تحليل تحويل عامل النمو ß منتجات الانقسام الأسرة تفرز في Blastocoele من الأجنة Xenopus laevis
Summary
عند تحويل عامل النمو ß البروتينات السلائف الأسرة يتم التعبير عنها خارج الرحم في الأجنة Laevis Xenopus، فإنها تغمغم، والحصول على مشقوق وتفرز في blastocoele، الذي يبدأ في وقت متأخر blastula إلى مرحلة gastrula في وقت مبكر. نحن نصف طريقة لاستنشق منتجات الانقسام من تجويف الانفجار لتحليل المناعة.
Abstract
الذراعين من عامل النمو تحويل ß (Tgfß) superfamily، ممثلة Tgfß / العقدة أو العظام البروتين المورفوجيني (Bmp) ليغاندس، على التوالي، تلعب أدوارا أساسية في التنمية الجنينية وهوس العظام الكبار. يتم إجراء أعضاء الأسرة Tgfß والسلائف غير نشطة أن تتناقص وأضعاف داخل الشبكية endoplasmic. يتم شق السلائف في وقت لاحق إلى شظايا ليغاند وبروتدومين. على الرغم من أن فقط ليغاند ثنائية يمكن إشراك مستقبلات Tgfß وتفعيل الإشارات المصب، وهناك اعتراف متزايد بأن moiety prodomain يساهم في النشاط ليغاند. توضح هذه المقالة بروتوكول يمكن استخدامه لتحديد منتجات الانقسام التي تم إنشاؤها أثناء تنشيط بروتينات السلائف Tgfß. يتم أولا حقن سلائف ترميز RNA Tgfß في أجنة X. laevis. في اليوم التالي ، يتم جمع منتجات الانقسام من blastocoele من أجنة مرحلة gastrula وتحليلها على البقع الغربية. يمكن إكمال هذا البروتوكول بسرعة نسبيا، لا يتطلب الكواشف باهظة الثمن ويوفر مصدرا للمنتجات الانقسام Tgfß المركزة في ظل ظروف فسيولوجية.
Introduction
يتم تصنيع أعضاء عامل النمو التحويلي ß (Tgfß) بشكل فائق كبروتينات سلائف غير نشطة وخافتة. ثم يتم شق السلائف من قبل أعضاء عائلة تحويل البربروتين (PC) ، إما داخل المسار الافرازي أو خارج الخلايا. وهذا يخلق نشطة، disulfide المستعبدين ليغند ديمر واثنين من شظايا prodomain1. على الرغم من أنه كان معروفا لأكثر من 30 عاما أن مطلوب من السلائف الأسرة Tgfß لتوليد ليغاند نشط2, فهم كيفية prodomains المساهمة في وظيفة ليغاند غير مكتملة.
على الرغم من أن فهم عملية التنشيط البروتيوليكي لأفراد عائلة Tgfß لا يزال غير مكتمل ، إلا أن هناك اهتماما متزايدا بفهم أي عزر توافق PC (ق) مشقوق في الجسم الحي، وما إذا كان الانقسام يحدث في مقصورة فرعية أو خارج الخلية محددة ، وما إذا كان المجال الأساسي لا يزال مرتبطا بشكل متناقض أو غير متناقض مع الليغندالمشقوق 3. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن prodomain ليس فقط أدلة ليغاند للطي قبل الانقسام4,5, ولكن يمكن أيضا التأثير على استقرار عامل النمو ومجموعة من العمل6,7,8,9, محرك تشكيل homodimers أو heterodimers10, مرساة ليغاند في مصفوفة خارج الخلية للحفاظ على الكمون ليغاند11, وفي بعض الحالات, وظيفة باعتبارها ليغاند في حد ذاتها لتنشيط heterologous إشارة12. وترتبط الطفرات نقطة Heterozygous داخل نطاق العديد من أفراد الأسرة Tgfß مع العين والعظام والكلى والهيكل العظمي أو غيرها من العيوب في البشر3. تسلط هذه النتائج الضوء على الدور الحاسم للبروتودمين في توليد والحفاظ على ليغاند نشط وتشدد على أهمية تحديد وفك شفرة دور منتجات الانقسام التي تم تطويرها أثناء النضج البروتيوليكي للسلائف العائلية Tgfß.
هنا نصف بروتوكول مفصل لمنتجات شق القرصنة المتولدة أثناء نضوج السلائف الأسرة Tgfß من blastocoele من الأجنة X. laevis ومن ثم تحليلها على الخلايا المناعية. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد ما إذا كان واحد أو أكثر من عزر توافق الآراء PC (ق) في بروتين السلائف هي مشقوق في الجسم الحي10،13، وتحديد PC الذاتية (ق) التي تلتصق كل عزر13،1 14، قارن في تشكيل الجسم الحي من المثليات الأسرة Tgfß مقابل heterodimers10 أو تحليل ما إذا كانت الطفرات نقطة المرتبطة بالأمراض البشرية في السلائف Tgfß تؤثر على قدرتها على تشكيل ليغاندس ثنائية الأبعاد وظيفية.
