JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

Çok Modlu Faz Değiştirme Porfirin Damlacıklarının Sentezi ve Karakterizasyonu

Published: October 15, 2021
doi:
10.3791/62665
, , , ,
1Princess Margaret Cancer Centre, 2Department of Medical Biophysics,University of Toronto, 3Philips Healthcare

Summary

Bu protokolde, çok modlu faz değişikliği porfirin damlacıklarını sentezleme ve karakterize etme yöntemleri özetlenmiştir.

Abstract

Faz değiştirme damlacıkları, yeterli akustik enerjinin uygulanmasıyla yerinde ekojenik mikrobubbles’a dönüşebilen bir ultrason kontrast ajanları sınıfıdır. Damlacıklar mikrobubble emsallerinden daha küçük ve daha kararlıdır. Bununla birlikte, geleneksel ultrason kontrast ajanları akustik geri bildirim ölçümlerinin ötesinde izlenemez, bu da kontrast maddesi biyo-dağılımını veya birikimini ölçmeyi zorlaştırır. Araştırmacılar biyo-dağılım çıkarmak için floresan veya optik emici eşlik eden tanı parçacıklarına güvenmek zorunda kalabilirler. Bu protokolün amacı, yoğuşma yöntemi kullanarak çok modlu faz değişikliği porfirin damlacıkları oluşturmak için adımları detaylandırmaktır. Porfirinler, lipitlere konjuge edilebilen ve damlacık çok yönlülüğünü genişletmek için damlacıklara dahil edilebilen ve akustik özellikleri korurken daha sağlam biyo-dağılım sağlayan farklı emiş bantlarına sahip floresan moleküllerdir. Mikrobubble ve damlacık boyutu dağılımlarını araştırmak için değişen porfirin-lipit ve baz lipit içerikli yedi formülasyon yapıldı. Porfirin içeren yapılara uygun nitelemeler, analitik çok yönlülüklerini çözüm içinde göstermek için protokolde de açıklanmıştır. Boyutlandırma, yoğunlaşma sonrası ortalama çapların öncül popülasyonlardan 1,72 ila 2,38 kat daha küçük olduğunu göstermiştir. Absorbans karakterizasyonu, bozulmamış numunelerin 671 nm’de emicilik zirvesine sahipken, sağlam montajların 700 nm Q bandı zirvesine sahip olduğunu gösterdi. Floresan karakterizasyonu bozulmamış gösterdi% 30 porfirin-lipid montajları floresan olarak söndürülür (%>97), bozulma üzerine floresan iyileşme elde edilir. Akustik buharlaşma, porfirin damlacıklarının düşük basınçlarda ekojenik olmadığını ve yeterli basınçla ekojenik mikrobubbles’a dönüştürülebileceğini göstermiştir. Bu karakterizasyonlar, porfirin damlacıklarının, in vivo veya ex vivoolarak teslimat veya terapötik uygulamalar için ultrason kontrast maddesi biyo-dağılımını ölçmek için absorbans veya floresan bazlı eşlik eden tanı stratejilerine olan ihtiyacı ortadan kaldırma potansiyelini göstermektedir.

Introduction

Ultrason görüntüleme, akustik dalgaları kullanan invaziv olmayan, iyonlaştırıcı olmayan bir tıbbi görüntüleme şeklidir. Ultrason tarayıcıları daha taşınabilir ve gerçek zamanlı görüntüler sağlayabilirken, ultrason görüntüleme düşük kontrasttan muzdarip olabilir, bu da sonografların benzer ekojenik patolojik özellikleri güvenilir bir şekilde ayırt etmesini zorlaştırır. Bu sınırlamayı önlemek için, vasküler kontrastı iyileştirmek için konaka mikrobubbles enjekte edilebilir. Mikrobubbles, akustik dalgalara karşı oldukça ekojenik olan ve gelişmiş damar kontrastı sağlayabilen mikron boyutlu gaz dolu kontrast ajanlarıdır1,2. Mikrobubbles kabukları ve gaz çekirdekleri görüntüleme, tromboliz, hücre zarı permeabilizasyonu veya geçici vasküler açıklık2gibi farklı uygulamalar için uyarlanabilir.

Mikrobubbles bir dezavantajı onların kısa dolaşım yarı ömürleridir. Örneğin, klinik olarak mevcut perflutren lipid mikroküreciklerinin sadece yarı ömrü 1,3 dakika 3 ‘tür. Uzun görüntüleme seansları için birden fazla mikrobubble enjeksiyonuna ihtiyaç vardır. Mikrobubbles bir başka dezavantajı onların büyük çaplarıdır. Perflutren lipid mikroküreçleri yaklaşık 1 ila 3 μm çapında, vaskültürde dolaşacak kadar küçük olsa da, tümörler gibi ilgi çekici dokulara ekstravazasyon ve pasif olarak birikemeyecek kadarbüyüktürler 4. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için bir strateji, gaz çekirdeği mikrobubbles daha küçük, sıvı çekirdekli damlacıklar5,6yoğuşmaktır. Damlacıklar sıvı hallerinde ekojenik olmasa da, yeterince yüksek pik negatif basınçla ultrasona maruz kaldıklarında buharlaştırılarak kontrast sağlama yeteneklerini geri kazanabilirler. Bu, damlacıkların küçük bir sıvı çekirdeğinin daha elverişli farmakokinetiğinden yararlanmasını sağlarken, insonated ve kimyasal bileşimi değiştirmeden kontrast sağlama yeteneğini korur4,7.

Decafluorobutane, gaz ve sıvı durumlar arasında faz kayması için ideal bir perflorokarbon bileşiğidir5,6,7. Decafluorobutane, mikrobubbles’ın sadece sıcaklık azaltma ile damlacıklara yoğunlaşmasına izin verirken, daha az yoğun perflorokarbonlar ek basınç gerektirir5. Bu nazik yöntem yoğuşma sırasında kabarcıkların yok edilmesini en aza indirir7,8,9. Çekirdekleri sıvı olduğu için damlacıklar ekojenik değil ve ultrason için görünmez. Bununla birlikte, yeterli akustik veya termal enerjinin uygulanmasıyla, sıvı çekirdekler tekrar gaz halinde buharlaşarak ekojenik mikrobubbles8üretebilir. Bu buharlaşma, mikrobubbles’ın ne zaman ve nerede üretüleceği kontrol edilmesine izin verir.

