L’analyse du déplacement carré moyen (iMSD) dérivée de l’imagerie est appliquée aux macroponosomes pour mettre en évidence leur nature intrinsèque évolutive dans le temps en termes de propriétés structurelles et dynamiques. Les macropoinosomes sont ensuite comparés aux granules sécrétoires d’insuline (ISG) comme référence pour les structures subcellulaires ayant des propriétés structurelles/dynamiques moyennes invariantes dans le temps.
Le déplacement carré moyen dérivé de l’imagerie (iMSD) est utilisé pour traiter les propriétés structurelles et dynamiques des nanostructures subcellulaires, telles que les vésicules impliquées dans le trafic endo/exocytotique des solutés et des biomolécules. iMSD s’appuie sur l’imagerie time-lapse standard, est compatible avec n’importe quelle configuration optique et n’a pas besoin de s’attarder sur des objets uniques pour extraire des trajectoires. À partir de chaque trace iMSD, un triplet unique de paramètres structurels et dynamiques moyens (c.-à-d. taille, diffusivité locale, coefficient anormal) est calculé et combiné pour construire la « signature iMSD » de la nanostructure étudiée.
La puissance de cette approche est prouvée ici avec le cas exemplaire des macropinosomes. Ces vésicules évoluent dans le temps, modifiant leur taille moyenne, leur nombre et leurs propriétés dynamiques en passant des stades précoces aux stades avancés du trafic intracellulaire. Comme contrôle, les granules sécrétoires d’insuline (ISG) sont utilisés comme référence pour les structures subcellulaires qui vivent dans un état stationnaire dans lequel les propriétés structurelles et dynamiques moyennes de l’ensemble de la population d’objets sont invariantes dans le temps. L’analyse iMSD met en évidence ces caractéristiques particulières quantitativement et ouvre la voie à des applications similaires au niveau subcellulaire, à la fois dans les états physiologiques et pathologiques.
Les nanostructures subcellulaires (p. ex. vésicules endocytaires/sécrétoires, organites) jouent un rôle central dans la régulation de la signalisation cellulaire1. Un bon réglage de leurs caractéristiques structurelles (p. ex., taille) et/ou dynamiques (p. ex., diffusivité) détermine la façon dont la cellule réagit aux stimuli internes ou externes 2,3,4. Sur la base de ces preuves, il n’est pas surprenant que des altérations de ces caractéristiques se retrouvent dans de nombreuses conditions pathologiques. Les exemples englobent le rôle de l’endocytose mal régulée dans le cancer 2,3, les altérations structurelles et dynamiques trouvées au niveau des ISG dans les cellules β exposées aux conditions de diabète de type 25, la mauvaise régulation des propriétés structurelles et de transport lysosomales dans la leucodystrophie globoïde ou la lipidose galactosylcéramide6, et les dysfonctionnements de la voie endo-lysosomale dans les troubles neurodégénératifs (par exemple, la maladie d’Alzheimer)7.
Dans ce contexte, les chercheurs ont récemment prouvé que les performances des méthodes de microscopie optique standard peuvent être améliorées en réglant correctement la résolution d’échantillonnage spatiale et temporelle8. Ceci, à son tour, peut fournir un aperçu plus approfondi des processus biologiques pertinents. En pratique, cela est rendu possible par un algorithme d’analyse des fluctuations spatio-temporelles, qui extrait simultanément les propriétés structurelles et dynamiques moyennes des objets diffusants directement à partir de la pile standard d’images de microscopie optique sans aucune connaissance préalable de l’objet biologique d’intérêt et de l’extraction de trajectoires d’objet unique. Toutes ces informations sont regroupées dans une seule sortie de la méthode : une trace iMSD9 (les détails sur la dérivation et l’analyse de la trace iMSD sont donnés dans le fichier supplémentaire 1).
Le protocole expérimental qui en résulte se compose de quelques étapes. Tout d’abord, l’imagerie de la région d’intérêt est réalisée à haute résolution temporelle. Ensuite, les fonctions de corrélation spatio-temporelle moyennes sont calculées à partir de la pile d’images. Enfin, par ajustement gaussien de la série de fonctions de corrélation, la « loi de diffusion » moyenne est obtenue directement à partir de l’imagerie et analysée pour reconnaître le mode de diffusion de l’objet. Le potentiel de la méthode a déjà été prouvé pour une variété d’objets biologiques, allant des molécules aux nanoparticules et même à des organites / structures subcellulaires entiers 9,10,11,12,13,14,15.
