Summary

Xenopus laevis Embriyolarının Blastocoele'sine Salgılanan Dönüşüm Faktörü ß Aile Bölünmesi Ürünlerinin Analizi

Published: July 21, 2021
doi:

Summary

Büyüme Faktörü ß aile öncül proteinlerinin dönüştürülmesi Xenopus laevis embriyolarında ektopik olarak ifade edildiğinde, küçülürler, bölünürler ve erken gastrula aşamasına geç blastülde başlayan blastokoele salgılanırlar. İmmünoblot analizi için blastocoele boşluğundan dekolte ürünlerini aspire etmek için bir yöntem açıklıyoruz.

Abstract

Sırasıyla Tgfß/Nodal veya Bone morfogenetik protein (Bmp) ligandları tarafından temsil edilen Transforming Growth Factor ß (Tgfß) süper familyasının iki kolu embriyonik gelişim ve yetişkin homeostazında önemli roller oynar. Tgfß ailesinin üyeleri, endoplazmik reticulum içinde küçülen ve katlanan etkin olmayan öncüller olarak yapılır. Öncü daha sonra ligand ve prodomain parçalarına bölünür. Sadece dimerik ligand Tgfß reseptörlerini çalıştırabilse ve aşağı akış sinyalini etkinleştirebilse de, prodomain moiety’nin ligand aktivitesine katkıda bulunduğu giderek artan bir tanıma vardır. Bu makalede, Tgfß öncül proteinlerinin aktivasyonu sırasında oluşturulan bölünme ürünlerini tanımlamak için kullanılabilecek bir protokol açıklanmaktadır. RNA kodlama Tgfß öncülleri ilk olarak X. laevis embriyolarına mikroenjected edilir. Ertesi gün, gastrula evre embriyolarının blastokoelesinden dekolte ürünleri toplanır ve Batı lekeleri üzerinde analiz edilir. Bu protokol nispeten hızlı bir şekilde tamamlanabilir, pahalı reaktifler gerektirmez ve fizyolojik koşullar altında konsantre Tgfß dekolte ürünleri kaynağı sağlar.

Introduction

Transforming Growth Factor ß (Tgfß) süper aile üyeleri aktif olmayan, küçültücü öncül proteinler olarak sentezlenir. Öncüller daha sonra proprotein convertase (PC) ailesinin üyeleri tarafından salgı yolu içinde veya hücrelerin dışında bölünür. Bu aktif, disülfid bağlı ligand dimer ve iki prodomain parçaları oluşturur1. 30 yılı aşkın bir süredir bilinmesine rağmen, Tgfß ailesinin öncüllerinin prodomaininin aktif bir ligand oluşturmak için gerekli olduğuve 2, prodomainlerin ligand işlevine nasıl katkıda bulunduğuna dair anlayış eksiktir.

Tgfß aile üyelerinin proteolitik aktivasyonu sürecinin anlaşılması eksik kalsa da,hangi PC konsensüs motiflerinin vivo olarak bölündüğünü , dekoltenin belirli bir hücre altı veya hücre dışı bölmede gerçekleşip gerçekleşmediğini ve prodomain’in bölünen ligand3ile birlikte tutarlı veya yaygın olmayan bir şekilde kalıp kalmadığını anlamaya olan ilgi artmaktadır. Çeşitli çalışmalar, prodomain’in sadece4,5bölünmeden önce ligand katlamayı yönlendirdiğinideğil,aynı zamanda büyüme faktörü stabilitesini ve eylem aralığını da etkileyebileceğini göstermiştir 6,7,8,9, homodimer veya heterodimers oluşumunu yönlendirir10, ligand gecikmesini korumak için ligand’ı hücre dışı matrise tutturmak11ve bazı durumlarda, heterologu etkinleştirmek için kendi başına bir ligand işlevi görmek sinyal12. Tgfß ailesinin birçok üyesinin prodomain içindeki heterozipöz nokta mutasyonları, insanlarda göz, kemik, böbrek, iskelet veya diğer kusurlarla ilişkilidir3. Bu bulgular, prodomain’in aktif bir ligand oluşturma ve sürdürmedeki kritik rolünü vurgulamakta ve Tgfß ailesinin öncüllerinin proteolitik olgunlaşması sırasında geliştirilen dekolte ürünlerinin rolünün tanımlanması ve deşifre edilmesi önemini vurgulamaktadır.

