Analyse der Umwandlung von Wachstumsfaktor ß Familie Spaltungsprodukte, die in die Blastokoele von Xenopus laevis Embryonen sezerniert werden
Summary
Wenn Transforming Growth Factor ß-Familie Vorläuferproteine in Xenopus laevis-Embryonen ektopisch exprimiert werden, dimerisieren, gespalten werden und in die Blastokoele sezerniert werden, die von der späten Blastula bis zur frühen Gastrula beginnt. Wir beschreiben eine Methode zum Absaugen von Spaltprodukten aus der Blastokoele-Höhle für die Immunoblot-Analyse.
Abstract
Die beiden Arme der Transforming Growth Factor ß (Tgfß) Superfamilie, vertreten durch Tgfß/Nodal bzw. Bone Morphogenetic Protein (Bmp) Liganden, spielen eine wesentliche Rolle bei der Embryonalentwicklung und der adulten Homöostase. Mitglieder der Tgfß-Familie werden als inaktive Vorläufer hergestellt, die innerhalb des endoplasmatischen Retikulums dimerisieren und falten. Der Vorläufer wird anschließend in Liganden- und Prodomänenfragmente gespalten. Obwohl nur der Dimerligand Tgfß-Rezeptoren aktivieren und die nachgeschaltete Signalübertragung aktivieren kann, wächst die Erkenntnis, dass der Prodomänen-Anteil zur Ligandenaktivität beiträgt. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll, mit dem Spaltungsprodukte identifiziert werden können, die bei der Aktivierung von Tgfß-Vorläuferproteinen entstehen. RNA-kodierende Tgfß-Vorläufer werden zunächst in X. laevis-Embryonen mikroinjektiert. Am folgenden Tag werden Spaltprodukte aus der Blastokoele von Embryonen im Gastrula-Stadium gesammelt und an Western Blots analysiert. Dieses Protokoll kann relativ schnell abgeschlossen werden, benötigt keine teuren Reagenzien und bietet eine Quelle für konzentrierte Tgfß-Spaltprodukte unter physiologischen Bedingungen.
Introduction
Mitglieder der Superfamilie Transforming Growth Factor ß (Tgfß) werden als inaktive, dimerisierte Vorläuferproteine synthetisiert. Die Vorläufer werden dann von Mitgliedern der Proprotein-Convertase-Familie (PC) gespalten, entweder innerhalb des sekretorischen Weges oder außerhalb der Zellen. Dadurch entstehen ein aktives, disulfidgebundenes Ligandendimer und zwei Prodomänenfragmente1. Obwohl seit über 30 Jahren bekannt ist, dass die Prodomäne der Vorläufer der Tgfß-Familie benötigt wird, um einen aktiven Liganden2zu erzeugen, ist das Verständnis, wie Prodomänen zur Ligandenfunktion beitragen, unvollständig.
Obwohl das Verständnis des Prozesses der proteolytischen Aktivierung von Mitgliedern der Tgfß-Familie unvollständig bleibt, besteht ein zunehmendes Interesse daran zu verstehen, welche PC-Konsensmotive in vivogespalten werden, ob die Spaltung in einem bestimmten subzellulären oder extrazellulären Kompartiment auftritt und ob die Prodomäne kovalent oder nichtkovalent mit dem gespaltenen Liganden assoziiert bleibt3. Mehrere Studien haben gezeigt, dass die Prodomäne nicht nur die Ligandenfaltung vor der Spaltung4,5leitet, sondern auch die Stabilität des Wachstumsfaktors und den Wirkungsbereich6,7,8,9, die Bildung von Homodimeren oder Heterodimeren10antreiben , den Liganden in der extrazellulären Matrix verankern kann, um die Ligandenlatenz11 aufrechtzuerhalten, und in einigen Fällen als eigenständiger Ligand fungieren, um heterologe zu aktivieren Signalisierung12. Heterozygote Punktmutationen innerhalb der Prodomäne vieler Mitglieder der Tgfß-Familie sind beim Menschen mit Augen-, Knochen-, Nieren-, Skelett- oder anderen Defekten assoziiert3. Diese Ergebnisse unterstreichen die entscheidende Rolle der Prododomäne bei der Erzeugung und Aufrechterhaltung eines aktiven Liganden und betonen die Bedeutung der Identifizierung und Entschlüsselung der Rolle von Spaltprodukten, die während der proteolytischen Reifung von Vorläufern der Tgfß-Familie entwickelt wurden.
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für das Absaugen von Spaltprodukten, die bei der Reifung von Vorläufern der Tgfß-Familie aus der Blastokoele von X. laevis-Embryonen entstehen, und deren anschließende Analyse an Immunoblots. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein oder mehrere PC-Konsensmotive in einem Vorläuferprotein in vivo10,13gespalten sind , die endogenen PC(s) zu identifizieren, die jedesMotiv 13,14spalten , in vivo die Bildung von Homodimeren der Tgfß-Familie im Vergleich zu Heterodimeren10 zu vergleichen oder zu analysieren, ob menschliche krankheitsbedingte Punktmutationen in Tgfß-Vorläufern ihre Fähigkeit zur Bildung funktioneller Dimerliganden beeinflussen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Hauptvorteile des hier beschriebenen Protokolls sind, dass es relativ schnell abgeschlossen werden kann, keine teuren Reagenzien benötigt und unter physiologischen Bedingungen eine Quelle für konzentrierte Tgfß-Spaltprodukte bietet. Ein weiterer Vorteil ist, dass es erlaubt, epitop-markierte Proteine zu analysieren und so den Mangel an kommerziell erhältlichen Antikörpern zu umgehen, die die meisten Prodomainen der Tgfß-Familie erkennen. Obwohl es auch möglich ist, die Spaltung von epitop-markierten Tgfß-Vorl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Mary Sanchez für die hervorragende Tierpflege. Die Forschung der Autoren wird vom National Institute of Child Health and Human Development der National Institutes of Health (NIH / NICHD) unterstützt, die R01HD067473-08 und R21 HD102668-01 und das National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK / NIH) R01DK128068-01 gewähren.
