Imaging-derived mean square displacement (iMSD) analyse wordt toegepast op macropinosomen om hun intrinsieke tijd-evoluerende aard in termen van structurele en dynamische eigenschappen te benadrukken. Macropinosomen worden vervolgens vergeleken met insulinesecretiekorrels (ISG’s) als referentie voor subcellulaire structuren met tijdinvariante gemiddelde structurele/dynamische eigenschappen.
Imaging-derived mean square displacement (iMSD) wordt gebruikt om de structurele en dynamische eigenschappen van subcellulaire nanostructuren aan te pakken, zoals blaasjes die betrokken zijn bij de endo/ exocytotische handel in opgeloste stoffen en biomoleculen. iMSD is gebaseerd op standaard time-lapse-beeldvorming, is compatibel met elke optische opstelling en hoeft niet stil te staan bij afzonderlijke objecten om trajecten te extraheren. Van elk iMSD-spoor wordt een uniek drietal van gemiddelde structurele en dynamische parameters (d.w.z. grootte, lokale diffusiviteit, abnormale coëfficiënt) berekend en gecombineerd om de “iMSD-handtekening” van de bestudeerde nanostructuur te bouwen.
De potentie van deze benadering wordt hier bewezen met het voorbeeldige geval van macropinosomen. Deze blaasjes evolueren in de loop van de tijd en veranderen hun gemiddelde grootte, aantal en dynamische eigenschappen van vroege naar late stadia van intracellulaire handel. Ter controle worden insulinesecretiekorrels (ISG’s) gebruikt als referentie voor subcellulaire structuren die in een stationaire toestand leven waarin de gemiddelde structurele en dynamische eigenschappen van de hele populatie van objecten invariant zijn in de tijd. De iMSD-analyse benadrukt deze eigenaardige kenmerken kwantitatief en effent de weg naar vergelijkbare toepassingen op subcellulair niveau, zowel in de fysiologische als pathologische toestanden.
Subcellulaire nanostructuren (bijv. endocytische/secretoire blaasjes, organellen) spelen een cruciale rol in de celsignaleringsregulatie1. Een goede afstemming van hun structurele (bijv. grootte) en/of dynamische (bijv. diffusiviteit) kenmerken bepaalt hoe de cel reageert op interne of externe stimuli 2,3,4. Op basis van dit bewijs is het niet verrassend dat veranderingen van deze kenmerken in veel pathologische omstandigheden worden gevonden. Voorbeelden omvatten de rol van verkeerd gereguleerde endocytose bij kanker 2,3, de structurele en dynamische veranderingen die worden gevonden op het niveau van ISG’s in β-cellen die zijn blootgesteld aantype-2 diabetesomstandigheden 5, de misregulatie van lysosomale structurele en transporteigenschappen in globoïde-cel leukodystrofie of galactosylceramide lipidose6, en disfuncties in de endo-lysosomale route bij neurodegeneratieve aandoeningen (bijv. De ziekte van Alzheimer)7.
In deze context hebben onderzoekers onlangs bewezen dat de prestaties van standaard optische microscopiemethoden kunnen worden verbeterd door de ruimtelijke en temporele bemonsteringsresolutie goed af te stemmen8. Dit kan op zijn beurt meer inzicht geven in biologische processen van relevantie. In de praktijk wordt dit mogelijk gemaakt door een algoritme van spatiotemporale fluctuatieanalyse, dat tegelijkertijd de gemiddelde structurele en dynamische eigenschappen van diffuserende objecten rechtstreeks uit de standaardstapel van optische microscopiebeelden haalt zonder dat voorafgaande kennis over het biologische object van belang en extractie van trajecten met één object nodig is. Al deze informatie is ingesloten in een enkele uitvoer van de methode: een iMSD-spoor9 (details over de afleiding en analyse van iMSD-sporen worden gegeven in aanvullend bestand 1).
Het resulterende experimentele protocol bestaat uit een paar stappen. Ten eerste wordt beeldvorming van het gebied van belang uitgevoerd met een hoge temporele resolutie. Vervolgens worden gemiddelde ruimtelijk-temporele correlatiefuncties berekend uit de stapel afbeeldingen. Ten slotte wordt door Gaussiaanse aanpassing van de reeks correlatiefuncties de gemiddelde ‘diffusiewet’ rechtstreeks uit beeldvorming verkregen en geanalyseerd om de objectdiffusiemodus te herkennen. Het potentieel van de methode was al bewezen voor een verscheidenheid aan biologische objecten, variërend van moleculen tot nanodeeltjes en zelfs hele subcellulaire organellen / structuren 9,10,11,12,13,14,15.