Damlacıklar pasif birikim, yerinde buharlaşma veya hücre geçirgenliğini iyileştirmek için yararlı olsa da 4, damlacıklar (ve parçaları) görüntülenemez veya ex vivoölçülemez. Bu nedenle, floresan4,10 , 11,manyetik parçacıklar12, optik emici ajanlar13gibi ölçülebilir eşlik eden tanı maddesi, ilgi çekici dokulara damlacık teslimatını ölçmek için analog olarak kullanılır. Örneğin, Helfield ve arkadaşları, damlacıklar floresan olarak tespit edilemediğinden fare organlarının histoloji görüntüsünün nicelleştirilmesi için floresan nano boncukların ortak enjeksiyonunu kullandı4. Eşlik eden tanı ajanlarının dezavantajı, izlenebilir bileşenin bireysel farmakokinetik profiline bağlı olarak damlacıktan bağımsız olarak hareket etmesidir.

Neyse ki, mikrobubbles ve damlacıkların kabuğu özelleştirilebilir. Örneğin, Huynh ve arkadaşları porfirin-lipid kabukları ile ultrason kontrast ajanları gösterdi, çok modlu mikrobubbles14. Porfirinler aromatik makrosilik yapıya sahip organik bileşiklersınıfıdır 14,15. Optik olarak emici, floresandırlar ve radyoterapi, radyonüklid bazlı görüntüleme veya eser metal bazlı niceleme için çok çeşitli metallere şelatlanabilirler14. Porfirin örneklerinden biri pirofeoforbiddir (Pyro). Pyro’yu lipitlere bağlayarak, Pyro-lipidleri mikrobubbles veya damlacıklara dahil etmek, birden fazla modalite ile görüntülenebilir ve izlenir: akustik, floresan ve emiciliği yoluyla14. Bu çok modlu kontrast aracısı birikimi izlemek ve ölçmek için kullanılabilir. Bu, nicel bileşen artık kabuk üzerine konjuge olduğundan, daha doğru teslimat nicelleştirmesi16‘yı etkinleştirerek eşlik eden tanılama aracılarına olan ihtiyacı ortadan kaldırabilir.

Burada, çok modlu faz değiştirme porfirin damlacıkları oluşturmak için bir protokol özetlenmiştir. Ultrason kontrastları ajanlar gibi ilgi çekici dokulara ilaç teslimi için bir platform olarak kullanılabilir gibi tümörler2,4, ultrason ötesinde tespit edilebilirlik genişletmek doğum etkinliği nicellik için yararlı olabilir. Bu damlacıkların amacı, in vivo , yerinde buharlaşma ve akustiktepasif birikim yapabilen ve ikincil sensörlere güvenmeden ex vivo organlardan biyo-dağılımı veya birikimi ölçme potansiyeline sahip izlenebilir ultrason kontrast ajanları sağlamaktır. Porfirin damlacıklarının biyo-dağıtım sensörleri olarak potansiyelini sergilemek için karakterizasyon yöntemleri de özetlenmiştir. Piro-lipid yüklemesinin kabuktaki etkileri (molar oranı ile% 0 ila% 50) da tartışılmaktadır.

