Xenopus laevis Embriyolarının Blastocoele'sine Salgılanan Dönüşüm Faktörü ß Aile Bölünmesi Ürünlerinin Analizi
Summary
Büyüme Faktörü ß aile öncül proteinlerinin dönüştürülmesi Xenopus laevis embriyolarında ektopik olarak ifade edildiğinde, küçülürler, bölünürler ve erken gastrula aşamasına geç blastülde başlayan blastokoele salgılanırlar. İmmünoblot analizi için blastocoele boşluğundan dekolte ürünlerini aspire etmek için bir yöntem açıklıyoruz.
Abstract
Sırasıyla Tgfß/Nodal veya Bone morfogenetik protein (Bmp) ligandları tarafından temsil edilen Transforming Growth Factor ß (Tgfß) süper familyasının iki kolu embriyonik gelişim ve yetişkin homeostazında önemli roller oynar. Tgfß ailesinin üyeleri, endoplazmik reticulum içinde küçülen ve katlanan etkin olmayan öncüller olarak yapılır. Öncü daha sonra ligand ve prodomain parçalarına bölünür. Sadece dimerik ligand Tgfß reseptörlerini çalıştırabilse ve aşağı akış sinyalini etkinleştirebilse de, prodomain moiety’nin ligand aktivitesine katkıda bulunduğu giderek artan bir tanıma vardır. Bu makalede, Tgfß öncül proteinlerinin aktivasyonu sırasında oluşturulan bölünme ürünlerini tanımlamak için kullanılabilecek bir protokol açıklanmaktadır. RNA kodlama Tgfß öncülleri ilk olarak X. laevis embriyolarına mikroenjected edilir. Ertesi gün, gastrula evre embriyolarının blastokoelesinden dekolte ürünleri toplanır ve Batı lekeleri üzerinde analiz edilir. Bu protokol nispeten hızlı bir şekilde tamamlanabilir, pahalı reaktifler gerektirmez ve fizyolojik koşullar altında konsantre Tgfß dekolte ürünleri kaynağı sağlar.
Introduction
Transforming Growth Factor ß (Tgfß) süper aile üyeleri aktif olmayan, küçültücü öncül proteinler olarak sentezlenir. Öncüller daha sonra proprotein convertase (PC) ailesinin üyeleri tarafından salgı yolu içinde veya hücrelerin dışında bölünür. Bu aktif, disülfid bağlı ligand dimer ve iki prodomain parçaları oluşturur1. 30 yılı aşkın bir süredir bilinmesine rağmen, Tgfß ailesinin öncüllerinin prodomaininin aktif bir ligand oluşturmak için gerekli olduğuve 2, prodomainlerin ligand işlevine nasıl katkıda bulunduğuna dair anlayış eksiktir.
Tgfß aile üyelerinin proteolitik aktivasyonu sürecinin anlaşılması eksik kalsa da,hangi PC konsensüs motiflerinin vivo olarak bölündüğünü , dekoltenin belirli bir hücre altı veya hücre dışı bölmede gerçekleşip gerçekleşmediğini ve prodomain’in bölünen ligand3ile birlikte tutarlı veya yaygın olmayan bir şekilde kalıp kalmadığını anlamaya olan ilgi artmaktadır. Çeşitli çalışmalar, prodomain’in sadece4,5bölünmeden önce ligand katlamayı yönlendirdiğinideğil,aynı zamanda büyüme faktörü stabilitesini ve eylem aralığını da etkileyebileceğini göstermiştir 6,7,8,9, homodimer veya heterodimers oluşumunu yönlendirir10, ligand gecikmesini korumak için ligand’ı hücre dışı matrise tutturmak11ve bazı durumlarda, heterologu etkinleştirmek için kendi başına bir ligand işlevi görmek sinyal12. Tgfß ailesinin birçok üyesinin prodomain içindeki heterozipöz nokta mutasyonları, insanlarda göz, kemik, böbrek, iskelet veya diğer kusurlarla ilişkilidir3. Bu bulgular, prodomain’in aktif bir ligand oluşturma ve sürdürmedeki kritik rolünü vurgulamakta ve Tgfß ailesinin öncüllerinin proteolitik olgunlaşması sırasında geliştirilen dekolte ürünlerinin rolünün tanımlanması ve deşifre edilmesi önemini vurgulamaktadır.
Burada, X. laevis embriyolarının blastokoele’sinden Tgfß ailesi öncüllerinin olgunlaşması sırasında üretilen ve daha sonra immünoblotlarda analiz edilen dekolte ürünlerinin aspirasyonu için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, öncül proteindeki bir veya daha fazla PC konsensüs motifinin in vivo10 ,13,her motifi13,14’ü ayıran endojen PC’leri tanımlayıp ayırmadığını belirlemek içinkullanılabilir., Tgfß ailesi homodimerlerinin in vivo oluşumunu heterodimerler10 ile karşılaştırın veya Tgfß öncüllerindeki insan hastalığı ilişkili nokta mutasyonlarının fonksiyonel dimerik ligand oluşturma yeteneklerini etkileyip etkilemediğini analiz edin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokolün temel avantajları, nispeten hızlı bir şekilde tamamlanabilmesi, pahalı reaktifler gerektirmemesi ve fizyolojik koşullar altında konsantre Tgfß dekolte ürünleri kaynağı sağlamasıdır. Başka bir avantaj, epitop etiketli proteinleri analiz etmesine izin etmesi ve böylece çoğu Tgfß ailesi prodomainini tanıyan ticari olarak mevcut antikorların eksikliğini atlatmasıdır. Transfected kültürlü memeli hücrelerinde epitop etiketli Tgfß öncül proteinlerinin bölünmesini …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mary Sanchez’e mükemmel hayvan bakımı için teşekkür ederiz. Yazarların araştırmaları, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsani Gelişme Enstitüsü (NIH/NICHD) tarafından R01HD067473-08 ve R21 HD102668-01 ve Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü (NIDDK/NIH) hibe R01DK128068-01 tarafından desteklenmektedir.
