Анализ трансформирующего фактора роста ß Семейство расщепляющих продуктов, секретируемых в бластоцеле эмбрионов Xenopus laevis
Summary
При преобразовании фактора роста белки-предшественники семейства ß эктопически экспрессируются в эмбрионах Xenopus laevis, они димеризируются, расщепляются и секретируются в бластоцеле, которая начинается на поздней стадии бластулы до ранней стадии гаструлы. Описан способ аспирации продуктов расщепления из полости бластоцелы для иммуноблотбортного анализа.
Abstract
Две ветви суперсемейства Трансформирующего фактора роста ß (Tgfß), представленные лигандами Tgfß/Nodal или Bone morphogenetic protein (Bmp), соответственно, играют важную роль в эмбриональном развитии и гомеостазе взрослых. Члены семейства Tgfß сделаны как неактивные предшественники, которые димеризируются и складываются в эндоплазматическом ритикулуме. Предшественник впоследствии расщепляется на лигандные и продоменные фрагменты. Хотя только димерный лиганд может задействовать рецепторы Tgfß и активировать нисходящую передачу сигналов, растет признание того, что продоменная часть способствует активности лиганда. В этой статье описывается протокол, который может быть использован для идентификации продуктов расщепления, образующихся при активации белков-предшественников Tgfß. РНК, кодирующие предшественники Tgfß, сначала микроинъектируются в эмбрионы X. laevis. На следующий день продукты расщепления собирают из бластоцелы эмбрионов стадии гаструлы и анализируют на вестерн-блоты. Этот протокол может быть выполнен относительно быстро, не требует дорогостоящих реагентов и обеспечивает источник концентрированных продуктов расщепления Tgfß в физиологических условиях.
Introduction
Члены надсемейства Трансформирующего Фактора Роста ß (Tgfß) синтезируются в виде неактивных, димеризованных белков-предшественников. Затем предшественники расщепляются членами семейства пропротеинконвертаз (ПК) либо внутри секреторного пути, либо вне клеток. Это создает активный, дисульфидно-связанный димер лиганда и два продоменных фрагмента1. Хотя уже более 30 лет известно, что продомен предшественников семейства Tgfß необходим для генерации активного лиганда2,понимание того, как продомены способствуют функции лиганда, является неполным.
Хотя понимание процесса протеолитической активации членов семьи Tgfß остается неполным, растет интерес к пониманию того, какие мотивы консенсуса ПК расщепляются in vivo,происходит ли расщепление в определенном субклеточном или внеклеточном компартменте и остается ли продомен ковалентно или нековалентно связанным с расщепленным лигандом3. Несколько исследований показали, что продомен не только направляет сворачивание лиганда перед расщеплением4,5,но также может влиять на стабильность фактора роста и диапазон действия6,7,8,9,управлять образованием гомодимеров или гетеродимеров10,закреплять лиганд во внеклеточном матриксе для поддержания латентности лиганда11,а в некоторых случаях функционировать как лиганд сам по себе для активации гетерологичности сигнализация12. Гетерозиготные точечные мутации в продомене многих членов семейства Tgfß связаны с дефектами глаз, костей, почек, скелета или другими дефектами у людей3. Эти результаты подчеркивают критическую роль продомена в генерации и поддержании активного лиганда и подчеркивают важность выявления и расшифровки роли продуктов расщепления, разработанных во время протеолитического созревания предшественников семейства Tgfß.
Здесь мы описываем подробный протокол для аспирации продуктов расщепления, генерируемых во время созревания предшественников семейства Tgfß из бластоцелы эмбрионов X. laevis, а затем анализируем их на иммуноблотах. Этот протокол может быть использован для определения того, расщепляется ли один или несколько консенсусных мотивов ПК в белке-предшественнике in vivo10,13, идентификацииэндогенных ПК(ов), которые расщепляют каждый мотив13,14,сравнения in vivo образования гомодимеров семейства Tgfß с гетеродимерами10 или анализа того, влияют ли связанные с заболеванием человека точечные мутации в предшественниках Tgfß на их способность образовывать функциональные димерные лиганды.
Protocol
Representative Results
Discussion
Основные преимущества протокола, описанного здесь, заключаются в том, что он может быть выполнен относительно быстро, не требует дорогостоящих реагентов и обеспечивает источник концентрированных продуктов расщепления Tgfß в физиологических условиях. Еще одним преимуществом является ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Мэри Санчес за отличный уход за животными. Исследования авторов поддерживаются грантами Национального института детского здоровья и развития человека Национальных институтов здравоохранения (NIH/NICHD) R01HD067473-08 и R21 HD102668-01 и грантом Национального института диабета и заболеваний пищеварительной системы и почек (NIDDK/NIH) R01DK128068-01.