Protocol

1. Susuz lipit filmleri Gereken kabuk bileşenlerinin her birinin kütlelerini hesaplayın (bkz. Ek Dosya “Lipid Formül Sayfası”).NOT: Bu protokol için, kabuk bileşimi: 10 molar % 1,2-distearoyl-sn-glisero-3-fosephoethanolamine-N-[metoksi (polietilen glikol)-5000] amonyum tuzu (DSPE-PEG5K), x molar % pirofotofor 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glisero-3-fosfokolin (Pyro-SPC) ve (90 – x) molar % 1,2-distearoyl-sn-glisero-3-fosfokolin (DSPC) konjuge. Pyro-SPC miktarı 7 kabuk bileşiminde(x = 0, 1, 10, 20, 30, 40, 50) değişmektedir. Stok şişesinde DSPE-PEG5K’nin moleküler ağırlığını kontrol edin. Protokolü en az 1 mL hacimli herhangi bir lipid hacmine ölçeklendirin. Bu protokol için tüm formülasyonlar için mL başına 1 mg toplam lipit konsantrasyonu ile 10 mL toplam lipid hacmi kullanılmıştır. Ekscipient çözelti olacaktır: 10% propilen glikol, 10% gliserol ve% 80 fosfat tampon salin (PBS, 1X, 7.4 pH) (% v / v / v) (bkz. Adım 2.3 ve “Lipid Formül Sayfası”).NOT: Pyro-lipids sentez protokolü, Zheng ve ark.15tarafından yapılan çalışmalardan değiştirilen S1’den S1’e Ek Dosya “Diğer Protokoller ve Veriler” Adımlarında özetlenmiştir. Hesaplanan kütlelere dayanarak (bkz. Adım 1.1 ve “Lipid Formül Sayfası”), Pyro olmayan lipitlerin her birini tartın ve vidalı kapaklı yeterince büyük bir borosilikat cam şişeye aktarın. Şişeyi kaplayın, kapağı ve şişeyi etiketleyin ve lipid şişesinin altını ve duvarlarını alüminyum folyo ile örtün. Bu şişe, protokolün geri kalanı için “Lipid Şişesi” olarak adlandırılacaktır. Lipid Şişesi’ni serin, kuru ve karanlık bir alanda saklayın. Formülasyon Pyro-SPC içeriyorsa, 10 mg Pyro-SPC kuru filmi (bkz. “Diğer Protokoller ve Veriler”) 1 mL kloroforma çözün. 5 sn için girdap, emiciliği ölçün ve Lipid Şişesi’ne eklemek için uygun hacmi hesaplayın.DİkKAT: Kloroform sağlık açısından zararlı, tahriş edici ve toksiktir. Koruyucu bir laboratuvar önlüğü, göz koruması, eldiven giyin ve duman solumaktan kaçının.NOT: Pyro-SPC ışığa duyarlı olduğundan, Pyro-SPC’yi kullanırken mümkünse çalışma alanındaki ışıkları azaltın. Pyro-SPC’yi kullanılmadığında kapalı ve kapalı tutun. Ultraviyole görünür spektrofotometrede, 800 nm ile 300 nm dalga boyu aralığından emilimi 0,5 nm artışlarla ölçecek ve uyumlu bir 1 cm yol uzunluğu cuvettesinde 2000 μL saf metanol ile bir taban çizgisi ölçecek şekilde ayarlayın.DİkKAT: Metanol sağlık açısından zararlı, tahriş edici, toksik ve yanıcıdır. Koruyucu bir laboratuvar önlüğü, göz koruması, eldiven giyin ve duman solumaktan kaçının. Kıvılcımlardan ve ısıdan uzak dur. 2000 μL metanol içine kloroformda Pyro-SPC’nin 2 μL’sini ve 30 sn için girdabı ekleyin. Temiz, uyumlu 1 cm’lik bir cuvette içine aktarın ve emiciliği ölçün. Absorbans, ultraviyole görünür spektrofotometrenin absorbans aralığının 667 nm dışındaysa bu seyreltme faktörünü ayarlayın.NOT: Kloroform veya metanol transferi yaptığınızda, daha iyi doğruluk için mekanik pipet yerine temiz bir cam şırınna veya pozitif deplasmanlı pipet kullanın. Üç taraflı absorbans değerlerini elde etmek için Adım 1.4.2’yi iki kez daha yineleyin. Absorbans tepe değerlerini 667 nm olarak ortalamalayın ve Lipid Şişesi14,15için gereken kloroform pyro-SPC hacmini hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın:burada V, Pyro-SPC’nin gerekli kloroform hacmidir, m Pyro-SPC’nin gerekli kütlesidir (bkz. Adım 1.1 ve “Lipid Formül Sayfası”), M, Pyro-SPC’nin moleküler ağırlığı 1040.317 g·mol-1, A ortalama emicilik 667 nm, d, kloroform hacimlerde metanol ve Pyro-SPC’ye dayanan seyreltme faktörüdür (Adım 1.4.2), L, 1 cm’de cuvette yol uzunluğudur ve ε 45000 L·mol -1 ·cm-1’dePyro-SPC’nin 667nmmolar zayıflama katsayısıdır.NOT: Denklemin paydası, bir analitin çözeltideki konsantrasyonu ile uzaktan ölçülen optik absorbansı ilişkilendiren Bira-Lambert Yasası’dır. Temiz bir cam şırınna (Şekil 1A) kullanarak önceki adımdan Lipid Şişesi’ne kloroform olarak hesaplanan Pyro-SPC hacmini ekleyin ve ardından şişeyi kaplayıp örtün.NOT: Şekil 1’de yalnızca Pyro-lipid formülasyonu gösterilir. Kloroformda kalan herhangi bir Pyro-SPC varsa: Dumanlı bir başlıkta, Pyro-SPC + kloroform şişesini Adım 1.4’ten çözün, şişeyi kısmen yana eğin ve nitrojen gazını pyro-SPC/ kloroform şişesine mümkün olduğunca hafifçe akıtın. Azot gazı akışını kullanarak kloroformu kurutmak ve Pyro-SPC’yi kurudukça şişenin iç duvarına eşit şekilde kaplamak için şişeyi döndürün. Sıçrama olmadığından ve çözeltinin hiçbirinin düşmeyip düşmeyden emin olun. Pyro-SPC lipid filmi kuru ve şişenin duvarına kaplanmış olarak göründüğünde, azot gazı akışını kapatın. Şişeyi kaplayın, şişe boynunu balmumu filmiyle kapatın ve şişeyi -20 °C’de ve