ゼノプス・ラエビス胚の芽球に分泌される成長因子ßファミリー切断産物の分析
Summary
変容成長因子ßファミリー前駆体タンパク質が ゼノプス・ラエビス 胚で異所性発現すると、二量体化し、切断され、後期芽胞から早期胃管ステージに至るブラストコエレに分泌される。免疫ブロット解析のためのブラストコア腔から切断産物を吸引する方法について述べている。
Abstract
Tgfß/Nodalまたは骨形態形成タンパク質(Bmp)リガンドに代表されるトランスフォーム成長因子ß(Tgfß)スーパーファミリーの2つの腕は、それぞれ胚発生および成人恒常性に不可欠な役割を果たす。Tgfßファミリーのメンバーは、小胞体内で二量体化および折り畳む不活性前駆体として作られる。前駆体は、その後、リガンドおよびプロドメイン断片に切断される。二量体リガンドだけがTgfß受容体を関与させ、下流シグナル伝達を活性化することができるが、プロドメイン部分がリガンド活性に寄与するという認識が高まっている。この記事では、Tgfß前駆体タンパク質の活性化中に生成された切断産物を同定するために使用できるプロトコルについて説明します。Tgfß前駆体をコードするRNAは、まず X.ラエビス 胚にマイクロインジェクションされる。翌日、切断産物はガストルラ期胚の芽球体から採取され、ウェスタンブロットで分析される。このプロトコルは、比較的迅速に完了することができ、高価な試薬を必要とせず、生理学的条件下で濃縮Tgfß切断製品の供給源を提供します。
Introduction
トランスフォーム成長因子 ß (Tgfß) スーパーファミリーのメンバーは、非活性で二量体化された前駆体タンパク質として合成されます。前駆体は、分泌経路内または細胞外のプロプロテインコンフォーターゼ(PC)ファミリーのメンバーによって切断される。これは、活性なジスルフィド結合リガンドダイマーと2つのプロドメインフラグメント1を作成する。Tgfßファミリー前駆体のプロドメインが活性リガンド2を生成するために必要とされているのは30年以上前から知られているが、プロドメインがリガンド機能にどのように寄与するかを理解することは不完全である。
Tgfßファミリーメンバーのタンパク質分解活性化のプロセスの理解は不完全なままであるが、どのPCコンセンサスモチーフが生体内で切断されるか、切断が特定の細胞内または細胞外区画で起こるか、そしてプロドメインが切断リガンド3と共有結合的にまたは非共変に関連しているかの理解に関心が高まっている。いくつかの研究は、プロドメインが切断4、5の前にリガンド折りたたみを導くだけでなく、成長因子の安定性と作用範囲6、7、8、9に影響を与え、ホモダイマーまたはヘテロ二量体10の形成を促進し、リガンドを細胞外マトリックスに固定してリガンド遅延11を維持し、場合によっては、アガンドとして機能することを示している。 シグナリング12.Tgfßファミリーの多くのメンバーのプロドメイン内のヘテロ接合点突然変異は、ヒトの眼、骨、腎臓、骨格または他の欠陥に関連している3。これらの知見は、プロドメインが活性リガンドを生成および維持する上で重要な役割を強調し、Tgfßファミリー前駆体のタンパク質分解性成熟中に開発された切断産物の役割を同定し、解読することの重要性を強調する。
ここでは、X.ラエビス胚の芽球からTgfßファミリー前駆体の成熟中に生成された切断産物を吸引し、免疫ブロットで分析するための詳細なプロトコルについて説明する。このプロトコルは、前駆体タンパク質の1つ以上のPCコンセンサスモチーフが生体内10、13で切断されているかどうかを判断するために使用され、各モチーフ13、14を切断する内因性PCを同定し、Tgfßファミリーホモダイマー対ヘテロダイマー10の生体内形成を比較するか、またはTgfのヒト疾患関連点突然変異をTgfおよびCgのヒト疾患関連点突然変異をTgfの前駆体に対して分析する。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するプロトコルの主な利点は、比較的迅速に完了することができ、高価な試薬を必要とせず、生理学的条件下で濃縮Tgfß切断製品の供給源を提供することです。もう一つの利点は、エピトープタグ付きタンパク質を分析し、ほとんどのTgfßファミリープロドメインを認識する市販の抗体の不足を回避できることです。また、トランスフェクトされた培養哺乳動物細胞におけるエピト…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、優れた動物のケアのためにメアリー・サンチェスに感謝します。著者らの研究は、国立衛生研究所(NIH/NICHD)の国立小児保健人間開発研究所がR01HD067473-08およびR21 HD102668-01を付与し、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所(NIDDK/NIH)助成金R01DK128068-01によって支援されています。
Materials
| ß-mercaptoethanol | Fisher | AC125470100 | |
| Bromophenol Blue | Fisher | B392-5 | |
| Calcium Chloride | Fisher | C79-500 | |
| Calcium Nitrate | Fisher | C109-500 | |
| Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder | Fisher | 12-141-364 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science tools | 11251-10 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F9378-500G | |
| Glass capillary, 1 X 90 mm | Narshige | G-1 | |
| Glycerol | Fisher | G33-4 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| Human chorionic gonadotropin | Sigma Aldrich | CG10-10VL | |
| Injection Syringe, 1 mL | Fisher | 8881501368 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Needle, 26 G | Fisher | 305111 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140148 | |
| Picoliter Microinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Pipette Puller | Narashige | PC-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | |
| PVDF Membrane | Sigma Aldrich | IPVH00010 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | S233-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S271-10 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher | S318-500 | |
| Tricaine-S | Pentair | TRS5 | |
| Tris | Fisher | BP152-5 |
References
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