Summary

Analyse der Umwandlung von Wachstumsfaktor ß Familie Spaltungsprodukte, die in die Blastokoele von Xenopus laevis Embryonen sezerniert werden

Published: July 21, 2021
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Summary

Wenn Transforming Growth Factor ß-Familie Vorläuferproteine in Xenopus laevis-Embryonen ektopisch exprimiert werden, dimerisieren, gespalten werden und in die Blastokoele sezerniert werden, die von der späten Blastula bis zur frühen Gastrula beginnt. Wir beschreiben eine Methode zum Absaugen von Spaltprodukten aus der Blastokoele-Höhle für die Immunoblot-Analyse.

Abstract

Die beiden Arme der Transforming Growth Factor ß (Tgfß) Superfamilie, vertreten durch Tgfß/Nodal bzw. Bone Morphogenetic Protein (Bmp) Liganden, spielen eine wesentliche Rolle bei der Embryonalentwicklung und der adulten Homöostase. Mitglieder der Tgfß-Familie werden als inaktive Vorläufer hergestellt, die innerhalb des endoplasmatischen Retikulums dimerisieren und falten. Der Vorläufer wird anschließend in Liganden- und Prodomänenfragmente gespalten. Obwohl nur der Dimerligand Tgfß-Rezeptoren aktivieren und die nachgeschaltete Signalübertragung aktivieren kann, wächst die Erkenntnis, dass der Prodomänen-Anteil zur Ligandenaktivität beiträgt. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll, mit dem Spaltungsprodukte identifiziert werden können, die bei der Aktivierung von Tgfß-Vorläuferproteinen entstehen. RNA-kodierende Tgfß-Vorläufer werden zunächst in X. laevis-Embryonen mikroinjektiert. Am folgenden Tag werden Spaltprodukte aus der Blastokoele von Embryonen im Gastrula-Stadium gesammelt und an Western Blots analysiert. Dieses Protokoll kann relativ schnell abgeschlossen werden, benötigt keine teuren Reagenzien und bietet eine Quelle für konzentrierte Tgfß-Spaltprodukte unter physiologischen Bedingungen.

Introduction

Mitglieder der Superfamilie Transforming Growth Factor ß (Tgfß) werden als inaktive, dimerisierte Vorläuferproteine synthetisiert. Die Vorläufer werden dann von Mitgliedern der Proprotein-Convertase-Familie (PC) gespalten, entweder innerhalb des sekretorischen Weges oder außerhalb der Zellen. Dadurch entstehen ein aktives, disulfidgebundenes Ligandendimer und zwei Prodomänenfragmente1. Obwohl seit über 30 Jahren bekannt ist, dass die Prodomäne der Vorläufer der Tgfß-Familie benötigt wird, um einen aktiven Liganden2zu erzeugen, ist das Verständnis, wie Prodomänen zur Ligandenfunktion beitragen, unvollständig.

Obwohl das Verständnis des Prozesses der proteolytischen Aktivierung von Mitgliedern der Tgfß-Familie unvollständig bleibt, besteht ein zunehmendes Interesse daran zu verstehen, welche PC-Konsensmotive in vivogespalten werden, ob die Spaltung in einem bestimmten subzellulären oder extrazellulären Kompartiment auftritt und ob die Prodomäne kovalent oder nichtkovalent mit dem gespaltenen Liganden assoziiert bleibt3. Mehrere Studien haben gezeigt, dass die Prodomäne nicht nur die Ligandenfaltung vor der Spaltung4,5leitet, sondern auch die Stabilität des Wachstumsfaktors und den Wirkungsbereich6,7,8,9, die Bildung von Homodimeren oder Heterodimeren10antreiben , den Liganden in der extrazellulären Matrix verankern kann, um die Ligandenlatenz11 aufrechtzuerhalten, und in einigen Fällen als eigenständiger Ligand fungieren, um heterologe zu aktivieren Signalisierung12. Heterozygote Punktmutationen innerhalb der Prodomäne vieler Mitglieder der Tgfß-Familie sind beim Menschen mit Augen-, Knochen-, Nieren-, Skelett- oder anderen Defekten assoziiert3. Diese Ergebnisse unterstreichen die entscheidende Rolle der Prododomäne bei der Erzeugung und Aufrechterhaltung eines aktiven Liganden und betonen die Bedeutung der Identifizierung und Entschlüsselung der Rolle von Spaltprodukten, die während der proteolytischen Reifung von Vorläufern der Tgfß-Familie entwickelt wurden.