Dit artikel rapporteert iMSD-toepassing op macropinosomen om hun intrinsieke, onomkeerbare tijdsveranderende aard te benadrukken in termen van hun gemiddelde (d.w.z. op het hele populatieniveau) structurele en dynamische eigenschappen. Verder worden deze endocytische blaasjes vergeleken met ISG’s als referentie voor subcellulaire structuren in een ‘stationaire toestand’, d.w.z. een toestand waarin de gemiddelde structurele / dynamische eigenschappen van de hele populatie van korrels op elk moment constant blijven. Macropinocytose definieert een reeks gebeurtenissen geïnitieerd door de uitgebreide reorganisatie (of ruches) van het plasmamembraan om een externe macropinocytische structuur te vormen die vervolgens wordt geïnternaliseerd16. De gevormde macropinosomen in een vroeg stadium lijken sterk op fagosomen. Tegelijkertijd kunnen ze worden onderscheiden van andere vormen van endocytische blaasjes vanwege hun karakteristieke grote omvang, morfologische heterogeniteit en gebrek aan eiwitlaagstructuren.
Biochemische assays onthulden dat macropinosomen bij internalisatie geleidelijk worden verrijkt met eiwitmarkers van andere endocytische routes, wat suggereert dat hun identiteit voortdurend verandert tijdens de handel17. Met behulp van antilichamen tegen bekende markers van de endosomale route werd aangetoond dat macropinosomen geleidelijk klassieke endoconale kenmerken aannemen: ze nemen in omvang af, ontwikkelen zich tot late endocytische structuren (bijv. lysosomen) of verliezen uiteindelijk hun identiteit via membraangemedieerd ophalen van specifieke moleculaire markers (bijv. het sorteren van nexins)18,19 . Het algemene scenario is dat elk macropinosoom in de cel onomkeerbaar zijn structurele en dynamische (evenals moleculaire) identiteit verandert tijdens de handel van het plasmamembraan naar zijn uiteindelijke intracellulaire lot. Als gevolg hiervan veranderen ook de structurele/dynamische/moleculaire eigenschappen van de hele populatie van macropinosomen langs hetzelfde temporele pad. Omdat de iMSD-methode intrinsiek gevoelig is voor de gemiddelde eigenschappen van de hele populatie van waargenomen objecten, geeft ze kwantitatief de ‘evoluerende aard’ weer door de kwantificering van belangrijke gemiddelde parameters, d.w.z. de lokale diffusiviteit en abnormale coëfficiënt (dynamische eigenschappen) en de gemiddelde grootte van de macropinosomen (structurele eigenschap) in elk stadium van hun intracellulaire handel.
Ter vergelijking werden vergelijkbare metingen uitgevoerd op een bekende intracellulaire membraan-omsloten structuur, de ISG, in een model van β-cellen. Net als macropinosomen is de regulatie van de structurele en dynamische eigenschappen van ISG’s, van hun ontstaan bij het Trans Golgi Network (TGN) tot hun exocytose bij het plasmamembraan, cruciaal voor de juiste uitvoering van ISG-functie20. In tegenstelling tot macropinosomen leven ISG’s echter in een ‘stationaire toestand’ waarin op elk moment alle functionele / structurele / moleculaire stadia van isg-levensduur tegelijkertijd in de cel aanwezig zijn en elk wordt vertegenwoordigd door een specifieke subpopulatie van ISG’s. Dit betekent dat hoewel elke afzonderlijke korrel onomkeerbaar evolueert van biogenese naar secretie, de gemiddelde structurele / dynamische eigenschappen van de hele populatie van korrels naar verwachting op elk moment constant zullen blijven (tenzij de stationaire toestandsomstandigheden worden veranderd, bijvoorbeeld door externe stimuli zoals glucose, cholesterol en cytokines13). Dit wordt bevestigd door iMSD-analyse.
De eigenschappen en voordelen van iMSD zijn duidelijk in vergelijking met de beschikbare technieken om analoge informatie op te halen. Voor structurele informatie heeft de voorkeur transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) analyse. Met deze methode kunnen ultrastructurele details met moleculaire resolutie en zelfs daarbuiten worden opgehaald, zelfs voor subcellulaire nanostructuren. Niettemin wordt de eigenaardige ruimtelijke resolutie van TEM bereikt ten koste van de informatie in de temporele dimensie, die hier van belang is. Om dit te compenseren, zijn de recente ontwikkelingen in live-cell imaging-technologieën van bijzonder belang. Deze omvatten nieuwe fluorescerende markers met verhoogde prestaties (bijv. Helderheid en fotostabiliteit), geoptimaliseerde etiketteringsprocedures en gevoeligere detectoren. Daarnaast zijn er analytische instrumenten beschikbaar om zowel structurele (bijv. ‘grootte’ door phasor-gebaseerde analyse van lokale beeldcorrelatiespectroscopie, PLICS23, aggregatie/oligomerisatie door nummer- en helderheidsanalyse24) als dynamische (bijv. diffusiewetgeving door single-particle tracking, d.w.z. (SPT)25,26,27,28 aan te pakken ) parameters op de subcellulaire schaal. De SPT-methode biedt directe toegang tot het objecttraject en de bijbehorende MSD. Het nadeel is echter de noodzaak van een lage dichtheid van de sonde en zeer heldere labels en veel trajecten van één object die moeten worden gemeten om aan statistische criteria te voldoen. Met betrekking tot de temporele resolutie van de meting kunnen anorganische, fotostabiele sondes (bijv. Quantum Dots of metalen nanodeeltjes) de SPT-prestaties verhogen, maar ten koste van complexe productie- en etiketteringsprocedures.