Protocol
Representative Results
Discussion
المزايا الرئيسية للبروتوكول الموصوف هنا هي أنه يمكن إكماله بسرعة نسبية ، ولا يتطلب كاشفات باهظة الثمن ويوفر مصدرا لمنتجات شق Tgfß المركزة في ظل ظروف فسيولوجية. ميزة أخرى هي أنه يسمح للمرء بتحليل البروتينات الموسومة epitope وبالتالي التحايل على نقص الأجسام المضادة المتاحة تجاريا التي تعترف مع…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ماري سانشيز على العناية الممتازة بالحيوانات. ويدعم أبحاث المؤلفين المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية التابع للمعاهد الوطنية للصحة (NIH/NICHD) منح R01HD067473-08 وR21 HD102668-01 والمعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (NIDDK/NIH) منحة R01DK128068-01.
Materials
| ß-mercaptoethanol | Fisher | AC125470100 | |
| Bromophenol Blue | Fisher | B392-5 | |
| Calcium Chloride | Fisher | C79-500 | |
| Calcium Nitrate | Fisher | C109-500 | |
| Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder | Fisher | 12-141-364 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science tools | 11251-10 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F9378-500G | |
| Glass capillary, 1 X 90 mm | Narshige | G-1 | |
| Glycerol | Fisher | G33-4 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| Human chorionic gonadotropin | Sigma Aldrich | CG10-10VL | |
| Injection Syringe, 1 mL | Fisher | 8881501368 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Needle, 26 G | Fisher | 305111 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140148 | |
| Picoliter Microinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Pipette Puller | Narashige | PC-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | |
| PVDF Membrane | Sigma Aldrich | IPVH00010 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | S233-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S271-10 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher | S318-500 | |
| Tricaine-S | Pentair | TRS5 | |
| Tris | Fisher | BP152-5 |
References
- Harrison, C. A., Al-Musawi, S. L., Walton, K. L. Prodomains regulate the synthesis, extracellular localisation and activity of TGF-beta superfamily ligands. Growth Factors. 29 (5), 174-186 (2011).
- Gray, A. M., Mason, A. J. Requirement for activin A and transforming growth factor–beta 1 pro-regions in homodimer assembly. Science. 247 (4948), 1328-1330 (1990).
- Constam, D. B. Regulation of TGFbeta and related signals by precursor processing. Seminars in Cell and Developmental Biology. 32, 85-97 (2014).
- Wang, X., Fischer, G., Hyvonen, M. Structure and activation of pro-activin A. Nature Communications. 7, 12052 (2016).
- Zhao, B., Xu, S., Dong, X., Lu, C., Springer, T. A. Prodomain-growth factor swapping in the structure of pro-TGF-beta1. Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1579-1589 (2018).
- Cui, Y., et al. The activity and signaling range of mature BMP-4 is regulated by sequential cleavage at two sites within the prodomain of the precursor. Genes & Development. 15 (21), 2797-2802 (2001).
- Goldman, D. C., et al. Mutation of an upstream cleavage site in the BMP4 prodomain leads to tissue-specific loss of activity. Development. 133 (10), 1933-1942 (2006).
- Le Good, J. A., et al. Nodal stability determines signaling range. Current Biology. 15 (1), 31-36 (2005).
- Tilak, A., et al. Simultaneous rather than ordered cleavage of two sites within the BMP4 prodomain leads to loss of ligand in mice. Development. 141 (15), 3062-3071 (2014).
- Neugebauer, J. M., et al. The prodomain of BMP4 is necessary and sufficient to generate stable BMP4/7 heterodimers with enhanced bioactivity in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (18), 2307-2316 (2015).
- Robertson, I. B., Rifkin, D. B. Regulation of the Bioavailability of TGF-beta and TGF-beta-Related Proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (6), 355-372 (2016).
- Zhou, F., et al. GDF6-CD99 Signaling Regulates Src and Ewing Sarcoma Growth. Cell Reports. 33, 108332 (2020).
- Nelsen, S. M., Christian, J. L. Site-specific cleavage of BMP4 by furin, PC6, and PC7. Journal of Biological Chemistry. 284 (40), 27157-27166 (2009).
- Birsoy, B., et al. XPACE4 is a localized pro-protein convertase required for mesoderm induction and the cleavage of specific TGFbeta proteins in Xenopus development. Development. 132 (3), 591-602 (2005).
- Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods Mol Biol. 770, 55-75 (2011).
- Nelsen, S., Berg, L., Wong, C., Christian, J. L. Proprotein convertase genes in Xenopus development. Developmental Dynamics. 233 (3), 1038-1044 (2005).
- Constam, D. B., Robertson, E. J. Regulation of bone morphogenetic protein activity by pro domains and proprotein convertases. Journal of Cell Biology. 144 (1), 139-149 (1999).
- Sopory, S., Nelsen, S. M., Degnin, C., Wong, C., Christian, J. L. Regulation of bone morphogenetic protein-4 activity by sequence elements within the prodomain. Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34021-34031 (2006).
- Sopory, S., Christian, J. L., Whitman, M. A., Whitman, S. . Analysis of Growth Factor Signaling in Embryos. , 38-55 (2006).
- Kim, H. S., McKnite, A., Christian, J. L. Proteolytic Activation of Bmps: Analysis of Cleavage in Xenopus Oocytes and Embryos. Methods in Molecular Biology. 1891, 115-133 (2019).
- Degnin, C., Jean, F., Thomas, G., Christian, J. L. Cleavages within the prodomain direct intracellular trafficking and degradation of mature bone morphogenetic protein-4. Molecular Biology of the Cell. 15 (11), 5012-5020 (2004).