karanlıkta saklayın. % 90 kloroform ve% 10 metanol (% v / v) çözeltisi hazırlayın ve Lipid Şişesine 5 mL ekleyin. Lipid Şişesini kaplayın ve içeriği homojenize etmek için hafifçe döndürün (Şekil 1B).NOT: Formülasyon fosfatadik asit lipitler içeriyorsa (örneğin 1,2-distearoyl-sn-glisero-3-fosfat sodyum tuzu (DSPA)), ekleyin: 60% kloroform, % 32 metanol ve% 8 çift deiyonize su (% v / v / v) Lipid Vial için. Lipit içeriğini tamamen çözmek için daha yoğun girdap gerekebilir. Dumanlı bir başlıkta Lipid Şişesi’nin kapağını çözün, Lipid Şişesini kısmen yana yatırın ve lipid şişesine mümkün olduğunca hafifçe azot gazı akışı. Azot gazı akışını kullanarak çözeltiyi kurutmak için Lipid Şişesini döndürün ve lipid filmini kurudukça Lipid Şişesi’nin iç duvarına eşit şekilde kaplayın. Sıçrama olmadığından ve çözeltinin hiçbirinin düşmeyip düşmeyden emin olun. Lipitler kuru ve lipit şişesinin iç duvarlarına kaplanmış olarak göründüğünde (Şekil 1C), azot gazı akışını kapatın, Lipid Şişesi’nin tabanını ve duvarını alüminyum folyo ile örtün ve üst açıklığı havalandırma için bir iğne ile birkaç delik ile dürtülmüş alüminyum folyo ile örtün (Şekil 1D). Kapalı Lipid Şişesini bir vakum kurutucunun içine etiketleyin ve yerleştirin ve lipitlerin en az 24 saat, ancak en fazla 72 saat kurumasını bekleyin.NOT: Protokol daha sonra, 24 ila 72 saat sonra sürdürülebilir. 2. Lipid Hidrasyon Bir banyo sonicator’ı suyla doldurun ve 70 ° C’ye ısıtın. Suyu karıştırmaya yardımcı olmak için sonikasyonu açın.DİkKAT: Su ve sonicator yüksek sıcaklıklardadır. Suya ve sonicator’a dokunmaktan kaçının. Göz koruması, koruyucu laboratuvar önlüğü ve koruyucu eldiven giyin. Banyo sonicator 70 °C’ye ulaştıktan sonra Lipid Şişesi’ni vakum kurutucudan çıkarın. Mümkünse çalışma alanındaki ışıkları azaltın. propilen glikol, glisol, PBS (%v/v/v) gibi ekscipient bir çözelti hazırlayın ve Lipid Şişesi’ne 10 mL ekleyin (bkz. Adım 1.1.1 ve “Lipid Formül Sayfası”).NOT: Standart bir hava deplasmanlı pipet kullanıyorsanız, propilen glikol ve gliserol gibi viskoz çözücüleri kullanırken dikkatli olun. Sesi yavaşça epire edin ve daldırın ve artık hacmin pipet ucunun altına ulaşmasını bekleyin. Yavaşça hareket ederek hacimleri aktarırken sıvının pipet ucunun dışına yapışmadığından emin olun. Lipid Şişesini kaplayın, alüminyum kapağı çıkarın ve lipitleri çözmek için sonication açıkken şişeyi banyo sonicator’da 15 dakika hafifçe döndürün. Lipid Şişesi’nin boynunun suyun üstünde olduğundan emin ol. Bazen şişe kapağının güvenli bir şekilde kapatılıp kapatılmamış olup olmadığını kontrol edin. Bazen Lipid Şişesi’ni su banyosundan çıkarın. İçeriğin tamamen çözülüp çözülmediğini kontrol etmek için kısa bir süre ışığa tutun (Şekil 1E). Lipid Şişesi içeriği homojenleşmezse, Lipid Şişesi’ni banyo sonicator’dan çıkarın. Kapağı sabitleyin, daha agresif bir şekilde döndürün ve banyo sonicator’a geri verin. Lipid Şişesi’ni banyo sonicator’dan çıkarın ve banyo sonicator’ını kapatın. Lipid Şişesi’nin dış cephesini kağıt havlularla kurulayın ve Lipid Şişesi’ni yeniden etiketleyin. Lipid Şişesi’ni alüminyum folyo ile örtün ve Lipid Şişesi’ni oda sıcaklığında serin, karanlık ve kuru bir alanda 10 dakika soğutun. Lipid Şişesi içeriğini Aliquot: 3 mL borosilikat cam şeffaf serum şişelerinde (7 mm iç ağız çapı, 13 mm dış ağız çapı) lipid çözeltisinin yaklaşık 2 mL’si.NOT: Bazı protokoller 3 mL şişe7’de1,5 mL lipit çözeltisi kullanabilir. Serum şişelerini liyofilizasyon tarzı gri klorobütil kauçuk durdurucularla (7 mm iç ağız çapı, 13 mm dış ağız çapı) kaplar ve kauçuk durdurucuyu yırtık alüminyum contalar (13 mm dış ağız çapı) ve bir kıpkırmızı(Şekil 1F)ile sabitleyin. Serum şişelerinin her birinde lipit çözeltisini vakumlayın, gazdan arındırın ve yeniden basın4,5,7 ( Şekil2).NOT: Gaz Eşanjörünün nasıl monteılacağına ilişkin talimatlar ve daha fazla ayrıntı için “Diğer Protokoller ve Veriler” e bakın. Basınç Valfi A ve Gaz Silindir Valfi dahil olmak üzere her vanayı kapatın (Şekil 2). Serum şişelerini manifold iğnelere bağlayın, ardından ilgili Manifold Valflerini açın, ardından Vakum Valfi A ve Vakum Valfi B’yi açın ve atmosferik havayı çıkarmak için 5 dakika boyunca -90 kPa’da (-13 psi, -900 mbar) vakumlayın. Sıvının hiçbirini vakumLAMAYIN (bkz. “Diğer Protokoller ve Veriler” S3 ila S3.1.5 adımları).DİkKAT: Vakum pompası yanlış işlenirse patlayabilir. Vakum pompasını organik, asidik veya temel kimyasallarla kullanmayın. Vakum hala açıkken, bir serum şişesi tutun (sallanmasını önlemek için) ve gaz çıkarmak için bir kalem veya işaretleyici ile hızlı bir şekilde dokunun. Kabarcıklar oluşmayana ve şişede kabarcıklar oluşmayana kadar dokunmaya devam edin. Herhangi bir