)特性の適切な同調は、細胞が内部または外部刺激にどのように応答するかを決定する2、3、4。この証拠に基づいて、これらの特性の変化が多くの病理学的状態において見出されることは驚くべきことではない。実施例は、癌における誤った調節エンドサイトーシスの役割2、3、2型糖尿病状態5に曝露されたβ細胞におけるISGのレベルで見出される構造的および動的変化、グロボイド細胞白質ジストロフィーまたはガラクトシルセラミドリピドーシス6におけるリソソーム構造および輸送特性の誤った調節、ならびに神経変性障害(例えば、アルツハイマー病)におけるエンドリソソーム経路における機能不全を包含する7。
この文脈で、研究者は最近、標準的な光学顕微鏡法の性能が空間的および時間的サンプリング分解能を適切に調整することによって強化できることを証明しました8。これは、今度は、関連性のある生物学的プロセスへのさらなる洞察を提供するかもしれない。実際には、これは時空間変動解析のアルゴリズムによって可能になり、目的の生物学的物体に関する予備的な知識や単一物体の軌道の抽出を必要とせずに、光学顕微鏡画像の標準スタックから直接拡散物体の平均構造的および動的特性を同時に抽出する。これらの情報はすべて、このメソッドの 1 つの出力 (iMSD トレース9) に囲まれています (iMSD トレースの導出と分析の詳細については、 補足ファイル 1 を参照してください)。
得られた実験プロトコールは、いくつかのステップからなる。まず、関心領域の撮像は、高い時間分解能で行われる。次に、平均空間時間相関関数が画像のスタックから計算されます。最後に、一連の相関関数のガウスフィッティングによって、平均「拡散法則」が画像から直接得られ、物体拡散モードを認識するために分析される。この方法の可能性は、分子からナノ粒子、さらには細胞内小器官/構造全体に至るまで、さまざまな生物学的物体についてすでに証明されています9、10、11、12、13、14、15。
本稿では、iMSDをマクロピノソームに適用し、マクロピノソームの内在的で不可逆的な時間進化の性質を、その平均的(すなわち、全集団レベルで)の構造的および動的特性の観点から強調することを報告している。さらに、これらのエンドサイトーシス小胞は、「静止状態」、すなわち顆粒の全集団の平均構造的/動的特性が任意の時点で一定に保たれる状態における細胞下構造の基準としてISGと比較される。マクロピノサイトーシスは、原形質膜の広範な再編成(またはフリル)によって開始され、外部マクロピノサイト構造を形成し、その後内在化される一連の事象を定義する16。形成された初期段階のマクロピノソームは、ファゴソームと非常によく似ている。同時に、それらは、その特徴的な大きなサイズ、形態学的不均一性、およびタンパク質コート構造の欠如のために、他の形態のエンドサイトーシス小胞と区別することができる。
生化学的アッセイにより、マクロピノソームはインターナリゼーション時に他のエンドサイトーシス経路のタンパク質マーカーで徐々に濃縮されることが明らかになり、そのアイデンティティがトラフィッキング中に継続的に変化していることが示唆された17。エンドソーム経路の既知のマーカーに対する抗体を用いて、マクロピノソームは古典的なエンドソームの特徴を徐々に採用することが実証された:それらはサイズが減少し、後期エンドサイト構造(例えば、リソソーム)に発達し、または最終的に特定の分子マーカーの膜媒介性検索(例えば、ネキシンの選別)を介して同一性を失う18,19。.全体的なシナリオは、細胞内のすべてのマクロピノソームが、原形質膜から最終的な細胞内運命へのトラフィッキング中に、その構造的および動的(ならびに分子的)同一性を不可逆的に変化させることである。その結果、マクロピノソームの全集団の構造的/動的/分子的特性も同じ時間的経路に沿って変化している。iMSD法は、観測された物体の集団全体の平均特性に本質的に敏感であるため、重要な平均パラメータ、すなわち局所拡散性および異常係数(動的特性)およびマクロピノソームの平均サイズ(構造特性)を細胞内輸送の任意の段階で定量化することによって、「進化する性質」を定量的に描写する。
比較のために、β細胞のモデルにおいて、周知の細胞内膜封入構造であるISGについて同様の測定を行った。マクロピノソームと同様に、トランスゴルジネットワーク(TGN)での起源から原形質膜でのエキソサイトーシスまで、ISGの構造的および動的特性の調節は、ISG機能20の適切な実行にとって極めて重要である。しかし、マクロピノソームとは異なり、ISGは、ISGの寿命のすべての機能的/構造的/分子的段階がいつでも細胞内に同時に存在し、それぞれがISGの特定の亜集団によって表される「静止状態」に生きる。これは、すべての顆粒が生合成から分泌まで不可逆的に進化するが、顆粒の全集団の平均構造的/動的特性は、(例えば、グルコース、コレステロール、サイトカインなどの外部刺激によって静止状態条件が変化しない限り)いつでも一定に保たれると予想されることを意味する13。これはiMSD分析により確認される。