Materials
| ß-mercaptoethanol | Fisher | AC125470100 | |
| Bromophenol Blue | Fisher | B392-5 | |
| Calcium Chloride | Fisher | C79-500 | |
| Calcium Nitrate | Fisher | C109-500 | |
| Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder | Fisher | 12-141-364 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science tools | 11251-10 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F9378-500G | |
| Glass capillary, 1 X 90 mm | Narshige | G-1 | |
| Glycerol | Fisher | G33-4 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| Human chorionic gonadotropin | Sigma Aldrich | CG10-10VL | |
| Injection Syringe, 1 mL | Fisher | 8881501368 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Needle, 26 G | Fisher | 305111 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140148 | |
| Picoliter Microinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Pipette Puller | Narashige | PC-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | |
| PVDF Membrane | Sigma Aldrich | IPVH00010 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | S233-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S271-10 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher | S318-500 | |
| Tricaine-S | Pentair | TRS5 | |
| Tris | Fisher | BP152-5 |
References
- Harrison, C. A., Al-Musawi, S. L., Walton, K. L. Prodomains regulate the synthesis, extracellular localisation and activity of TGF-beta superfamily ligands. Growth Factors. 29 (5), 174-186 (2011).
- Gray, A. M., Mason, A. J. Requirement for activin A and transforming growth factor–beta 1 pro-regions in homodimer assembly. Science. 247 (4948), 1328-1330 (1990).
- Constam, D. B. Regulation of TGFbeta and related signals by precursor processing. Seminars in Cell and Developmental Biology. 32, 85-97 (2014).
- Wang, X., Fischer, G., Hyvonen, M. Structure and activation of pro-activin A. Nature Communications. 7, 12052 (2016).
- Zhao, B., Xu, S., Dong, X., Lu, C., Springer, T. A. Prodomain-growth factor swapping in the structure of pro-TGF-beta1. Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1579-1589 (2018).
- Cui, Y., et al. The activity and signaling range of mature BMP-4 is regulated by sequential cleavage at two sites within the prodomain of the precursor. Genes & Development. 15 (21), 2797-2802 (2001).
- Goldman, D. C., et al. Mutation of an upstream cleavage site in the BMP4 prodomain leads to tissue-specific loss of activity. Development. 133 (10), 1933-1942 (2006).
- Le Good, J. A., et al. Nodal stability determines signaling range. Current Biology. 15 (1), 31-36 (2005).
- Tilak, A., et al. Simultaneous rather than ordered cleavage of two sites within the BMP4 prodomain leads to loss of ligand in mice. Development. 141 (15), 3062-3071 (2014).
- Neugebauer, J. M., et al. The prodomain of BMP4 is necessary and sufficient to generate stable BMP4/7 heterodimers with enhanced bioactivity in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (18), 2307-2316 (2015).
- Robertson, I. B., Rifkin, D. B. Regulation of the Bioavailability of TGF-beta and TGF-beta-Related Proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (6), 355-372 (2016).
- Zhou, F., et al. GDF6-CD99 Signaling Regulates Src and Ewing Sarcoma Growth. Cell Reports. 33, 108332 (2020).
- Nelsen, S. M., Christian, J. L. Site-specific cleavage of BMP4 by furin, PC6, and PC7. Journal of Biological Chemistry. 284 (40), 27157-27166 (2009).
- Birsoy, B., et al. XPACE4 is a localized pro-protein convertase required for mesoderm induction and the cleavage of specific TGFbeta proteins in Xenopus development. Development. 132 (3), 591-602 (2005).
- Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods Mol Biol. 770, 55-75 (2011).
- Nelsen, S., Berg, L., Wong, C., Christian, J. L. Proprotein convertase genes in Xenopus development. Developmental Dynamics. 233 (3), 1038-1044 (2005).
- Constam, D. B., Robertson, E. J. Regulation of bone morphogenetic protein activity by pro domains and proprotein convertases. Journal of Cell Biology. 144 (1), 139-149 (1999).
- Sopory, S., Nelsen, S. M., Degnin, C., Wong, C., Christian, J. L. Regulation of bone morphogenetic protein-4 activity by sequence elements within the prodomain. Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34021-34031 (2006).
- Sopory, S., Christian, J. L., Whitman, M. A., Whitman, S. . Analysis of Growth Factor Signaling in Embryos. , 38-55 (2006).
- Kim, H. S., McKnite, A., Christian, J. L. Proteolytic Activation of Bmps: Analysis of Cleavage in Xenopus Oocytes and Embryos. Methods in Molecular Biology. 1891, 115-133 (2019).
- Degnin, C., Jean, F., Thomas, G., Christian, J. L. Cleavages within the prodomain direct intracellular trafficking and degradation of mature bone morphogenetic protein-4. Molecular Biology of the Cell. 15 (11), 5012-5020 (2004).