sıvının vakumlamasına izin VERMEYİn. Gerekirse dokunmayı duraklatın. Tüm bağlı serum şişeleri için tekrarlayın. Tüm serum şişelerini gazdan arındırtıktan sonra, CLOSE Vakum Valfi A ve Vakum Valfi B ve Vakum pompasını KAPATIN (bkz. “Diğer Protokoller ve Veriler” Adımları S3.2 ila S3.2.3). Serum şişesi hala iğneye bağlıyken ve vakum pompası kapalıyken, Gaz Silindir Vanasını 1/16 ila 1/8 (yaklaşık 22,5 ila 45 ° tam devir) saat yönünün tersine kısmen açmak için çevirin, ardından T-Handle Vanasını açın ve Hava Regülatör Vanasını saat yönünde 3 psi (20,7 kPa) göstergesine yavaşça çevirin. Ardından, A Basınç Valfi ve Basınç Valfi B’yi açın (bkz. “Diğer Protokoller ve Veriler” Adımları S3.3 ila S3.3.21).DİkKAT: Kafeun disafluorobütan gaz silindiri basınç altındadır ve ısıtılırsa patlayabilir. Isıdan ve darbeden uzak tutun. Kafeunsiz gaz oksijen deplasmanına ve boğulmaya neden olabilir. Uygun göz koruması takın ve duman kaputuna saplanın. Yanlış ele alınırsa, hızlı basınçsızlaştırma ve patlamaya neden olabilecek gaz silindirini vakumlamak mümkündür. Gaz Silindir Vanasının 1/8’den fazla dönmesi Hava Regülatörüne zarar verebilir. 30 s basınçlandırmadan sonra (gösterge hala 3 psi (20.7 kPa) okumalıdır), tüm Manifold Valfleri serum şişeleriyle kapatın, serum şişelerini çıkarın, iğneleri kılıflayı ve Gaz Silindir Vanasını KAPATIN. Hava Regülatörü göstergesi iğnesi dinlenme konumuna gelene kadar tek bir Manifold Valfi kısmen açarak yerleşik basıncı hafifletin. Sonra Manifold Vanalar ve T-Handle dahil olmak üzere her şeyi kapatın. Serum şişelerini etiketleyin ve 4 °C’de ve karanlıkta saklayın. Tüm Gaz Eşanjör vanalarının kapalı olduğundan ve vakum pompasının daha sonra kapatıldığından emin olun.NOT: Serum bu durumda 4 aya kadar stabil olmalıdır. Bu adımda, protokol en fazla 4 ay sonra daha sonra devam ettirilebilir. 3. Decafluorobutane şişeleri Temiz, boş 3 mL borosilikat cam şeffaf serum şişeleri (7 mm iç ağız çapı, 13 mm dış ağız çapı), bunları liyofilizasyon tarzı gri klorobütil kauçuk durdurucularla (7 mm iç ağız çapı, 13 mm dış ağız çapı) kaplayın ve kauçuk durdurucuyu yırtık alüminyum contalar (13 mm dış ağız çapı) ve4kıpkırmızı ilesabitleyin. 7,8. Atmosferik havayı vakumlamak için Adım 2.9.1’i izleyin (bkz. “Diğer Protokoller ve Veriler” Adımları S3.1 ila S3.1.5). Gaz gidermeyi atlayın ve şişeyi yeniden basınçlandırmak için 2.9.3 ile 2.9.5 arası Adımları izleyin (bkz. “Diğer Protokoller ve Veriler” Adımları S3.3 ila S3.3.21). Kafeunsiz şişeleri etiketleyin ve 4 °C’de ve karanlıkta saklayın. Tüm Gaz Eşanjör vanalarının kapalı olduğundan ve vakum pompasının daha sonra kapatıldığından emin olun.NOT: Damlacık yoğuşması için kafeinsiz gaz dolu serum şişelerine ihtiyaç duyulacaktır. Bu eyalette 4 aya kadar stabil olmalıdırlar. Bu adımda, protokol en fazla 4 ay sonra daha sonra devam ettirilebilir. 4. Damlacık oluşumu Serum şişeslerindeki hidratlı bir lipit çözeltisini (Adım 2.10’dan) buzdolabından çıkarın. Bir dekapper kullanarak, serum şişesinin üzerindeki alüminyum contayı çıkarın ve lipid çözeltisinin iç duvardan akmasına izin vererek lipid çözeltisinin 1 mL’lik 1,85 mL borosilikat cam numune şişesine (fenolik vidalı kapaklı) aktarın. Kabarcıklar oluşturmayın. Serum şişesinde kalan lipid çözeltisi varsa, serum şişesini depolama için gazdan arındırmak ve yeniden basınçlandırmak için 2.9 ile 2.10 arası adımları izleyin (bkz. “Diğer Protokoller ve Veriler” Adımları S3 ila S3.3.21). 1,85 mL numune şişesi ile, Gaz Eşanjörü kullanılarak numune şişesi kafa boşluğuna kafeunsiz gazda hafifçe akar (belirli vana adları için Şekil 2’ye bakın). Gaz Eşanjöründeki tüm vanaların düzgün bir şekilde kapatıldığından ve pompanın kapalı olduğundan emin olun.DİkKAT: Yanlış yapılırsa, hızlı dekompresyona ve patlamaya neden olan gaz tüpünü vakumlamak mümkündür. Bir manifold vanasını açın ve karşılık gelen iğneyi manifolddan dikkatlice ısıtın.DİkKAT: Keskin nesne, temastan/delicikten kaçının. A ve Basınç Valfi B’yi açın ve Gaz Silindir Vanasını 1/16 ila 1/8 (tam devir yaklaşık 22,5 ila 45 ° tam devir) saat yönünün tersine döndürün ve ardından T-Handle Vanasını kısmen açın.DİkKAT: Hava Regülatörüne zarar verebileceğinden Gaz Silindir Vanasını bundan daha fazla açmayın. Örnek şişeyi lipid çözeltisi ile çözün ve Manifold iğnesi şişenin içindeki sıvı hava arayüzünün üzerinde olacak şekilde hareket ettirın. Şişeyi orada tut. Hava Regülatörü göstergesi iğnesi dinlenme konumundan hafifçe hareket edene ve perflorokarbon gazı manifold iğnesinden hafifçe akana kadar Hava Regülatör Vanasını yavaşça saat yönünde çevirin. Perflorokarbon gazının 30 s boyunca şişe kafa boşluğuna hafifçe akmasına izin verin. Kabarcıklar oluşturmayın. Gerekirse Hava Regülatör Vanasını ayarlayın.NOT: Sıvı hava arayüzü kafeunsiz gaz akışı tarafından hafifçe bozulmalıdır. Sistem şu anda açık olduğundan, Hava Regülatörü göstergesi basıncı düzgün okuyamaz. 