Materials
| ß-mercaptoethanol | Fisher | AC125470100 | |
| Bromophenol Blue | Fisher | B392-5 | |
| Calcium Chloride | Fisher | C79-500 | |
| Calcium Nitrate | Fisher | C109-500 | |
| Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder | Fisher | 12-141-364 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science tools | 11251-10 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F9378-500G | |
| Glass capillary, 1 X 90 mm | Narshige | G-1 | |
| Glycerol | Fisher | G33-4 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| Human chorionic gonadotropin | Sigma Aldrich | CG10-10VL | |
| Injection Syringe, 1 mL | Fisher | 8881501368 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Needle, 26 G | Fisher | 305111 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140148 | |
| Picoliter Microinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Pipette Puller | Narashige | PC-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | |
| PVDF Membrane | Sigma Aldrich | IPVH00010 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | S233-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S271-10 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher | S318-500 | |
| Tricaine-S | Pentair | TRS5 | |
| Tris | Fisher | BP152-5 |
References
- Harrison, C. A., Al-Musawi, S. L., Walton, K. L. Prodomains regulate the synthesis, extracellular localisation and activity of TGF-beta superfamily ligands. Growth Factors. 29 (5), 174-186 (2011).
- Gray, A. M., Mason, A. J. Requirement for activin A and transforming growth factor–beta 1 pro-regions in homodimer assembly. Science. 247 (4948), 1328-1330 (1990).
- Constam, D. B. Regulation of TGFbeta and related signals by precursor processing. Seminars in Cell and Developmental Biology. 32, 85-97 (2014).
- Wang, X., Fischer, G., Hyvonen, M. Structure and activation of pro-activin A. Nature Communications. 7, 12052 (2016).
- Zhao, B., Xu, S., Dong, X., Lu, C., Springer, T. A. Prodomain-growth factor swapping in the structure of pro-TGF-beta1. Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1579-1589 (2018).
- Cui, Y., et al. The activity and signaling range of mature BMP-4 is regulated by sequential cleavage at two sites within the prodomain of the precursor. Genes & Development. 15 (21), 2797-2802 (2001).
- Goldman, D. C., et al. Mutation of an upstream cleavage site in the BMP4 prodomain leads to tissue-specific loss of activity. Development. 133 (10), 1933-1942 (2006).
- Le Good, J. A., et al. Nodal stability determines signaling range. Current Biology. 15 (1), 31-36 (2005).
- Tilak, A., et al. Simultaneous rather than ordered cleavage of two sites within the BMP4 prodomain leads to loss of ligand in mice. Development. 141 (15), 3062-3071 (2014).
- Neugebauer, J. M., et al. The prodomain of BMP4 is necessary and sufficient to generate stable BMP4/7 heterodimers with enhanced bioactivity in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (18), 2307-2316 (2015).
- Robertson, I. B., Rifkin, D. B. Regulation of the Bioavailability of TGF-beta and TGF-beta-Related Proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (6), 355-372 (2016).
- Zhou, F., et al. GDF6-CD99 Signaling Regulates Src and Ewing Sarcoma Growth. Cell Reports. 33, 108332 (2020).
- Nelsen, S. M., Christian, J. L. Site-specific cleavage of BMP4 by furin, PC6, and PC7. Journal of Biological Chemistry. 284 (40), 27157-27166 (2009).
- Birsoy, B., et al. XPACE4 is a localized pro-protein convertase required for mesoderm induction and the cleavage of specific TGFbeta proteins in Xenopus development. Development. 132 (3), 591-602 (2005).
- Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods Mol Biol. 770, 55-75 (2011).
- Nelsen, S., Berg, L., Wong, C., Christian, J. L. Proprotein convertase genes in Xenopus development. Developmental Dynamics. 233 (3), 1038-1044 (2005).
- Constam, D. B., Robertson, E. J. Regulation of bone morphogenetic protein activity by pro domains and proprotein convertases. Journal of Cell Biology. 144 (1), 139-149 (1999).
- Sopory, S., Nelsen, S. M., Degnin, C., Wong, C., Christian, J. L. Regulation of bone morphogenetic protein-4 activity by sequence elements within the prodomain. Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34021-34031 (2006).
- Sopory, S., Christian, J. L., Whitman, M. A., Whitman, S. . Analysis of Growth Factor Signaling in Embryos. , 38-55 (2006).
- Kim, H. S., McKnite, A., Christian, J. L. Proteolytic Activation of Bmps: Analysis of Cleavage in Xenopus Oocytes and Embryos. Methods in Molecular Biology. 1891, 115-133 (2019).
- Degnin, C., Jean, F., Thomas, G., Christian, J. L. Cleavages within the prodomain direct intracellular trafficking and degradation of mature bone morphogenetic protein-4. Molecular Biology of the Cell. 15 (11), 5012-5020 (2004).