Materials
| ß-mercaptoethanol | Fisher | AC125470100 | |
| Bromophenol Blue | Fisher | B392-5 | |
| Calcium Chloride | Fisher | C79-500 | |
| Calcium Nitrate | Fisher | C109-500 | |
| Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder | Fisher | 12-141-364 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science tools | 11251-10 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F9378-500G | |
| Glass capillary, 1 X 90 mm | Narshige | G-1 | |
| Glycerol | Fisher | G33-4 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| Human chorionic gonadotropin | Sigma Aldrich | CG10-10VL | |
| Injection Syringe, 1 mL | Fisher | 8881501368 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Needle, 26 G | Fisher | 305111 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140148 | |
| Picoliter Microinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Pipette Puller | Narashige | PC-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | |
| PVDF Membrane | Sigma Aldrich | IPVH00010 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | S233-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S271-10 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher | S318-500 | |
| Tricaine-S | Pentair | TRS5 | |
| Tris | Fisher | BP152-5 |
References
- Harrison, C. A., Al-Musawi, S. L., Walton, K. L. Prodomains regulate the synthesis, extracellular localisation and activity of TGF-beta superfamily ligands. Growth Factors. 29 (5), 174-186 (2011).
- Gray, A. M., Mason, A. J. Requirement for activin A and transforming growth factor–beta 1 pro-regions in homodimer assembly. Science. 247 (4948), 1328-1330 (1990).
- Constam, D. B. Regulation of TGFbeta and related signals by precursor processing. Seminars in Cell and Developmental Biology. 32, 85-97 (2014).
- Wang, X., Fischer, G., Hyvonen, M. Structure and activation of pro-activin A. Nature Communications. 7, 12052 (2016).
- Zhao, B., Xu, S., Dong, X., Lu, C., Springer, T. A. Prodomain-growth factor swapping in the structure of pro-TGF-beta1. Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1579-1589 (2018).
- Cui, Y., et al. The activity and signaling range of mature BMP-4 is regulated by sequential cleavage at two sites within the prodomain of the precursor. Genes & Development. 15 (21), 2797-2802 (2001).
- Goldman, D. C., et al. Mutation of an upstream cleavage site in the BMP4 prodomain leads to tissue-specific loss of activity. Development. 133 (10), 1933-1942 (2006).
- Le Good, J. A., et al. Nodal stability determines signaling range. Current Biology. 15 (1), 31-36 (2005).
- Tilak, A., et al. Simultaneous rather than ordered cleavage of two sites within the BMP4 prodomain leads to loss of ligand in mice. Development. 141 (15), 3062-3071 (2014).
- Neugebauer, J. M., et al. The prodomain of BMP4 is necessary and sufficient to generate stable BMP4/7 heterodimers with enhanced bioactivity in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (18), 2307-2316 (2015).
- Robertson, I. B., Rifkin, D. B. Regulation of the Bioavailability of TGF-beta and TGF-beta-Related Proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (6), 355-372 (2016).
- Zhou, F., et al. GDF6-CD99 Signaling Regulates Src and Ewing Sarcoma Growth. Cell Reports. 33, 108332 (2020).
- Nelsen, S. M., Christian, J. L. Site-specific cleavage of BMP4 by furin, PC6, and PC7. Journal of Biological Chemistry. 284 (40), 27157-27166 (2009).
- Birsoy, B., et al. XPACE4 is a localized pro-protein convertase required for mesoderm induction and the cleavage of specific TGFbeta proteins in Xenopus development. Development. 132 (3), 591-602 (2005).
- Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods Mol Biol. 770, 55-75 (2011).
- Nelsen, S., Berg, L., Wong, C., Christian, J. L. Proprotein convertase genes in Xenopus development. Developmental Dynamics. 233 (3), 1038-1044 (2005).
- Constam, D. B., Robertson, E. J. Regulation of bone morphogenetic protein activity by pro domains and proprotein convertases. Journal of Cell Biology. 144 (1), 139-149 (1999).
- Sopory, S., Nelsen, S. M., Degnin, C., Wong, C., Christian, J. L. Regulation of bone morphogenetic protein-4 activity by sequence elements within the prodomain. Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34021-34031 (2006).
- Sopory, S., Christian, J. L., Whitman, M. A., Whitman, S. . Analysis of Growth Factor Signaling in Embryos. , 38-55 (2006).
- Kim, H. S., McKnite, A., Christian, J. L. Proteolytic Activation of Bmps: Analysis of Cleavage in Xenopus Oocytes and Embryos. Methods in Molecular Biology. 1891, 115-133 (2019).
- Degnin, C., Jean, F., Thomas, G., Christian, J. L. Cleavages within the prodomain direct intracellular trafficking and degradation of mature bone morphogenetic protein-4. Molecular Biology of the Cell. 15 (11), 5012-5020 (2004).
