ניתוח של שינוי גורם גדילה ß מוצרי מחשוף משפחתי מופרש לתוך Blastocoele של קסנופוס laevis עוברים
Summary
כאשר שינוי גורם גדילה ß חלבונים מבשר המשפחה באים לידי ביטוי חוץ רחמי בעוברים קסנופוס laevis, הם עמעם, לקבל מבקעים ומופרשים לתוך blastocoele, אשר מתחיל בפיצוץ מאוחר לשלב gastrula מוקדם. אנו מתארים שיטה לשאיפה של מוצרי מחשוף מחלל הפיצוץ לניתוח אימונובלוט.
Abstract
שתי הזרועות של הליבנדים של גורם גדילה משתנה (Tgfß), המיוצגות על ידי ליגנדים של חלבון מורפוגנטי של Tgfß/Nodal או Bone morphogenetic (Bmp), בהתאמה, ממלאות תפקידים חיוניים בהתפתחות העוברית ובהומאוסטזיס למבוגרים. בני משפחת Tgfß נעשים כמבשרים לא פעילים המעמעמים ומקפלים בתוך הרטיקולום האנדופלסמי. המבשר נצמד לאחר מכן לרסיסי ליגנד ופרודומיין. למרות שרק ליגנד דימריק יכול לעסוק קולטני Tgfß ולהפעיל איתות במורד הזרם, יש הכרה גוברת כי moiety פרודומיין תורם לפעילות ליגנד. מאמר זה מתאר פרוטוקול שניתן להשתמש בו כדי לזהות מוצרי מחשוף שנוצרו במהלך ההפעלה של חלבונים מבשר Tgfß. מבשרי Tgfß של קידוד RNA הם הראשונים microinjected לתוך X. laevis עוברים. למחרת, מוצרי מחשוף נאספים מן blastocoele של עוברי שלב gastrula וניתחו על כתמים מערביים. פרוטוקול זה יכול להסתיים במהירות יחסית, אינו דורש ריאגנטים יקרים ומספק מקור של מוצרי מחשוף Tgfß מרוכזים בתנאים פיזיולוגיים.
Introduction
חברי פקטור הגדילה המשתנה ß (Tgfß) הם מסונתזים כחלבונים מבשרים לא פעילים, מעומעמים. המבשרים אז הם בקע על ידי בני משפחת פרופרוטאין convertase (PC), או בתוך מסלול הפרשה או מחוץ לתאים. זה יוצר דימר ליגנד פעיל, מלוכד דיסולפיד ושני שברי פרודומיין1. למרות שזה ידוע כבר למעלה מ -30 שנה כי הפרודומיין של מבשרי משפחת Tgfß נדרש לייצר ליגנד פעיל2, ההבנה כיצד פרודומיין לתרום לתפקוד ליגנד אינה שלמה.
למרות שההבנה של תהליך ההפעלה הפרוטאוליטית של בני משפחת Tgfß נותרה לא שלמה, יש עניין גובר להבין אילו מוטיבים של קונצנזוס PC מקושטים ב- vivo, אם המחשוף מתרחש בתא תת-תאי או חוץ תאי ספציפי, והאם הפרודומיין נשאר קשור באופן קוולנטי או לא צייתני עם ligand3. מספר מחקרים הראו כי הפרודומיין לא רק מנחה את קיפול ליגנד לפני המחשוף4,5, אלא גם יכול להשפיע על יציבות גורם הצמיחה וטווח הפעולה6,7,8,9, מניעים את היווצרותם של הומודימרים או הטרודימרים10, לעגן את הליגנד במטריצה החוץ-תאית כדי לשמור על חביון ליגנד11, ובמקרים מסוימים, לתפקד כליגנד בזכות עצמו להפעיל הטרולוגית איתות12. מוטציות נקודת הטרוזיגוס בתוך הפרודומיין של חברים רבים במשפחת Tgfß קשורות לעין, עצם, כליות, שלד או פגמים אחרים בבני אדם3. ממצאים אלה מדגישים את התפקיד הקריטי של הפרודומיין ביצירת ותחזוקה של ליגנד פעיל ומדגישים את החשיבות של זיהוי ופענוח התפקיד של מוצרי מחשוף שפותחו במהלך ההבשלה הפרוטאוליטית של מבשרי משפחת Tgfß.
כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור שאיפה מוצרי מחשוף שנוצרו במהלך ההתבגרות של מבשרי משפחת Tgfß מן blastocoele של X. laevis עוברים ולאחר מכן ניתוח אותם על חיסונים. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לקבוע אם אחד או יותר PC קונצנזוס מוטיבים בחלבון הקדמה הם חבולים vivo10,13, לזהות את המחשבים האנדוגניים כי לבקע כל מוטיב13,14, להשוות היווצרות vivo של הומודימרים משפחתיים Tgfß לעומת heterodimers10 או לנתח אם מוטציות נקודה הקשורות למחלות אנושיות ב- Tgfß מבשרי להשפיע על יכולתם ליצור ליגנדים דימרי פונקציונלי.