30 sn’den sonra, şişeyi çok fazla hareket ettirmeden numune şişesini dikkatlice ve hızlı bir şekilde kaplar. Gaz Silindir Vanasını (saat yönünde), T-Handle Vanasını, Hava Regülatör Vanasını (saat yönünün tersine), Basınç Valfi A, Basınç Valfi B ve Manifold Vanasını kapatın. İğneyi dikkatlice ört. Örnek şişeyi etiketleyin ve boynu saat yönünde giden balmumu filmi ile kapatın(Şekil 3A ve 3B).NOT: Şekil 3B ila 3F sadece% 30 Pyro-lipid formülasyon gösterir. Numune şişesini karanlıkta ve 4 °C’de en az 10 dakika veya 24 saate kadar saklayın.NOT: Bu adımda, protokol daha sonra, en fazla 24 saat olarak sürdürülebilir. Yalıtımlı bir kaba yaklaşık 100 g kuru buz (karbondioksit) yerleştirin ve normal buzu başka bir yalıtımlı kaba yerleştirin. Adım 3’te belirtilen hazırlanmış decafluorobutane serum şişelerini, iki adet 3,81 cm (1,5 inç) 20’lik iğneyi, 1 mL plastik şırıngayı (kullanmadan önce pistonu çöz), 200 mL’lik bir kabı, metal maşaları ve bir termometreyi (-20 ila 100 °C) alın.NOT: Sadece mikrobubbles yapıyorsanız, izopropanol, kuru buz ve buza gerek yoktur. Örnek şişeyi lipid çözeltisi ile mekanik karıştırıcıya yerleştirin ve 45 s için ajitat(Şekil 3C). Mekanik ajitasyondan sonra, numune şişesini sağdan yana, ışıktan korumalı olarak bekletin ve şişeyi soğutmak için 15 dakikalık bir geri sayım başlatın ve mikrobubbles8,17’yiseçin. 15 dakikalık geri sayım 10 dakikaya ulaştığında (geri sayımın 5 dakikası kaldı), bir kabı yaklaşık 200 mL izopropanol ile doldurun ve metal maşalar kullanarak kuru buzla -20 °C’ye soğutun.NOT: Hedef sıcaklık -15 ila -17 °C’dir, ancak izopropanol mikrobubbles kullanırken ısınır.DİkKAT: İzopropanol yanıcıdır. Sıcaktan ve kıvılcımlardan uzak tutun. Kuru buz cilt hasarına neden olabilir. Maşalarla idare edin. Eldiven, göz koruması ve koruyucu laboratuvar önlüğü giyin. Mikrobubbles 15 dakika boyunca boyut seçildikten sonra, örnek şişenin içinde boyut seçilen bölümü arayın (Şekil 3D). Numune şişesini sağ tarafta tutmak, numune şişesini dikkatlice çıkarmak ve 1 mL plastik şırıngaya bağlı 1,5 inç 20 kalibrelik bir iğne ile alt bölmenin yaklaşık 0,7 mL’lik kısmını geri çekin. Üst bölümden hiçbirinin geri çekilmediğinden emin olun. Hava ceplerini çıkarmak için şırındağa dokunmayın. Dekantasyon yapmak için bir kafeunsiz serum şişesine (iğneyi serum şişesinin tepesine yakın tutarak) farklı bir 20’lik iğne yerleştirin ve ardından iğneyi/ şırıngayı boyut tarafından seçilen mikrobubbles ile yerleştirin. Boyut seçilen mikrobubbles yavaşça aktarın. Şişeyi eğin ve sıvının kafeunsiz serum şişesinin iç duvarından aşağı kaymasına izin vermek için şırınnayı açı verin. Boyut tarafından seçilen tüm mikrobubble çözeltisi aktarıldıktan sonra, iğneyi şırınga ile çıkarın, ancak negatif basıncı hafifletmek için havalandırma iğnesini içinde tutun (Şekil 3E). Yalnızca boyut seçilen mikrobubbles yapıyorsanız, burada durun. Havalandırma iğnesini üstte ve yakınında tutun. Şişeyi karanlıkta ve oda sıcaklığında tutun. Banyo sıcaklığının -15 ila -17 °C arasında olduğundan emin olmak için izopropanol banyosuna az miktarda kuru buz veya oda sıcaklığı izopropanol ekleyin. Serum şişesinin üstüne yerleştirilen 20 kalibrelik havalandırma iğnesi ile serum şişesini izopropanol banyosuna yerleştirin, mikrobubble seviyesini izopropanol seviyesinin altında tutun, ancak şişe boynunu üzerinde tutun ve mikrobubbles’ı yoğunlaştırmak için serum şişesini aralıklı olarak 2 dakika döndürün.NOT: Bu adım Sheeran ve ark.6 tarafından yapılan çalışmalardan değiştirilmiştir. Serum şişesini izopropanolde sürekli döndürmeyin ve çözeltinin donmasına izin vermeyin. Yaklaşık 5 s boyunca döndürün ve serum şişesini izopropanolden kaldırın. Buz çekirdeğini kontrol edin ve izopropanolde dönmeye devam edin. Buz oluşumu varsa, serum şişesini dağılana kadar havada döndürün. 2 dakikalık yoğuşma sonrasında serum şişesini izopropanol banyosundan çıkarın ve havalandırma iğnesini çıkarın.NOT: Mikrobubbles, yarı saydamlıktaki değişiklikte belirtildiği gibi damlacıklara yoğunlaştırılmış olmalıdır(Şekil 3E ve% 30 Pyro-lipid formülasyonu için Şekil 3F). Serum şişesini silin, etiketleyin ve kullanıma hazır olana kadar koyu, yalıtımlı bir kapta normal buza yerleştirin. Açılmamış (sağlam alüminyum conta) damlacıklar, erimiş buz gerektiği gibi değiştirildiği sürece bu durumda 6 saate kadar sabit olmalıdır. Kullanıma hazır olduğunuzda, alüminyum contayı dekar ile çıkarın. Damlacıkları (hatta açık şişeleri) kullanılmazken buzda ve karanlıkta tutun. Mikrobubbles karanlıkta ve oda sıcaklığında tutun. 