Burada, X. laevis embriyolarının blastokoele’sinden Tgfß ailesi öncüllerinin olgunlaşması sırasında üretilen ve daha sonra immünoblotlarda analiz edilen dekolte ürünlerinin aspirasyonu için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, öncül proteindeki bir veya daha fazla PC konsensüs motifinin in vivo10 ,13,her motifi13,14’ü ayıran endojen PC’leri tanımlayıp ayırmadığını belirlemek içinkullanılabilir., Tgfß ailesi homodimerlerinin in vivo oluşumunu heterodimerler10 ile karşılaştırın veya Tgfß öncüllerindeki insan hastalığı ilişkili nokta mutasyonlarının fonksiyonel dimerik ligand oluşturma yeteneklerini etkileyip etkilemediğini analiz edin.

Protocol

Açıklanan tüm prosedürler Utah Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Kurbağalar IACUC onaylı bir tesiste barındırılıyor. Erkek kurbağalar, kalbin ventrikülünü kırparak trikaine daldırarak ötenaziye tabi tökezlenir. Dişi kurbağalar, yumurta toplanmasına izin vermek için yumurtlamanın hormonal indüksiyonunu takiben laboratuvarda en fazla 24 saat boyunca barındırır ve daha sonra bakım tesisine geri döner. 1. <em…

Representative Results

Deneyin aşağıda açıklanan amacı, Bmp4 ve Bmp7’nin heterodimer (bir Bmp4 ligand ve bir Bmp7 ligand’dan oluşan dimerler), homodimerler (iki Bmp4 veya iki Bmp7 ligand’dan oluşan) veya X. laevis ile birlikte ifade edildiklerinde her birinin bir karışımını mı oluşturduğunu belirlemekti. Şekil 2’de gösterilen veriler daha önce yayınlanmış bir çalışmadan çıkarılır10. Şekil 2A, Bmp4 veya Bmp7 homodimerik ön…

Discussion

Burada açıklanan protokolün temel avantajları, nispeten hızlı bir şekilde tamamlanabilmesi, pahalı reaktifler gerektirmemesi ve fizyolojik koşullar altında konsantre Tgfß dekolte ürünleri kaynağı sağlamasıdır. Başka bir avantaj, epitop etiketli proteinleri analiz etmesine izin etmesi ve böylece çoğu Tgfß ailesi prodomainini tanıyan ticari olarak mevcut antikorların eksikliğini atlatmasıdır. Transfected kültürlü memeli hücrelerinde epitop etiketli Tgfß öncül proteinlerinin bölünmesini …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Mary Sanchez’e mükemmel hayvan bakımı için teşekkür ederiz. Yazarların araştırmaları, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsani Gelişme Enstitüsü (NIH/NICHD) tarafından R01HD067473-08 ve R21 HD102668-01 ve Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü (NIDDK/NIH) hibe R01DK128068-01 tarafından desteklenmektedir.

Materials

ß-mercaptoethanol Fisher AC125470100
Bromophenol Blue Fisher B392-5
Calcium Chloride Fisher C79-500
Calcium Nitrate Fisher C109-500
Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder Fisher 12-141-364
Dumont #5 forceps Fine Science tools 11251-10
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150H
Ficoll 400 Sigma Aldrich F9378-500G
Glass capillary, 1 X 90 mm Narshige G-1
Glycerol Fisher G33-4
HEPES Fisher BP310-500
Human chorionic gonadotropin Sigma Aldrich CG10-10VL
Injection Syringe, 1 mL Fisher 8881501368
L-Cysteine Sigma Aldrich C7352
Magnesium Sulfate Fisher M63-500
Needle, 26 G Fisher 305111
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140148
Picoliter Microinjector Warner Instruments PLI-100A
Pipette Puller Narashige PC-100
Potassium Chloride Fisher P217-500
PVDF Membrane Sigma Aldrich IPVH00010
Sodium Bicarbonate Fisher S233-500
Sodium Chloride Fisher S271-10
Sodium Dodecyl Sulfate Fisher BP166-500
Sodium Hydroxide Fisher S318-500
Tricaine-S Pentair TRS5
Tris Fisher BP152-5