Protocol
Representative Results
Discussion
היתרונות העיקריים לפרוטוקול המתואר כאן הם שניתן להשלים אותו במהירות יחסית, אינו דורש ריאגנטים יקרים ומספק מקור למוצרי מחשוף Tgfß מרוכזים בתנאים פיזיולוגיים. יתרון נוסף הוא שהוא מאפשר לנתח חלבונים מתויגים אפיטופ ובכך לעקוף את המחסור בנוגדנים זמינים מסחרית המזהים את רוב הפרודומיין המשפחתי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למרי סנצ’ז על טיפול מעולה בבעלי חיים. המחקר של המחברים נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH / NICHD) מעניק R01HD067473-08 ו R21 HD102668-01 ועל ידי המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות (NIDDK / NIH) מענק R01DK128068-01.
Materials
| ß-mercaptoethanol | Fisher | AC125470100 | |
| Bromophenol Blue | Fisher | B392-5 | |
| Calcium Chloride | Fisher | C79-500 | |
| Calcium Nitrate | Fisher | C109-500 | |
| Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder | Fisher | 12-141-364 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science tools | 11251-10 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F9378-500G | |
| Glass capillary, 1 X 90 mm | Narshige | G-1 | |
| Glycerol | Fisher | G33-4 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| Human chorionic gonadotropin | Sigma Aldrich | CG10-10VL | |
| Injection Syringe, 1 mL | Fisher | 8881501368 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Needle, 26 G | Fisher | 305111 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140148 | |
| Picoliter Microinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Pipette Puller | Narashige | PC-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | |
| PVDF Membrane | Sigma Aldrich | IPVH00010 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | S233-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S271-10 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher | S318-500 | |
| Tricaine-S | Pentair | TRS5 | |
| Tris | Fisher | BP152-5 |
References
- Harrison, C. A., Al-Musawi, S. L., Walton, K. L. Prodomains regulate the synthesis, extracellular localisation and activity of TGF-beta superfamily ligands. Growth Factors. 29 (5), 174-186 (2011).
- Gray, A. M., Mason, A. J. Requirement for activin A and transforming growth factor–beta 1 pro-regions in homodimer assembly. Science. 247 (4948), 1328-1330 (1990).
- Constam, D. B. Regulation of TGFbeta and related signals by precursor processing. Seminars in Cell and Developmental Biology. 32, 85-97 (2014).
- Wang, X., Fischer, G., Hyvonen, M. Structure and activation of pro-activin A. Nature Communications. 7, 12052 (2016).
- Zhao, B., Xu, S., Dong, X., Lu, C., Springer, T. A. Prodomain-growth factor swapping in the structure of pro-TGF-beta1. Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1579-1589 (2018).
- Cui, Y., et al. The activity and signaling range of mature BMP-4 is regulated by sequential cleavage at two sites within the prodomain of the precursor. Genes & Development. 15 (21), 2797-2802 (2001).
- Goldman, D. C., et al. Mutation of an upstream cleavage site in the BMP4 prodomain leads to tissue-specific loss of activity. Development. 133 (10), 1933-1942 (2006).
- Le Good, J. A., et al. Nodal stability determines signaling range. Current Biology. 15 (1), 31-36 (2005).
- Tilak, A., et al. Simultaneous rather than ordered cleavage of two sites within the BMP4 prodomain leads to loss of ligand in mice. Development. 141 (15), 3062-3071 (2014).
- Neugebauer, J. M., et al. The prodomain of BMP4 is necessary and sufficient to generate stable BMP4/7 heterodimers with enhanced bioactivity in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (18), 2307-2316 (2015).
- Robertson, I. B., Rifkin, D. B. Regulation of the Bioavailability of TGF-beta and TGF-beta-Related Proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (6), 355-372 (2016).
- Zhou, F., et al. GDF6-CD99 Signaling Regulates Src and Ewing Sarcoma Growth. Cell Reports. 33, 108332 (2020).
- Nelsen, S. M., Christian, J. L. Site-specific cleavage of BMP4 by furin, PC6, and PC7. Journal of Biological Chemistry. 284 (40), 27157-27166 (2009).
- Birsoy, B., et al. XPACE4 is a localized pro-protein convertase required for mesoderm induction and the cleavage of specific TGFbeta proteins in Xenopus development. Development. 132 (3), 591-602 (2005).
- Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods Mol Biol. 770, 55-75 (2011).
- Nelsen, S., Berg, L., Wong, C., Christian, J. L. Proprotein convertase genes in Xenopus development. Developmental Dynamics. 233 (3), 1038-1044 (2005).
- Constam, D. B., Robertson, E. J. Regulation of bone morphogenetic protein activity by pro domains and proprotein convertases. Journal of Cell Biology. 144 (1), 139-149 (1999).
- Sopory, S., Nelsen, S. M., Degnin, C., Wong, C., Christian, J. L. Regulation of bone morphogenetic protein-4 activity by sequence elements within the prodomain. Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34021-34031 (2006).
- Sopory, S., Christian, J. L., Whitman, M. A., Whitman, S. . Analysis of Growth Factor Signaling in Embryos. , 38-55 (2006).
- Kim, H. S., McKnite, A., Christian, J. L. Proteolytic Activation of Bmps: Analysis of Cleavage in Xenopus Oocytes and Embryos. Methods in Molecular Biology. 1891, 115-133 (2019).
- Degnin, C., Jean, F., Thomas, G., Christian, J. L. Cleavages within the prodomain direct intracellular trafficking and degradation of mature bone morphogenetic protein-4. Molecular Biology of the Cell. 15 (11), 5012-5020 (2004).
