Analyse van transformerende groeifactor ß familiesplitsingsproducten uitgescheiden in de blastocoele van Xenopus laevis-embryo's
Summary
Wanneer Transforming Growth Factor ß familie voorloper eiwitten ectopisch tot expressie komen in Xenopus laevis embryo’s, worden ze gedimeriseerd, worden ze gesplitst en worden ze uitgescheiden in de blastocoele, die begint bij de late blastula tot vroege gastrula stadium. We beschrijven een methode voor het opzuigen van splitsingsproducten uit de blastocoeleholte voor immunoblotanalyse.
Abstract
De twee armen van de Transforming Growth Factor ß (Tgfß) superfamilie, vertegenwoordigd door respectievelijk Tgfß/Nodal of Bone morphogenetic protein (Bmp) liganden, spelen een essentiële rol in de embryonale ontwikkeling en volwassen homeostase. Leden van de Tgfß-familie worden gemaakt als inactieve voorlopers die dimeriseren en vouwen in het endoplasmatisch reticulum. De voorloper wordt vervolgens gesplitst in ligand- en prodomeinfragmenten. Hoewel alleen het dimerische ligand Tgfß-receptoren kan activeren en stroomafwaartse signalering kan activeren, is er een groeiende erkenning dat het prodomeingedeelte bijdraagt aan ligandactiviteit. In dit artikel wordt een protocol beschreven dat kan worden gebruikt om splitsingsproducten te identificeren die worden gegenereerd tijdens de activering van Tgfß-precursoreiwitten. RNA dat codeert voor Tgfß-voorlopers wordt eerst micro-geïnjecteerd in X. laevis-embryo’s. De volgende dag worden splitsingsproducten verzameld uit de blastocoele van gastrula-stadiumembryo’s en geanalyseerd op Western blots. Dit protocol kan relatief snel worden voltooid, vereist geen dure reagentia en biedt een bron van geconcentreerde Tgfß-splitsingsproducten onder fysiologische omstandigheden.
Introduction
Leden van de Transforming Growth Factor ß (Tgfß) superfamilie worden gesynthetiseerd als inactieve, gedimde voorlopereiwitten. De voorlopers worden vervolgens gesplitst door leden van de proproteïne convertase (PC) familie, hetzij binnen de secretoire route of buiten cellen. Hierdoor ontstaat een actief, disulfide-gebonden liganddimeer en twee prodomeinfragmenten1. Hoewel het al meer dan 30 jaar bekend is dat het prodomein van voorlopers van de Tgfß-familie nodig is om een actief ligand2te genereren, is het begrip van hoe prodomeinen bijdragen aan de ligandfunctie onvolledig.
Hoewel het begrip van het proces van proteolytische activering van Tgfß-familieleden onvolledig blijft, is er een toenemende belangstelling voor het begrijpen welke PC-consensusmotieven in vivoworden gesplitst, of de splitsing plaatsvindt in een specifiek subcellulair of extracellulair compartiment, en of het prodomein covalent of niet-covalent geassocieerd blijft met het gekloofde ligand3. Verschillende studies hebben aangetoond dathet prodomein niet alleen ligandvouwing vóór splitsing4, 5,maar ook de stabiliteit van de groeifactor en het actiebereik6,7,8, 9kan beïnvloeden, de vorming van homodimeren of heterodimeren10kan stimuleren, het ligand in de extracellulaire matrix kan verankeren om ligandlatentie11te behouden en in sommige gevallen als een ligand op zichzelf te functioneren om heterologe te activeren signalering12. Heterozygote puntmutaties binnen het prodomein van veel leden van de Tgfß-familie zijn geassocieerd met oog-, bot-, nier-, skelet- of andere defecten bij mensen3. Deze bevindingen benadrukken de cruciale rol van het prodomein bij het genereren en onderhouden van een actief ligand en benadrukken het belang van het identificeren en ontcijferen van de rol van splitsingsproducten die zijn ontwikkeld tijdens proteolytische rijping van Tgfß-familieprecursoren.
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het opzuigen van splitsingsproducten die worden gegenereerd tijdens de rijping van Tgfß-familieprecursoren uit de blastocoele van X. laevis-embryo’s en analyseren ze vervolgens op immunoblots. Dit protocol kan worden gebruikt om te bepalen of een of meer PC-consensusmotieven in een voorlopereiwit in vivo10,13worden gesplitst, de endogene PC(‘s) identificeren die elk motief splitsen13,14,in vivo vorming van Tgfß-familiehomodimeren versus heterodimeren10 vergelijken of analyseren of menselijke ziekte-geassocieerde puntmutaties in Tgfß-precursoren hun vermogen om functionele dimerische liganden te vormen beïnvloeden.
Protocol
Representative Results
Discussion
De belangrijkste voordelen van het hier beschreven protocol zijn dat het relatief snel kan worden voltooid, geen dure reagentia vereist en een bron van geconcentreerde Tgfß-splitsingsproducten biedt onder fysiologische omstandigheden. Een ander voordeel is dat het iemand in staat stelt om epitoop-gelabelde eiwitten te analyseren en zo het tekort aan commercieel beschikbare antilichamen te omzeilen die de meeste Tgfß-familie prodomein herkennen. Hoewel het ook mogelijk is om de splitsing van epitoop-gelabelde Tgfß-voor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Mary Sanchez voor de uitstekende verzorging van dieren. Het onderzoek van de auteurs wordt ondersteund door het National Institute of Child Health and Human Development van de National Institutes of Health (NIH / NICHD) subsidies R01HD067473-08 en R21 HD102668-01 en door het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK / NIH) subsidie R01DK128068-01.
