Analisi dei prodotti di scissione della famiglia Transforming Growth Factor ß secreti nel blastocoelo di embrioni di Xenopus laevis
Summary
Quando le proteine precursori della famiglia Transforming Growth Factor ß sono espresse ectopicamente negli embrioni di Xenopus laevis, si dimerizzano, si scindono e vengono secrete nel blastocoele, che inizia nella blastula tardiva fino allo stadio iniziale di gastrula. Descriviamo un metodo per aspirare i prodotti di scissione dalla cavità del blastocoele per l’analisi immunoblot.
Abstract
I due bracci della superfamiglia del fattore di crescita trasformante ß (Tgfß), rappresentati rispettivamente dai ligandi Tgfß/nodali o della proteina morfogenetica ossea (Bmp), svolgono ruoli essenziali nello sviluppo embrionale e nell’omeostasi adulta. I membri della famiglia Tgfß sono fatti come precursori inattivi che dimerizzano e si piegano all’interno del reticolo endoplasmatico. Il precursore viene successivamente scisso in frammenti di ligando e prodominio. Sebbene solo il ligando dimerico possa coinvolgere i recettori Tgfß e attivare la segnalazione a valle, vi è un crescente riconoscimento che la parte del prodominio contribuisce all’attività del ligando. Questo articolo descrive un protocollo che può essere utilizzato per identificare i prodotti di scissione generati durante l’attivazione delle proteine precursori di Tgfß. L’RNA che codifica per i precursori di Tgfß viene prima microiniettato negli embrioni di X. laevis. Il giorno seguente, i prodotti di scissione vengono raccolti dal blastocoele degli embrioni allo stadio di gastrula e analizzati su macchie occidentali. Questo protocollo può essere completato in tempi relativamente brevi, non richiede reagenti costosi e fornisce una fonte di prodotti concentrati di scissione Tgfß in condizioni fisiologiche.
Introduction
I membri della superfamiglia Del fattore di crescita trasformante ß (Tgfß) sono sintetizzati come proteine precursori inattive e dimerizzate. I precursori vengono quindi scissi dai membri della famiglia della proproteina convertasi (PC), sia all’interno della via secretoria che al di fuori delle cellule. Questo crea un dimero di ligando attivo legato al disolfuro e due frammenti di prodominio1. Sebbene sia noto da oltre 30 anni che il prodominio dei precursori della famiglia Tgfß è necessario per generare un ligandoattivo 2, la comprensione di come i prodomini contribuiscono alla funzione del ligando è incompleta.
Sebbene la comprensione del processo di attivazione proteolitica dei membri della famiglia Tgfß rimanga incompleta, vi è un crescente interesse nel capire quali motivi di consenso PC sono scissi in vivo, se la scissione si verifica in uno specifico compartimento subcellulare o extracellulare e se il prodominio rimane covalentemente o non covalentemente associato al ligando scisso3. Diversi studi hanno dimostrato che il prodominio non solo guida il ripiegamento del ligandoprima della scissione4,5,ma può anche influenzare la stabilità del fattore di crescita e il raggio d’azione6,7,8,9,guidare la formazione di omodimeri o eterodimeri10,ancorare il ligando nella matrice extracellulare per mantenere la latenza del ligando11e, in alcuni casi, funzionare come un ligando a sé stante per attivare eterologo segnalazione12. Le mutazioni puntiformi eterozigoti all’interno del prodominio di molti membri della famiglia Tgfß sono associate a difetti oculari, ossei, renali, scheletrici o di altro tiponell’uomo 3. Questi risultati evidenziano il ruolo critico del prodominio nella generazione e nel mantenimento di un ligando attivo e sottolineano l’importanza di identificare e decifrare il ruolo dei prodotti di scissione sviluppati durante la maturazione proteolitica dei precursori della famiglia Tgfß.
Qui descriviamo un protocollo dettagliato per aspirare i prodotti di scissione generati durante la maturazione dei precursori della famiglia Tgfß dal blastocoele degli embrioni di X. laevis e poi analizzarli su immunoblot. Questo protocollo può essere utilizzato per determinare se uno o più motivi di consenso PC in una proteina precursore sono scissi in vivo10,13, identificare i PC endogeni che scissono ciascunmotivo 13,14, confrontare la formazione in vivo di omodimeri della famiglia Tgfß rispetto agli eterodimeri10 o analizzare se le mutazioni puntiformi associate alla malattia umana nei precursori di Tgfß influenzano la loro capacità di formare ligandi dimerici funzionali.
Protocol
Representative Results
Discussion
I principali vantaggi del protocollo qui descritto sono che può essere completato in tempi relativamente brevi, non richiede reagenti costosi e fornisce una fonte di prodotti concentrati di scissione Tgfß in condizioni fisiologiche. Un altro vantaggio è che consente di analizzare le proteine marcate con epitopi e quindi aggirare la carenza di anticorpi disponibili in commercio che riconoscono la maggior parte del prodominio della famiglia Tgfß. Sebbene sia anche possibile analizzare la scissione delle proteine precur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Mary Sanchez per l’eccellente cura degli animali. La ricerca degli autori è sostenuta dal National Institute of Child Health and Human Development del National Institutes of Health (NIH / NICHD) sovvenzioni R01HD067473-08 e R21 HD102668-01 e dal National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK / NIH) grant R01DK128068-01.