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für das Absaugen von Spaltprodukten, die bei der Reifung von Vorläufern der Tgfß-Familie aus der Blastokoele von X. laevis-Embryonen entstehen, und deren anschließende Analyse an Immunoblots. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein oder mehrere PC-Konsensmotive in einem Vorläuferprotein in vivo10,13gespalten sind , die endogenen PC(s) zu identifizieren, die jedesMotiv 13,14spalten , in vivo die Bildung von Homodimeren der Tgfß-Familie im Vergleich zu Heterodimeren10 zu vergleichen oder zu analysieren, ob menschliche krankheitsbedingte Punktmutationen in Tgfß-Vorläufern ihre Fähigkeit zur Bildung funktioneller Dimerliganden beeinflussen.

Protocol

Alle beschriebenen Verfahren sind vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Utah genehmigt. Frösche sind in einer IACUC-zugelassenen Einrichtung untergebracht. Männliche Frösche werden durch Eintauchen in Tricain eingeschläfert, indem der Ventrikel des Herzens abgeschnitten wird. Weibliche Frösche werden nach hormoneller Induktion des Laichens für maximal 24 Stunden im Labor untergebracht, um die Eizellentnahme zu ermöglichen, und dann in die Pflegeeinrichtung zurückgebracht. <…

Representative Results

Das unten beschriebene Ziel des Experiments war es, festzustellen, ob Bmp4 und Bmp7 Heterodimere (Dimere, die aus einem Bmp4-Liganden und einem Bmp7-Liganden bestehen), Homodimere (bestehend aus zwei Bmp4- oder zwei Bmp7-Liganden) oder eine Mischung aus jedem bilden, wenn sie in X. laevis co-exprimiert werden. Die in Abbildung 2 gezeigten Daten stammen aus einer zuvor veröffentlichten Studie10. Abbildung 2A ist ein Schema, das S…

Discussion

Die Hauptvorteile des hier beschriebenen Protokolls sind, dass es relativ schnell abgeschlossen werden kann, keine teuren Reagenzien benötigt und unter physiologischen Bedingungen eine Quelle für konzentrierte Tgfß-Spaltprodukte bietet. Ein weiterer Vorteil ist, dass es erlaubt, epitop-markierte Proteine zu analysieren und so den Mangel an kommerziell erhältlichen Antikörpern zu umgehen, die die meisten Prodomainen der Tgfß-Familie erkennen. Obwohl es auch möglich ist, die Spaltung von epitop-markierten Tgfß-Vorl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Mary Sanchez für die hervorragende Tierpflege. Die Forschung der Autoren wird vom National Institute of Child Health and Human Development der National Institutes of Health (NIH / NICHD) unterstützt, die R01HD067473-08 und R21 HD102668-01 und das National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK / NIH) R01DK128068-01 gewähren.

Materials

ß-mercaptoethanol Fisher AC125470100
Bromophenol Blue Fisher B392-5
Calcium Chloride Fisher C79-500
Calcium Nitrate Fisher C109-500
Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder Fisher 12-141-364
Dumont #5 forceps Fine Science tools 11251-10
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150H
Ficoll 400 Sigma Aldrich F9378-500G
Glass capillary, 1 X 90 mm Narshige G-1
Glycerol Fisher G33-4
HEPES Fisher BP310-500
Human chorionic gonadotropin Sigma Aldrich CG10-10VL
Injection Syringe, 1 mL Fisher 8881501368
L-Cysteine Sigma Aldrich C7352
Magnesium Sulfate Fisher M63-500
Needle, 26 G Fisher 305111
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140148
Picoliter Microinjector Warner Instruments PLI-100A
Pipette Puller Narashige PC-100
Potassium Chloride Fisher P217-500
PVDF Membrane Sigma Aldrich IPVH00010
Sodium Bicarbonate Fisher S233-500
Sodium Chloride Fisher S271-10
Sodium Dodecyl Sulfate Fisher BP166-500
Sodium Hydroxide Fisher S318-500
Tricaine-S Pentair TRS5
Tris Fisher BP152-5

References

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Cite This Article
Kim, H., Christian, J. L. Analysis of Transforming Growth Factor ß Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos. J. Vis. Exp. (173), e62782, doi:10.3791/62782 (2021).

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