References

  1. Harrison, C. A., Al-Musawi, S. L., Walton, K. L. Prodomains regulate the synthesis, extracellular localisation and activity of TGF-beta superfamily ligands. Growth Factors. 29 (5), 174-186 (2011).
  2. Gray, A. M., Mason, A. J. Requirement for activin A and transforming growth factor–beta 1 pro-regions in homodimer assembly. Science. 247 (4948), 1328-1330 (1990).
  3. Constam, D. B. Regulation of TGFbeta and related signals by precursor processing. Seminars in Cell and Developmental Biology. 32, 85-97 (2014).
  4. Wang, X., Fischer, G., Hyvonen, M. Structure and activation of pro-activin A. Nature Communications. 7, 12052 (2016).
  5. Zhao, B., Xu, S., Dong, X., Lu, C., Springer, T. A. Prodomain-growth factor swapping in the structure of pro-TGF-beta1. Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1579-1589 (2018).
  6. Cui, Y., et al. The activity and signaling range of mature BMP-4 is regulated by sequential cleavage at two sites within the prodomain of the precursor. Genes & Development. 15 (21), 2797-2802 (2001).
  7. Goldman, D. C., et al. Mutation of an upstream cleavage site in the BMP4 prodomain leads to tissue-specific loss of activity. Development. 133 (10), 1933-1942 (2006).
  8. Le Good, J. A., et al. Nodal stability determines signaling range. Current Biology. 15 (1), 31-36 (2005).
  9. Tilak, A., et al. Simultaneous rather than ordered cleavage of two sites within the BMP4 prodomain leads to loss of ligand in mice. Development. 141 (15), 3062-3071 (2014).
  10. Neugebauer, J. M., et al. The prodomain of BMP4 is necessary and sufficient to generate stable BMP4/7 heterodimers with enhanced bioactivity in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (18), 2307-2316 (2015).
  11. Robertson, I. B., Rifkin, D. B. Regulation of the Bioavailability of TGF-beta and TGF-beta-Related Proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (6), 355-372 (2016).
  12. Zhou, F., et al. GDF6-CD99 Signaling Regulates Src and Ewing Sarcoma Growth. Cell Reports. 33, 108332 (2020).
  13. Nelsen, S. M., Christian, J. L. Site-specific cleavage of BMP4 by furin, PC6, and PC7. Journal of Biological Chemistry. 284 (40), 27157-27166 (2009).
  14. Birsoy, B., et al. XPACE4 is a localized pro-protein convertase required for mesoderm induction and the cleavage of specific TGFbeta proteins in Xenopus development. Development. 132 (3), 591-602 (2005).
  15. Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods Mol Biol. 770, 55-75 (2011).
  16. Nelsen, S., Berg, L., Wong, C., Christian, J. L. Proprotein convertase genes in Xenopus development. Developmental Dynamics. 233 (3), 1038-1044 (2005).
  17. Constam, D. B., Robertson, E. J. Regulation of bone morphogenetic protein activity by pro domains and proprotein convertases. Journal of Cell Biology. 144 (1), 139-149 (1999).
  18. Sopory, S., Nelsen, S. M., Degnin, C., Wong, C., Christian, J. L. Regulation of bone morphogenetic protein-4 activity by sequence elements within the prodomain. Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34021-34031 (2006).
  19. Sopory, S., Christian, J. L., Whitman, M. A., Whitman, S. . Analysis of Growth Factor Signaling in Embryos. , 38-55 (2006).
  20. Kim, H. S., McKnite, A., Christian, J. L. Proteolytic Activation of Bmps: Analysis of Cleavage in Xenopus Oocytes and Embryos. Methods in Molecular Biology. 1891, 115-133 (2019).
  21. Degnin, C., Jean, F., Thomas, G., Christian, J. L. Cleavages within the prodomain direct intracellular trafficking and degradation of mature bone morphogenetic protein-4. Molecular Biology of the Cell. 15 (11), 5012-5020 (2004).

Play Video

Cite This Article
Kim, H., Christian, J. L. Analysis of Transforming Growth Factor ß Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos. J. Vis. Exp. (173), e62782, doi:10.3791/62782 (2021).

View Video