Materials
| ß-mercaptoethanol | Fisher | AC125470100 | |
| Bromophenol Blue | Fisher | B392-5 | |
| Calcium Chloride | Fisher | C79-500 | |
| Calcium Nitrate | Fisher | C109-500 | |
| Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder | Fisher | 12-141-364 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science tools | 11251-10 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F9378-500G | |
| Glass capillary, 1 X 90 mm | Narshige | G-1 | |
| Glycerol | Fisher | G33-4 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| Human chorionic gonadotropin | Sigma Aldrich | CG10-10VL | |
| Injection Syringe, 1 mL | Fisher | 8881501368 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Needle, 26 G | Fisher | 305111 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140148 | |
| Picoliter Microinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Pipette Puller | Narashige | PC-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | |
| PVDF Membrane | Sigma Aldrich | IPVH00010 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | S233-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S271-10 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher | S318-500 | |
| Tricaine-S | Pentair | TRS5 | |
| Tris | Fisher | BP152-5 |
References
- Harrison, C. A., Al-Musawi, S. L., Walton, K. L. Prodomains regulate the synthesis, extracellular localisation and activity of TGF-beta superfamily ligands. Growth Factors. 29 (5), 174-186 (2011).
- Gray, A. M., Mason, A. J. Requirement for activin A and transforming growth factor–beta 1 pro-regions in homodimer assembly. Science. 247 (4948), 1328-1330 (1990).
- Constam, D. B. Regulation of TGFbeta and related signals by precursor processing. Seminars in Cell and Developmental Biology. 32, 85-97 (2014).
- Wang, X., Fischer, G., Hyvonen, M. Structure and activation of pro-activin A. Nature Communications. 7, 12052 (2016).
- Zhao, B., Xu, S., Dong, X., Lu, C., Springer, T. A. Prodomain-growth factor swapping in the structure of pro-TGF-beta1. Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1579-1589 (2018).
- Cui, Y., et al. The activity and signaling range of mature BMP-4 is regulated by sequential cleavage at two sites within the prodomain of the precursor. Genes & Development. 15 (21), 2797-2802 (2001).
- Goldman, D. C., et al. Mutation of an upstream cleavage site in the BMP4 prodomain leads to tissue-specific loss of activity. Development. 133 (10), 1933-1942 (2006).
- Le Good, J. A., et al. Nodal stability determines signaling range. Current Biology. 15 (1), 31-36 (2005).
- Tilak, A., et al. Simultaneous rather than ordered cleavage of two sites within the BMP4 prodomain leads to loss of ligand in mice. Development. 141 (15), 3062-3071 (2014).
- Neugebauer, J. M., et al. The prodomain of BMP4 is necessary and sufficient to generate stable BMP4/7 heterodimers with enhanced bioactivity in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (18), 2307-2316 (2015).
- Robertson, I. B., Rifkin, D. B. Regulation of the Bioavailability of TGF-beta and TGF-beta-Related Proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (6), 355-372 (2016).
- Zhou, F., et al. GDF6-CD99 Signaling Regulates Src and Ewing Sarcoma Growth. Cell Reports. 33, 108332 (2020).
- Nelsen, S. M., Christian, J. L. Site-specific cleavage of BMP4 by furin, PC6, and PC7. Journal of Biological Chemistry. 284 (40), 27157-27166 (2009).
- Birsoy, B., et al. XPACE4 is a localized pro-protein convertase required for mesoderm induction and the cleavage of specific TGFbeta proteins in Xenopus development. Development. 132 (3), 591-602 (2005).
- Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods Mol Biol. 770, 55-75 (2011).
- Nelsen, S., Berg, L., Wong, C., Christian, J. L. Proprotein convertase genes in Xenopus development. Developmental Dynamics. 233 (3), 1038-1044 (2005).
- Constam, D. B., Robertson, E. J. Regulation of bone morphogenetic protein activity by pro domains and proprotein convertases. Journal of Cell Biology. 144 (1), 139-149 (1999).
- Sopory, S., Nelsen, S. M., Degnin, C., Wong, C., Christian, J. L. Regulation of bone morphogenetic protein-4 activity by sequence elements within the prodomain. Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34021-34031 (2006).
- Sopory, S., Christian, J. L., Whitman, M. A., Whitman, S. . Analysis of Growth Factor Signaling in Embryos. , 38-55 (2006).
- Kim, H. S., McKnite, A., Christian, J. L. Proteolytic Activation of Bmps: Analysis of Cleavage in Xenopus Oocytes and Embryos. Methods in Molecular Biology. 1891, 115-133 (2019).
- Degnin, C., Jean, F., Thomas, G., Christian, J. L. Cleavages within the prodomain direct intracellular trafficking and degradation of mature bone morphogenetic protein-4. Molecular Biology of the Cell. 15 (11), 5012-5020 (2004).
