제노푸스 라레비스 배아의 블라스코클로로 분비된 성장 인자 변형 분석 가족 분열 제품
Summary
성장 인자 ß 를 변형할 때 가족 전구체 단백질은 제노푸스 라예비스 배아에서 ectopically 발현될 때, 그들은 분화하고, 갈라지고, 초기 가스트루라 단계로 늦은 블라술라에서 시작되는 blastocoele로 분비됩니다. 우리는 면역 blot 분석을 위한 blastocoele 캐비티에서 분열 제품을 심는 방법을 설명합니다.
Abstract
Tgfß/Nodal 또는 뼈 형태유전학 단백질(Bmp) 리간드로 표현되는 변형 성장 인자 ß(Tgfß) 슈퍼 패밀리의 두 팔은 배아 발달과 성인 항상성에서 필수적인 역할을 합니다. Tgfß 가족의 구성원은 내시경 망상 내에서 이산화 하고 접는 비활성 전구체로 만들어집니다. 전구체는 이어서 리간드 및 프로도메인 조각으로 갈라진다. 비록 디메라 리간드만 Tgfß 수용체를 참여시키고 다운스트림 신호링을 활성화할 수 있지만, 프로도메인 모이티가 리간드 활동에 기여한다는 인식이 증가하고 있습니다. 이 문서에서는 Tgfß 전구체 단백질의 활성화 중에 생성된 분열 제품을 식별하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 설명합니다. Tgfß 전구체를 코딩하는 RNA는 X. laevis 배아로 처음으로 마이크로 주입됩니다. 다음 날, 분열 제품은 가스트룰라 단계 배아의 blastocoele에서 수집되고 서양 얼룩에서 분석됩니다. 이 프로토콜은 비교적 빨리 완료 될 수 있으며 고가의 시약을 필요로하지 않으며 생리적 조건하에서 농축 된 Tgfß 분열 제품의 원천을 제공합니다.
Introduction
변형 성장 인자 ß (Tgfß) 슈퍼 패밀리의 구성원은 비활성, 이질 전구체 단백질로 합성된다. 전구체는 그 때 분비 통로 내 또는 세포의 외부proprotein 변환기 (PC) 가족의 일원에 의해 갈라지는 것입니다. 이렇게 하면 활성 이황화물 결합 리간드 디머와 두 개의 프로도메인 조각1이생성됩니다. 30년 이상 알려져 왔지만 Tgfß 가족 전구체의 프로도메인이 활성 리간드2를생성하는 데 필요하며, 프로도메인이 리간드 기능에 어떻게 기여하는지에 대한 이해는 불완전합니다.
Tgfß 가족 구성원의 프로테오리틱 활성화 과정에 대한 이해는 불완전하지만, 특정 세포 외 또는 세포 외 구획에서분열이 발생하는지 여부, 그리고 프로 도메인이 크리브 리간드3와공유 또는 비일관성으로 연관되어 있는지 여부에 대한 이해에 대한 관심이 증가하고 있습니다. 여러 연구는 프로 도메인이 분열4,5전에 리간드 접이식을 안내 할뿐만 아니라, 또한 성장 인자 안정성과 작용의 범위에 영향을 미칠 수 있음을 보여 주었다6,7,8,9,호모이머 또는 이성애자의 형성을 구동10,리간드 대기 시간을 유지하기 위해 세포 외 매트릭스에 리간드 를 고정11,어떤 경우에는, 자신의 오른쪽에 리그간드로 역할을 신호12. Tgfß 가족의 많은 구성원의 프로 도메인 내에서 이종점 돌연변이는 눈, 뼈, 신장, 골격 또는인간3의다른 결함과 관련이 있다. 이 사실 인정은 활성 리간드를 생성하고 유지하는 데 있어 프로도메인의 중요한 역할을 강조하고 Tgfß 가족 전구체의 프로테오리틱 성숙 중에 개발 된 분열 제품의 역할을 식별하고 해독하는 것의 중요성을 강조합니다.
여기에서 우리는 X. laevis 배아의 blastocoele에서 Tgfß 가족 선구자의 성숙 도중 생성된 분열 제품을 심는 다음 면역 blot에 그(것)들을 분석하기 위한 상세한 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜은 전구체 단백질에서 하나 이상의 PC 컨센서스 모티프가 생체10,13에서갈라졌는지 여부를 결정하는 데 사용할 수 있으며, 각 모티프(13)를 갈라지는 내인성 PC(들)를 식별할 수있다.,14,Tgfß 가족 homodimers의 생체 형성에서 이성애자(10)를 비교하거나 Tgfß 전구체에서 인간 질병 관련 포인트 돌연변이가 기능성 디메릭 리간드를 형성하는 능력에 영향을 미치는지 여부를 분석한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 프로토콜의 주요 장점은 비교적 빨리 완료될 수 있고, 고가의 시약을 필요로 하지 않으며, 생리학적 조건 하에서 농축 된 Tgfß 분열 제품의 원천을 제공한다는 것이다. 또 다른 장점은 에피토프 태그 단백질을 분석하고 따라서 대부분의 Tgfß 가족 prodomain을 인식하는 상업적으로 이용 가능한 항체의 부족을 우회할 수 있다는 것입니다. 또한 전감염된 배양 포유류 세포에서 에피토프 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 훌륭한 동물 관리에 대한 메리 산체스 감사합니다. 저자의 연구는 국립 보건 원 (NIH /NICHD)의 국립 아동 건강 및 인간 발달 연구소 (NIH /NICHD)에 의해 지원됩니다 R01HD067473-08 및 R21 HD102668-01 및 당뇨병 과 소화 및 신장 질환의 국립 연구소에 의해 (NIDDK/NIH) R01DK1208.08.
Materials
| ß-mercaptoethanol | Fisher | AC125470100 | |
| Bromophenol Blue | Fisher | B392-5 | |
| Calcium Chloride | Fisher | C79-500 | |
| Calcium Nitrate | Fisher | C109-500 | |
| Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder | Fisher | 12-141-364 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science tools | 11251-10 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F9378-500G | |
| Glass capillary, 1 X 90 mm | Narshige | G-1 | |
| Glycerol | Fisher | G33-4 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| Human chorionic gonadotropin | Sigma Aldrich | CG10-10VL | |
| Injection Syringe, 1 mL | Fisher | 8881501368 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Needle, 26 G | Fisher | 305111 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140148 | |
| Picoliter Microinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Pipette Puller | Narashige | PC-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | |
| PVDF Membrane | Sigma Aldrich | IPVH00010 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | S233-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S271-10 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher | S318-500 | |
| Tricaine-S | Pentair | TRS5 | |
| Tris | Fisher | BP152-5 |
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