Analyse du facteur de croissance transformant ß Produits de clivage de la famille sécrétés en blastocoèles d’embryons xenopus laevis
Summary
Lorsque les protéines précurseurs de la famille ß du facteur de croissance transformant sont exprimées ectopiquement dans les embryons de Xenopus laevis, elles se dimérisent, se clivent et sont sécrétées dans le blastocoele, qui commence à la fin de la blastula au stade précoce de gastrula. Nous décrivons une méthode d’aspiration des produits de clivage de la cavité blastocoèle pour l’analyse immunoblot.
Abstract
Les deux bras de la superfamille du facteur de croissance transformant ß (Tgfß), représentés respectivement par les ligands Tgfß/Nodal ou de la protéine morphogénétique osseuse (Bmp), jouent un rôle essentiel dans le développement embryonnaire et l’homéostasie adulte. Les membres de la famille Tgfß sont fabriqués comme des précurseurs inactifs qui dimérisent et se replient dans le réticulum endoplasmique. Le précurseur est ensuite clivé en fragments de ligand et de prodomaine. Bien que seul le ligand dimérique puisse engager les récepteurs Tgfß et activer la signalisation en aval, il est de plus en plus reconnu que la fraction prodomaine contribue à l’activité du ligand. Cet article décrit un protocole qui peut être utilisé pour identifier les produits de clivage générés lors de l’activation des protéines précurseurs de Tgfß. Les précurseurs de Tgfß codant pour l’ARN sont d’abord microinjectés dans les embryons de X. laevis. Le lendemain, les produits de clivage sont collectés à partir de la blastocoele d’embryons au stade gastrula et analysés sur des transferts Occidentaux. Ce protocole peut être complété relativement rapidement, ne nécessite pas de réactifs coûteux et fournit une source de produits de clivage Tgfß concentrés dans des conditions physiologiques.
Introduction
Les membres de la superfamille du facteur de croissance transformant ß (Tgfß) sont synthétisés sous forme de protéines précurseurs dimérisées inactives. Les précurseurs sont ensuite clivés par les membres de la famille des proprotéines convertases (PC), soit dans la voie sécrétoire, soit à l’extérieur des cellules. Cela crée un dimère de ligand actif lié au disulfure et deux fragments de prodomaine1. Bien que l’on sache depuis plus de 30 ans que le prodomaine des précurseurs de la famille Tgfß est nécessaire pour générer un ligand2actif, la compréhension de la façon dont les prodomaines contribuent à la fonction du ligand est incomplète.
Bien que la compréhension du processus d’activation protéolytique des membres de la famille Tgfß reste incomplète, il y a un intérêt croissant à comprendre quel(s) motif(s) de consensus PC sont clivés in vivo,si le clivage se produit dans un compartiment subcellulaire ou extracellulaire spécifique, et si le prodomaine reste covalent ou non associé au ligandclivé 3. Plusieurs études ont montré que le prodomaine non seulement guide le repliement des ligands avant leclivage4,5,mais peut également influencer la stabilité du facteur de croissance et l’amplitude d’action6,7,8,9,conduire la formation d’homodimères ou d’hétérodimères10,ancrer le ligand dans la matrice extracellulaire pour maintenir la latence du ligand11et, dans certains cas, fonctionner comme un ligand à part entière pour activer les hétérologues. signalisation12. Les mutations ponctuelles hétérozygotes au sein du prodomaine de nombreux membres de la famille Tgfß sont associées à des anomalies oculaires, osseuses, rénales, squelettiques ou autres chez l’homme3. Ces résultats soulignent le rôle critique du prodomaine dans la génération et le maintien d’un ligand actif et soulignent l’importance d’identifier et de déchiffrer le rôle des produits de clivage développés au cours de la maturation protéolytique des précurseurs de la famille Tgfß.
Nous décrivons ici un protocole détaillé pour aspirer les produits de clivage générés lors de la maturation des précurseurs de la famille Tgfß à partir du blastocoèle des embryons de X. laevis, puis les analyser sur des immunoblots. Ce protocole peut être utilisé pour déterminer si un ou plusieurs motifs de consensus PC dans une protéine précurseur sont clivés in vivo10,13, identifier le ou les PC endogènes qui clivent chaque motif 13,14, comparer la formation in vivo d’homodimères de la famille Tgfß par rapport aux hétérodimères10 ou analyser si les mutations ponctuelles associées à la maladie humaine dans les précurseurs Tgfß ont un impact sur leur capacité à former des ligands dimériques fonctionnels.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les principaux avantages du protocole décrit ici sont qu’il peut être complété relativement rapidement, ne nécessite pas de réactifs coûteux et fournit une source de produits de clivage Tgfß concentrés dans des conditions physiologiques. Un autre avantage est qu’il permet d’analyser les protéines marquées par épitope et de contourner ainsi la pénurie d’anticorps disponibles dans le commerce qui reconnaissent la plupart des prodomaines de la famille Tgfß. Bien qu’il soit également possible d’ana…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Mary Sanchez pour les excellents soins aux animaux. La recherche des auteurs est soutenue par le National Institute of Child Health and Human Development des National Institutes of Health (NIH / NICHD) subventions R01HD067473-08 et R21 HD102668-01 et par le National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK / NIH) subvention R01DK128068-01.
Materials
| ß-mercaptoethanol | Fisher | AC125470100 | |
| Bromophenol Blue | Fisher | B392-5 | |
| Calcium Chloride | Fisher | C79-500 | |
| Calcium Nitrate | Fisher | C109-500 | |
| Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder | Fisher | 12-141-364 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science tools | 11251-10 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F9378-500G | |
| Glass capillary, 1 X 90 mm | Narshige | G-1 | |
| Glycerol | Fisher | G33-4 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| Human chorionic gonadotropin | Sigma Aldrich | CG10-10VL | |
| Injection Syringe, 1 mL | Fisher | 8881501368 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Needle, 26 G | Fisher | 305111 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140148 | |
| Picoliter Microinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Pipette Puller | Narashige | PC-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | |
| PVDF Membrane | Sigma Aldrich | IPVH00010 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | S233-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S271-10 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher | S318-500 | |
| Tricaine-S | Pentair | TRS5 | |
| Tris | Fisher | BP152-5 |
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