Cet article fait état de l’application de la DSIm aux macroponosomes pour mettre en évidence leur nature intrinsèque et irréversible qui évolue dans le temps en termes de propriétés structurelles et dynamiques moyennes (c.-à-d. à l’échelle de la population). En outre, ces vésicules endocytaires sont comparées aux ISG en tant que référence pour les structures subcellulaires dans un « état stationnaire », c’est-à-dire un état dans lequel les propriétés structurelles / dynamiques moyennes de l’ensemble de la population de granules restent constantes à tout moment. La macropinocytose définit une série d’événements initiés par la réorganisation étendue (ou ébouriffement) de la membrane plasmique pour former une structure macropinocytaire externe qui est ensuite internalisée16. Les macropinosomes formés à un stade précoce sont très similaires aux phagosomes. Dans le même temps, elles peuvent être distinguées des autres formes de vésicules endocytaires en raison de leur grande taille caractéristique, de leur hétérogénéité morphologique et de l’absence de structures protéiques.
Des tests biochimiques ont révélé que, lors de l’internalisation, les macropoinosomes s’enrichissent progressivement de marqueurs protéiques d’autres voies endocytaires, ce qui suggère que leur identité change continuellement pendant le trafic17. En utilisant des anticorps contre des marqueurs connus de la voie endosomale, il a été démontré que les macropoinosomes adoptent progressivement des caractéristiques endosomales classiques : ils diminuent en taille, se développent en structures endocytaires tardives (p. ex., lysosomes) ou finissent par perdre leur identité par la récupération membranaire de marqueurs moléculaires spécifiques (p. ex., tri des néxines)18,19 . Le scénario global est que chaque macropinosome à l’intérieur de la cellule change irréversiblement son identité structurelle et dynamique (ainsi que moléculaire) lors du trafic de la membrane plasmique à son destin intracellulaire final. En conséquence, les propriétés structurelles/ dynamiques / moléculaires de l’ensemble de la population de macropinosomes changent également le long du même chemin temporel. Étant intrinsèquement sensible aux propriétés moyennes de l’ensemble de la population d’objets observés, la méthode iMSD décrit quantitativement la « nature évolutive » par la quantification de paramètres moyens clés, c’est-à-dire la diffusivité locale et le coefficient anormal (propriétés dynamiques) et la taille moyenne des macropinosomes (propriété structurelle) à n’importe quel stade de leur trafic intracellulaire.
À titre de comparaison, des mesures similaires ont été effectuées sur une structure intracellulaire bien connue, l’ISG, dans un modèle de cellules β. Comme les macropinosomes, la régulation des propriétés structurelles et dynamiques des ISG, depuis leur genèse au réseau Trans Golgi (TGN) jusqu’à leur exocytose au niveau de la membrane plasmique, est essentielle à la bonne exécution de la fonction ISG20. Cependant, contrairement aux macropinosomes, les ISG vivent dans un « état stationnaire » dans lequel, à tout moment, tous les stades fonctionnels / structurels / moléculaires de la durée de vie des ISG sont simultanément présents dans la cellule, et chacun est représenté par une sous-population spécifique d’ISG. Cela signifie que bien que chaque granule évolue de manière irréversible de la biogenèse à la sécrétion, les propriétés structurelles / dynamiques moyennes de l’ensemble de la population de granules devraient rester constantes à tout moment (à moins que les conditions de l’état stationnaire ne soient modifiées, par exemple, par des stimuli externes tels que le glucose, le cholestérol et les cytokines13). Ceci est confirmé par l’analyse iMSD.
Les propriétés et les avantages de l’iMSD sont évidents par rapport aux techniques disponibles pour récupérer des informations analogues. Pour les informations structurelles, le choix préféré est l’analyse par microscopie électronique à transmission (TEM). Par cette méthode, les détails ultrastructuraux à résolution moléculaire et même au-delà peuvent être récupérés, même pour les nanostructures subcellulaires. Néanmoins, la résolution spatiale particulière de la GDT est obtenue au détriment de l’information dans la dimension temporelle, ce qui est intéressant ici. Pour compenser cela, les progrès récents dans les technologies d’imagerie des cellules vivantes sont particulièrement intéressants. Il s’agit notamment de nouveaux marqueurs fluorescents avec des performances accrues (par exemple, luminosité et photostabilité), de procédures d’étiquetage optimisées et de détecteurs plus sensibles. En outre, des outils analytiques sont disponibles pour traiter à la fois structurelle (par exemple, « taille » par analyse basée sur le phaseur de la spectroscopie de corrélation d’image locale, PLICS23, agrégation / oligomérisation par analyse nombre et luminosité24) et dynamique (par exemple, loi de diffusion par suivi d’une seule particule, c’est-à-dire (SPT) 25,26,27,28 ) à l’échelle subcellulaire. La méthode SPT permet un accès direct à la trajectoire de l’objet et à son MSD. Cependant, l’inconvénient est la nécessité d’une faible densité de la sonde et d’étiquettes très lumineuses et de nombreuses trajectoires à objet unique à mesurer pour satisfaire aux critères statistiques. En ce qui concerne la résolution temporelle de la mesure, les sondes inorganiques photostables (p. ex., points quantiques ou nanoparticules métalliques) peuvent augmenter les performances spteuses, mais au détriment de procédures complexes de production et d’étiquetage.