In vergelijking met deze standaarden laat de hier beschreven iMSD-methode enkele belangrijke voordelen zien. Ten eerste kan deze aanpak worden gebruikt in combinatie met relatief zwakke fluorescerende tags, zoals genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten (bijvoorbeeld de toepassing op ISG’s). In vergelijking met SPT wordt dus een hogere temporele resolutie bereikt (met hetzelfde label) vanwege de lagere hoeveelheid fotonen die nodig is8. Ten tweede wordt de iMSD-methode alleen beperkt door de temporele resolutie, maar niet door diffractie. In feite kunnen, ondanks de gebruikte diffractie-beperkte optische opstelling, gemiddelde moleculaire verplaatsingen zelfs onder de diffractielimiet worden gemeten, zoals al is aangetoond voor moleculaire stromen met behulp van STICS29. De werkelijke resolutie bij het meten van verplaatsingen hangt af van hoe nauwkeurig (in termen van signaal-ruis) de correlatiefunctie kan worden gemeten, wat verklaart waarom deze niet wordt beperkt door diffractie. Het lijkt dus duidelijk dat de minimale verplaatsing die kan worden gemeten afhankelijk is van de diffusiviteit van het object van belang en de temporele resolutie van de beeldvormingsopstelling.
In dit verband is het belangrijk om te overwegen dat toepassing op subcellulaire nanostructuren, zoals macropinosomen of insulinekorrels, met een laserscanmicroscoop optimaal is: de beschikbare scansnelheid is aanzienlijk hoger dan de dynamiek van het object van belang. In een dergelijk geval is de beweging van de objecten tijdens de verwerving verwaarloosbaar en kan de correlatiefunctie worden benaderd door een Gaussiaanse functie. Ten slotte kan de iMSD-benadering eenvoudig worden toegepast op een breed scala aan commerciële optische microscopie-opstellingen op basis van rasterscan of op wide-field camera’s gebaseerde beeldvorming, zonder dat systeemkalibratie nodig is (alleen vereist als een nauwkeurige schatting van de deeltjesgrootte moet worden bereikt). Een belangrijke parameter voor de werkwijze is een goede ruimtelijke bemonstering. Als algemene regel geldt dat, om een bevredigende convergentie van het aanpassingsalgoritme te bereiken, de minimumgrootte van het gebied dat van belang is voor beeldvorming ten minste 3 keer groter moet zijn dan de maximale verplaatsing van belang.
Kortom, de iMSD-methode vereist alleen een microscoop die is uitgerust voor snelle acquisitie. De structuur van belang kan worden getagd aan elke genetisch gecodeerde of organische fluorofoor, waardoor meerkanaals beeldvorming mogelijk is. Het is de bedoeling dat cross-iMSD-analyse in de nabije toekomst zal worden gebruikt om subpopulaties van subcellulaire nanostructuren te selecteren en hun interacties en co-diffusie in de cel te onthullen, waarbij de laatste een hot topic is in de cellulaire biofysica. Als er enig detail verloren gaat door iMSD-analyse, heeft dit zeker te maken met de grote hoeveelheid moleculaire informatie binnen dynamische subcellulaire nanostructuren. Dergelijke informatie wordt onvermijdelijk gemiddeld tijdens de meting als gevolg van een slechte temporele resolutie. Theoretisch is er echter geen technische limiet vanwege de mogelijkheid om moleculaire informatie op te halen, op voorwaarde dat voldoende acquisitiesnelheden kunnen worden bereikt8. Vanwege de voortdurende verbeteringen in detectorsnelheid / gevoeligheid en beeldvormingstechnologieën, is het de bedoeling dat informatie over het hele subcellulaire compartiment en de moleculaire bestanddelen ervan uit een enkele dataset zal worden geëxtraheerd.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk heeft financiering ontvangen van de Europese Onderzoeksraad (ERC) in het kader van het Horizon 2020 Onderzoeks- en Innovatieprogramma van de Europese Unie (subsidieovereenkomst nr. 866127, project CAPTUR3D).
100x Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378-016 | Cell medium supplement |
C-peptide-EGFP | Plasmid | ||
DMEM High Glucose | Gibco | 31053028 | Cell medium (HeLa) |
FBS | Gibco | 10082147 | Cell medium supplement |
Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma Aldrich | 46945-100MG-F | Reagent |
HeLa | ATCC | CCL-61 | Cell Line |
Lipofectamine 2000 | TermoFisher | 11668019 | Trasfection reagent |
Lysotracker Red DND-99 | Gibco | L7528 | Reagent |
Matlab | MathWork | Software | |
Microscope-suitable cell dishes | Willco | GWSt-3522 | Petri dishes |
Olympus FV1000 | Olympus Japan | Confocal microscope | |
RPMI 1640 | Gibco | 11835063 | Cell medium (INS-1E) |