Materials
| ß-mercaptoethanol | Fisher | AC125470100 | |
| Bromophenol Blue | Fisher | B392-5 | |
| Calcium Chloride | Fisher | C79-500 | |
| Calcium Nitrate | Fisher | C109-500 | |
| Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder | Fisher | 12-141-364 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science tools | 11251-10 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F9378-500G | |
| Glass capillary, 1 X 90 mm | Narshige | G-1 | |
| Glycerol | Fisher | G33-4 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| Human chorionic gonadotropin | Sigma Aldrich | CG10-10VL | |
| Injection Syringe, 1 mL | Fisher | 8881501368 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Needle, 26 G | Fisher | 305111 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140148 | |
| Picoliter Microinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Pipette Puller | Narashige | PC-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | |
| PVDF Membrane | Sigma Aldrich | IPVH00010 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | S233-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S271-10 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher | S318-500 | |
| Tricaine-S | Pentair | TRS5 | |
| Tris | Fisher | BP152-5 |
References
- Harrison, C. A., Al-Musawi, S. L., Walton, K. L. Prodomains regulate the synthesis, extracellular localisation and activity of TGF-beta superfamily ligands. Growth Factors. 29 (5), 174-186 (2011).
- Gray, A. M., Mason, A. J. Requirement for activin A and transforming growth factor–beta 1 pro-regions in homodimer assembly. Science. 247 (4948), 1328-1330 (1990).
- Constam, D. B. Regulation of TGFbeta and related signals by precursor processing. Seminars in Cell and Developmental Biology. 32, 85-97 (2014).
- Wang, X., Fischer, G., Hyvonen, M. Structure and activation of pro-activin A. Nature Communications. 7, 12052 (2016).
- Zhao, B., Xu, S., Dong, X., Lu, C., Springer, T. A. Prodomain-growth factor swapping in the structure of pro-TGF-beta1. Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1579-1589 (2018).
- Cui, Y., et al. The activity and signaling range of mature BMP-4 is regulated by sequential cleavage at two sites within the prodomain of the precursor. Genes & Development. 15 (21), 2797-2802 (2001).
- Goldman, D. C., et al. Mutation of an upstream cleavage site in the BMP4 prodomain leads to tissue-specific loss of activity. Development. 133 (10), 1933-1942 (2006).
- Le Good, J. A., et al. Nodal stability determines signaling range. Current Biology. 15 (1), 31-36 (2005).
- Tilak, A., et al. Simultaneous rather than ordered cleavage of two sites within the BMP4 prodomain leads to loss of ligand in mice. Development. 141 (15), 3062-3071 (2014).
- Neugebauer, J. M., et al. The prodomain of BMP4 is necessary and sufficient to generate stable BMP4/7 heterodimers with enhanced bioactivity in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (18), 2307-2316 (2015).
- Robertson, I. B., Rifkin, D. B. Regulation of the Bioavailability of TGF-beta and TGF-beta-Related Proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (6), 355-372 (2016).
- Zhou, F., et al. GDF6-CD99 Signaling Regulates Src and Ewing Sarcoma Growth. Cell Reports. 33, 108332 (2020).
- Nelsen, S. M., Christian, J. L. Site-specific cleavage of BMP4 by furin, PC6, and PC7. Journal of Biological Chemistry. 284 (40), 27157-27166 (2009).
- Birsoy, B., et al. XPACE4 is a localized pro-protein convertase required for mesoderm induction and the cleavage of specific TGFbeta proteins in Xenopus development. Development. 132 (3), 591-602 (2005).
- Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods Mol Biol. 770, 55-75 (2011).
- Nelsen, S., Berg, L., Wong, C., Christian, J. L. Proprotein convertase genes in Xenopus development. Developmental Dynamics. 233 (3), 1038-1044 (2005).
- Constam, D. B., Robertson, E. J. Regulation of bone morphogenetic protein activity by pro domains and proprotein convertases. Journal of Cell Biology. 144 (1), 139-149 (1999).
- Sopory, S., Nelsen, S. M., Degnin, C., Wong, C., Christian, J. L. Regulation of bone morphogenetic protein-4 activity by sequence elements within the prodomain. Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34021-34031 (2006).
- Sopory, S., Christian, J. L., Whitman, M. A., Whitman, S. . Analysis of Growth Factor Signaling in Embryos. , 38-55 (2006).
- Kim, H. S., McKnite, A., Christian, J. L. Proteolytic Activation of Bmps: Analysis of Cleavage in Xenopus Oocytes and Embryos. Methods in Molecular Biology. 1891, 115-133 (2019).
- Degnin, C., Jean, F., Thomas, G., Christian, J. L. Cleavages within the prodomain direct intracellular trafficking and degradation of mature bone morphogenetic protein-4. Molecular Biology of the Cell. 15 (11), 5012-5020 (2004).