Par rapport à ces normes, la méthode iMSD décrite ici présente certains avantages clés. Tout d’abord, cette approche peut être utilisée conjointement avec des étiquettes fluorescentes relativement faibles, telles que des protéines fluorescentes codées génétiquement (par exemple, l’application aux ISG). Ainsi, par rapport au SPT, une résolution temporelle plus élevée est obtenue (en utilisant la même étiquette) en raison de la plus faible quantité de photons requis8. Deuxièmement, la méthode iMSD n’est limitée que par la résolution temporelle mais pas par la diffraction. En fait, malgré la configuration optique limitée à la diffraction utilisée, les déplacements moléculaires moyens même en dessous de la limite de diffraction peuvent être mesurés, comme cela a déjà été démontré pour les écoulements moléculaires en utilisant STICS29. La résolution réelle dans la mesure des déplacements dépend de la précision (en termes de signal au bruit) de la fonction de corrélation, ce qui explique pourquoi elle n’est pas limitée par la diffraction. Ainsi, il apparaît clairement que le déplacement minimal qui peut être mesuré dépend de la diffusivité de l’objet d’intérêt et de la résolution temporelle de la configuration d’imagerie.
À cet égard, il est important de considérer que l’application aux nanostructures subcellulaires, telles que les macropinosomes ou les granules d’insuline, avec un microscope à balayage laser est optimale: la vitesse de balayage disponible est nettement supérieure à la dynamique de l’objet d’intérêt. Dans un tel cas, le mouvement des objets lors de l’acquisition est négligeable, et la fonction de corrélation peut être approchée par une fonction gaussienne. Enfin, l’approche iMSD peut être facilement appliquée à un large éventail de configurations de microscopie optique commerciale basées sur le balayage raster ou l’imagerie par caméra à grand champ, sans qu’il soit nécessaire d’étalonner le système (requis uniquement si une estimation précise de la taille des particules doit être obtenue). Un paramètre important pour que la méthode fonctionne est un échantillonnage spatial approprié. En règle générale, pour atteindre une convergence satisfaisante de l’algorithme d’ajustement, la taille minimale de la région d’intérêt pour l’imagerie doit être au moins 3 fois supérieure au déplacement maximal de l’intérêt.
En conclusion, la méthode iMSD ne nécessite qu’un microscope équipé pour une acquisition rapide. La structure d’intérêt peut être marquée à n’importe quel fluorophore génétiquement codé ou organique, permettant ainsi une imagerie multicanal. Il est envisagé que l’analyse iMSD croisée sera utilisée dans un proche avenir pour sélectionner des sous-populations de nanostructures subcellulaires et révéler leurs interactions et leur co-diffusion au sein de la cellule, cette dernière étant un sujet brûlant en biophysique cellulaire. Si un détail est perdu par l’analyse iMSD, cela est certainement lié à la grande quantité d’informations moléculaires dans les nanostructures subcellulaires dynamiques. Ces informations sont inévitablement moyennées pendant la mesure en raison d’une mauvaise résolution temporelle. Théoriquement, cependant, il n’y a pas de limite technique en raison de la possibilité de récupérer des informations moléculaires, à condition que des vitesses d’acquisition suffisantes puissent être atteintes8. En raison de l’amélioration continue de la vitesse/sensibilité des détecteurs et des technologies d’imagerie, il est envisagé que les informations sur l’ensemble du compartiment subcellulaire et ses constituants moléculaires soient extraites d’un seul ensemble de données.
The authors have nothing to disclose.
Ces travaux ont reçu un financement du Conseil européen de la recherche (CER) dans le cadre du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne (convention de subvention n° 866127, projet CAPTUR3D).
100x Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378-016 | Cell medium supplement |
C-peptide-EGFP | Plasmid | ||
DMEM High Glucose | Gibco | 31053028 | Cell medium (HeLa) |
FBS | Gibco | 10082147 | Cell medium supplement |
Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma Aldrich | 46945-100MG-F | Reagent |
HeLa | ATCC | CCL-61 | Cell Line |
Lipofectamine 2000 | TermoFisher | 11668019 | Trasfection reagent |
Lysotracker Red DND-99 | Gibco | L7528 | Reagent |
Matlab | MathWork | Software | |
Microscope-suitable cell dishes | Willco | GWSt-3522 | Petri dishes |
Olympus FV1000 | Olympus Japan | Confocal microscope | |
RPMI 1640 | Gibco | 11835063 | Cell medium (INS-1E) |