5. Morfolojik ve Optik Karakterizasyon % 1 Triton hazırlayarak: 500 mL PBS’ye (1x, pH 7.4) 5 mL Triton X-100 ekleyerek ve homojen14’ekadar manyetik bir karıştırma çubuğu ile karıştırın.NOT: Triton X-100 çok viskoz. Standart bir hava deplasmanlı pipet kullanıyorsanız, kullanırken dikkatli olun. Sesi yavaşça epire edin ve daldırın ve artık hacmin pipet altına ulaşmasını bekleyin. Yavaşça hareket ederek hacimleri aktarırken sıvının pipet ucunun dışına yapışmadığından emin olun. Damlacıkları hazırlayın (Adım 4). Mikrobubbles da karakterize ediliyorsa, yoğuşma öncesinde boyut seçilen mikrobubbles küçük bir hacim toplayın (Adım 4.9). Boyut dağılımları ve konsantrasyonları elde etmek için bir Coulter Sayacındaki (CC) mikrobubbles veya damlacıkları 0,2 ila 6 μm arasında boyutlaşın (Şekil 4). Temiz bir 20 mL cuvette’i 0,2 μm gözenekli poliethersülfon membran filtresinden süzülen 10 mL CC elektrolit ile doldurun. Bir taban çizgisi elde etmek için CC’de üç çalıştırmayla ölçün. Aynı CC elektrolitte, 5 μL mikrobubble veya damlacık örneği ekleyin ve hafifçe karıştırın.NOT: Numunenin ne kadar konsantre olduğuna bağlı olarak 2 ila 20 μL numune eklenebilir. Örneği CC üzerinde çalıştırın (3 çalıştırma), ortalama temeli çıkarın ve boyut dağılımını ve konsantrasyonu (mL başına sayı) hesaplayın. Damlacık emiciliğini UV-Vis spektroskopisi ile ölçün (Şekil 5).NOT: Şekil 5’te sadece Pyro-lipid formülasyonu gösterilir. UV-Vis spektrofotometresinde, absorbans ölçümünü 0,5 nm artışlarla 800 nm ila 300 nm dalga boyları olarak ayarlayın ve taban çizgisi düzeltmesini etkinleştirin. PBS ile dolu temiz bir 1 cm yol uzunluğu cuvette kullanarak taban çizgisi ölçümü gerçekleştirin. Ses seviyesinin spektroskop ışın yolu ile kesişecek kadar yüksek olduğundan emin olun. Pyro-lipid damlacığını PBS’ye seyreltin (2 μL ila 500 μL damlacıkları 2000 μL seyrelticiye tavsiye edin) ve pipetleme ile karıştırın.NOT: GIRDAP YAPMAYIN, aksi takdirde derlemeler yok edilir. Seyreltilmiş damlacıkları temizlenmiş bir cuvette içine aktarın ve emiciliği ölçün. Gerekirse seyreltmeleri değiştirin. Adım 5.4.1 ile 5.4.4 arasında yineleyin, ancak PBS yerine %1 Triton kullanın. Seyreltmeden sonra, numuneyi ölçmeden önce 30 s boyunca sızdırmaz/kapaklı bir şişeye ve girdaplara aktarın. Mikrobubbles veya damlacıkların floresanını ölçün (Şekil 6).NOT: Şekil 6’da yalnızca Pyro-lipid formülasyonu gösterilir. Floresan spektrofotometrede, ekscitasyon dalga boyunu 410 nm ve emisyon dalga boyunu 1 nm artışlarla 600 ila 750 nm arasında ayarlayın. Floresan spektrofotometre ile uyumlu bir cuvette kullanarak taban çizgisi elde etmek için PBS seyrelticinin floresanını ölçün. Pyro-lipid mikrobubbles veya damlacıkları PBS içine seyreltin (2000 μL seyreltici içine damlacık 0.5 μL ila 10 μL tavsiye) ve pipetleme ile karıştırın.NOT: GIRDAP YAPMAYIN, aksi takdirde derlemeler yok edilir. Seyreltilmiş numuneyi temizlenmiş, baselined cuvette aktarın ve floresan ölçün. Gerekirse seyreltmeleri değiştirin ve sinyal doygunluğundan kaçının. Adım 5.5.1 ile 5.5.4 arasında yineleyin, ancak PBS yerine %1 Triton kullanın. % 1 Triton’da seyreltildikten sonra, seyreltilmiş numuneyi ölçmeden önce 30 sn boyunca sızdırmaz / kapaklı bir şişeye ve girdaplara aktarın. Girdaptan üretilen kabarcıkların lazer yolunun üzerinde olmasını sağlamak için yeterli hacim ekleyin.NOT: Triton’daki numunenin floresan sinyali, floresan sönmesi nedeniyle PBS’den çok daha yüksek olacaktır (Şekil 6). 6. Buharlaşma görüntüleme Uygun büyüklükteki bir su deposunu deiyonize su ile doldurun ve sudaki gazları atmosferle aşındırmak için 24 saat dinlendirin. Damlacıkları hazırlayın ve kullanıma kadar buzda ve karanlıkta tutun. Pellow ve ark.18 tarafından açıklandığı gibi% 2 agardan bir akış hayalet tüpü yapın, hayaleti 37 ° C’ye ısıtılmış bir su tankına batırın. PBS’yi 37 °C’ye ısıtın ve hayaletin içinden akın. Klinik öncesi ultrason sistemi ve 21 MHz doğrusal dizi dönüştürücüsü ile (bkz. Malzeme Tablosu),görünümü akış hayaletine hizalayın, B modu görüntülemeye ayarlayın, çıkış basınçlarını ayarlayın ve her basınçta taban çizgisi elde etmek için videolar veya görüntüler yakalayın. Damlacığın 20 μL’sini 37 °C PBS’nin 50 mL’sine seyreltin ve hafifçe karıştırın. Çözeltiyi 30 mL plastik şırınna aktarın ve çözeltiyi agar fantomuna itin. Adım 6.5 ile aynı hizalamayı koruyarak, buharlaşma gözlenene kadar çıkış basınçlarını artırın (hayaletteki parlak benekler, bkz. Şekil 7).NOT: Şekil 7 Pyro-lipid damlacık örneğini göstermektedir. Piyasada bulunan bu 21 MHz lineer dizi dönüştürücü, damlacıkları hem görüntüleme hem de buharlaştırma yeteneğine sahiptir.