iMSD の特性と利点は、類似の情報を取得するために使用できる手法と比較すると明らかです。構造情報の場合、好ましい選択は透過型電子顕微鏡(TEM)分析である。この方法により、細胞内ナノ構造であっても、分子分解能で、さらにはそれ以上の超微細構造の詳細を取得することができます。それにもかかわらず、TEMの特異な空間分解能は、時間的次元の情報を犠牲にして達成され、これはここで興味深い。これを補うために、生細胞イメージング技術における最近の進歩が特に注目されている。これらには、性能が向上した新しい蛍光マーカー(輝度や光安定性など)、最適化された標識手順、より高感度の検出器が含まれます。さらに、構造(例えば、局所画像相関分光法、PLICS 23、Number&Brightness分析24による凝集/オリゴマー化のフェーザーベースの分析による「サイズ」)および動的(例えば、単一粒子追跡による拡散法則、すなわち、(SPT)25、26、27、28の両方に対処するために、分析ツールが利用可能である。)パラメータを細胞内スケールで示す。SPT メソッドを使用すると、オブジェクトの軌道とその MSD に直接アクセスできます。しかしながら、欠点は、統計的基準を満たすために測定される低密度のプローブおよび非常に明るいラベルおよび多くの単一物体軌道の必要性である。測定の時間分解能に関して、無機の光受容性プローブ(例えば、量子ドットまたは金属ナノ粒子)は、SPT性能を増加させることができるが、複雑な製造および標識手順を犠牲にする。
これらの標準と比較して、ここで説明するiMSD法は、いくつかの重要な利点を示しています。第1に、このアプローチは、遺伝的にコードされた蛍光タンパク質などの比較的薄暗い蛍光タグ(例えば、ISGへの適用)と組み合わせて使用することができる。したがって、SPTと比較して、必要な光子の量が少ないため、より高い時間分解能が(同じラベルを使用して)達成される8。第2に、iMSD法は時間分解能によってのみ制限され、回折によって制限されるわけではない。実際、回折制限された光学セットアップが使用されているにもかかわらず、STICS29を使用して分子流についてすでに実証されているように、回折限界を下回っても平均分子変位を測定することができます。変位測定における実際の分解能は、相関関数を(信号対雑音の観点から)どれだけ正確に測定できるかによって異なり、回折によって制限されない理由を説明します。したがって、測定できる最小変位は、対象物体の拡散性および撮像セットアップの時間分解能に依存することは明らかであるように思われる。
これに関して、レーザー走査顕微鏡によるマクロピノソームまたはインスリン顆粒などの細胞内ナノ構造への適用が最適であることを考慮することが重要である:利用可能な走査速度は、目的の物体のダイナミクスよりも有意に高い。このような場合、取得中の物体の動きはごくわずかであり、相関関数はガウス関数によって近似することができる。最後に、iMSDアプローチは、ラスタースキャンまたは広視野カメラベースのイメージングに基づく幅広い商用光学顕微鏡セットアップに容易に適用でき、システムキャリブレーションは必要ありません(粒子サイズの正確な推定を達成する必要がある場合のみ必要です)。メソッドが機能するための重要なパラメーターは、適切な空間サンプリングです。一般的なルールとして、フィッティングアルゴリズムの満足のいく収束に達するためには、画像化のための関心領域の最小サイズは、関心の最大変位よりも少なくとも3倍大きくなければならない。
結論として、iMSD法は、迅速な取得のために装備された顕微鏡のみを必要とする。目的の構造は、遺伝的にコードされた任意の蛍光色素分子または有機蛍光色素分子にタグ付けできるため、マルチチャンネルイメージングが可能になります。クロスiMSD解析は、近い将来、細胞内ナノ構造の部分集団を選択し、細胞内での相互作用と共拡散を明らかにするために用いられることが想定されており、後者は細胞生物物理学においてホットな話題となっている。iMSD解析によって詳細が失われた場合、これは確かに動的細胞内ナノ構造内の大量の分子情報に関連しています。このような情報は、時間分解能が低いため、測定中に必然的に平均化されます。しかし、理論的には、十分な取得速度を達成できれば、分子情報を取り出す可能性による技術的限界はない8.検出器の速度/感度とイメージング技術の継続的な改善により、細胞内区画全体とその分子構成成分に関する情報が単一のデータセットから抽出されることが想定されています。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、欧州連合のHorizon 2020 Research and Innovation Programme(助成金契約No 866127、Project CAPTUR3D)の下で、欧州研究評議会(ERC)から資金提供を受けています。
100x Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378-016 | Cell medium supplement |
C-peptide-EGFP | Plasmid | ||
DMEM High Glucose | Gibco | 31053028 | Cell medium (HeLa) |
FBS | Gibco | 10082147 | Cell medium supplement |
Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma Aldrich | 46945-100MG-F | Reagent |
HeLa | ATCC | CCL-61 | Cell Line |
Lipofectamine 2000 | TermoFisher | 11668019 | Trasfection reagent |
Lysotracker Red DND-99 | Gibco | L7528 | Reagent |
Matlab | MathWork | Software | |
Microscope-suitable cell dishes | Willco | GWSt-3522 | Petri dishes |
Olympus FV1000 | Olympus Japan | Confocal microscope | |
RPMI 1640 | Gibco | 11835063 | Cell medium (INS-1E) |