Representative Results

Önceden yoğunlaştırılmış, boyutlandırılmış mikrobubble örnekleri (n = 3) ve yoğuşma sonrası damlacık örnekleri (n = 3) 10 μm diyafram açıklığına sahip bir Coulter Sayacında (CC) boyutlandırıldı. 10 μm diyaframın bir sınırlaması, ortalama boyut ve konsantrasyonu önyargılı hale getiren 200 nm’den küçük parçacıkları ölçememesidir. Şekil 4, Pyro-lipid içerik formülasyonlarının her biri için boyutlandırma verilerini gösterir. Tablo 1, boyutlandırma verilerine dayalı istatistikleri gösterir. Ön ve son yoğunlaştırılmış ortalama çapların bir oranını kullanarak, sonuçlar% 0 Pyro-lipid formülasyonunun 0.02’± 1.72 ile en küçük ortalama çap kaymasına sahip olduğunu gösterdi. Pyro-lipid formülasyonu 2.38 ± 0.08 ile en büyük ortalama çapa sahipti. %1 Pyro-lipid damlacık örneği en yüksek gözlenen konsantrasyona sahipti (2.71 ± 0.13) ×10 10 /mL iken% 40 Pyro-lipid damlacık örneği 109 /mL’× de (7.36 ± 0.81) en düşük gözlenen konsantrasyona sahipti. Boyutlandırma verileri% 10 Pyro-lipid damlacık örneğinin 261 ± 13 nm ile en küçük tepe dimetere sahip olduğunu, % 50 Pyro-lipid damlacık örneğinin ise 390 ± 55 nm ile en büyük olduğunu gösterdi. Genellikle Pyro-lipid içeriği arttıkça konsantrasyon azaldı ve ortalama çap arttı. Yoğunlaştırılmış numuneler öncü mikrobubble örneğine dayandığından, her iki ultrason kontrast ajanı türü için de eğilim oluşmuştır. Pyro-lipid içeriği arttıkça, bir mikrobubble subpopülasyonu (yaklaşık 2000 μm’de bir tepe boyutu ile) oluşmaya başladı. Bu ikincil tepe% 0 Pyro-lipid mikrobubble örneğinde mevcut değildi ve en belirgin olanı% 40 ve% 50 Pyro-lipid popülasyonlarında mevcuttu. Şekil 5, Pyro-lipid damlacık örneğinin temsili absorbans ölçümlerini göstermektedir. PBS’deki bozulmamış numunenin zirvesi 700 nm iken Triton’daki bozulan örnek zirveyi 671 nm’ye kaydırdı. Bu, sağlam montajların tek tek, birleştirilmemiş lipit bileşenlerine kıyasla farklı optik özelliklere sahip olduğunu göstermiştir. Şekil 6A, önceden yoğunlaştırılmış mikrobubble örneğinin temsili floresan ölçümlerini gösterirken, Şekil 6B Pyro-lipid ile yoğunlaştırılmış damlacık örneğini göstermektedir. PBS’deki bozulmamış örnek 704 nm’de floresan zirvesine sahipken, bozulan form 674 nm’de bir tepeye sahipti. Eğrinin altındaki bozulmamış alanı eğrinin altındaki sağlam alanla çıkarmak ve eğrinin altındaki bozulan alana bölmek, sırasıyla% 30 Pyro-lipid mikrobubble örneği ve damlacık örneği için% 98.61 ve% 98.07 olarak çalışan söndürme verimliliği sağlar. Mikrobubbles’a dönüşen damlacıkları göstermek için, seyreltilmiş damlacıklar ultrason sistemi ile 37 °C akış hayaletinde görüntülendi ve buharlaştırıldı. Şekil 7, farklı basınçlarda görüntülenmiş% 30 Pyro-lipid damlacık örneğinin temsili ultrason görüntülerini göstermektedir. Düşük basınçlarda (Şekil 7A), çok az sinyal vardı, sadece agar sentezinden sıkışmış hava kabarcıklarından gelen arka plan sinyali vardı. Bunun nedeni damlacıkların ekojenik olmaması ve ultrason dağıtmamasıdır. Biraz yüksek bir güçte, parlak beneklerin ortaya çıkmasında gösterildiği gibi birkaç mikrobubbles (Şekil 7B) oluşturuldu. Basınç arttıkça, daha fazla mikrobubbles üretildi (Şekil 7C ve 7D). Bu aynı zamanda damlacıkların 37 °C’de kendiliğinden buharlaşmayacağını göstermiştir. Şekil 1: Pyro-lipid çözeltisini oluşturma adımlarının görüntüleri. A)Lipid tozu artı kloroformda Pyro-SPC. B)Çözünen çözelti eklendi. C) Lipid filmi kurutulur ve şişenin iç duvarına kaplanır. D) Alüminyum folyoya sarılı lipid şişesi (dış folyo yeniden kullanılmak üzere bantlanmış). E)Hidratlı lipit çözeltisi. F) Serum şişesinde lipid çözeltisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: 10 manifold gaz eşanjörü. Protokolde atıfta bulunulen vanalar etiketlenmiştir. Gaz Eşanjörünün nasıl monteılacağına ilişkin yönergeler için “Diğer Protokoller ve Veriler” Ek Dosyasına bakın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: A) Örnek şişelerdeki 7 formülasyonun (%0 ila Pyro-SPC) lipit çözeltileri. B’den D’ye şekiller% 30 Pyro-lipid damlacıkları yapmak için atılan adımların görüntülerini göstermektedir. B) Örnek bir şişede % 30 Pyro-lipid çözeltisi. C) Ajitasyon sonrası. D) 15 dk boyut seçili. E)Alt bölme kafeunsiz şişeye aktarılır. D) Yoğuşma sonrası. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Coulter Counter (CC), farklı Pyro-lipid kabuk içeriğine sahip boyut seçilen mikrobubble ve damlacık örneklerinin boyutlandırma verilerini(n = 3). Düz yeşil çizgiler mikrobubbles ve noktalı siyan çizgileri damlacıkları temsil eder. A) %0 Pyro-SPC. B) %1 Pyro-SPC. C) Pyro-SPC. D) Pyro-SPC. E) Pyro-SPC. F) Pyro-SPC. G) Pyro-SPC. H) Kabuktaki Pyro-SPC içeriğine dayanarak CC’den mikrobubble ve damlacık örneklerinin toplam gözlemlenen konsantrasyonları. Tüm hata çubukları standart sapmayı gösterir. Tüm ölçümler 200 nm ila 6000 nm boyut aralığına sahip 10 μm diyafram kullanılarak gerçekleştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: PBS ve %1 Triton olarak seyreltilmiş, yoğunlaştırılmış Pyro-lipid damlacık örneğinin 300 ila 800 nm’si arasında temsili ultraviyole görünür (UV-Vis) spektroskopi absorbans ölçümleri. Şekil 6: 600 ila 750 nm arasında temsili floresan emisyonu 410 nm’de heyecanlı. A)PBS ve %1 Triton’da boyuta seçilmiş, önceden yoğunlaştırılmış Pyro-lipid mikrobubble örneği. B)PBS’de ve %1 Triton’da Pyro-lipid damlacık örneği sonrası yoğunlaşma. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 7: B modunda klinik öncesi 21 MHz doğrusal dizi dönüştürücü ile çekilen 37 °C agar akış hayaletinin temsili ultrason görüntüleri (bkz. Malzeme Tablosu). Sol sütunda (Şekil A, C, E,& G) PBS denetimleri gösterilir. Sağ sütun (Şekil B, D, F,ve H) 20 μL’lik yoğunlaştırılmış% 30 Pyro-lipid damlacık örneğini 37 ° C PBS’nin 50 mL’sine seyreltilmiş olarak gösterir. Her satır, Sheeran ve arkadaşları tarafından yapılan çalışmalardan tahmin edilen serbest alan tepe negatif basınçlarını temsileder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Yöntem Aracı Pyro Kabuğu % 0 1 10 20 30 40 50 CC Baloncuk -lar Conc. [/mL] (2,76 ± 0,28) × 10^10 (3,04 ± 0,15) × 10^10 (2,02 ± 0,11) × 10^10 (1,91 ± 0,22) × 10^10 (1,47 ± 0,05) × 10^10 (8,47 ± 0,95) × 10^9 (9,89 ± 0,15) × 10^9 CC Baloncuk -lar Tepe [nm] 329 ± 6 297 ± 15 305 ± 21 273 ± 14 310 ± 40 266 ± 33 393 ± 89 CC Baloncuk -lar Ortalama [nm] 609 ± 2 603 ± 15 635 ± 6 690 ± 8 812 ± 1 935 ± 22 950 ± 55 CC Baloncuk -lar Ortanca [nm] 450 ± 6 421 ± 6 414 ± 6 432 ± 5 490 ± 2 596 ± 37 695 ± 41 CC Damlacık -ları Conc. [/mL] (2,18 ± 0,07) × 10^10 (2,71 ± 0,13) × 10^10 (1,75 ± 0,18) × 10^10 (1,72 ± 0,13) × 10^10 (1,09 ± 0,01) × 10^10 (7,36 ± 0,81) × 10^9 (7,38 ± 0,28) × 10^9 CC Damlacık -ları Tepe [nm] 292 ± 0 297 ± 17 261 ± 13 280 ± 9 268 ± 17 287 ± 38 390 ± 55 CC Damlacık -ları Ortalama [nm] 353 ± 5 350 ± 5 347 ± 1 347 ± 4 397 ± 1 399 ± 6 400 ± 7 CC Damlacık -ları Ortanca [nm] 318 ± 4 318 ± 4 310 ± 1 315 ± 2 340 ± 0 367 ± 5 370 ± 9 Tablo 1: Coulter Counter’dan (CC) farklı Pyro-SPC içeriğine sahip mikrobubble ve damlacık örneklerinin veri istatistikleri boyutlandırma (n = 3). Tüm hatalar standart sapmayı gösterir. Ek Bilgi – Lipid Formül Sayfası: Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. Ek Bilgi – Diğer Protokoller ve Veriler: Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Tüm lipit bileşenlerini bir araya ekledikten sonra (Adım 1.2 ve 1.4.5, Şekil 1A),Pyro-lipid ve Pyro dışı lipid bileşenlerinin tamamen homojenize olmasını sağlamak için kloroform ve metanol çözeltisi (ve DSPA gibi fosfatidik asit lipitleri varsa su) eklenmiştir (Adım 1.5, Şekil 1B). Heterojen lipid bileşimine sahip lipid veziküllerinin oluşumunu önlemek için, çözünmüş lipitler kurutulur ve şişe duvarının iç kısmına ince bir film olarak kaplanır (Şekil 1C). Kaplama (Adım 1.6), kurutulmuş filmin yüzey alanını artırdığı için hidrasyonun (Adım 2.1 ila 2.4) daha kolay olmasını sağlar. Kurutma (Adım 1.6, Şekil 1C)ve vakumlama (Adım 1.8, Şekil 1D),kloroform ve metanollerin mikrobubbles oluşumunu bozabileceğinden tamamen buharlaşmasını sağlamak için yapılmıştır. Protokol, lipid çözelti hacimlerini 1 mL’ye kadar düşürmek için ölçeklendirilebilirken, daha büyük hacimler şişeden şişeye varyasyonu azaltabilir. Bu, pyro-SPC’yi kullanılmadığı süre boyunca düşürme riskine neden olsa da, lipid çözeltisinin depolama durumu (Adım 2.9 ila 2.10) bu riski azaltmak içindi. Gaz eşanjörü ile gaz giderme adımı (Adım 2.9.2, Şekil 1F ve Şekil 2)oksidasyonu önlemek için mümkün olduğunca fazla oksijeni ortadan kaldırmaya yarar. Atmosferik gazlar çözeltide hala çözülürken porfirin-lipit içeren lipit çözeltilerinin depolanması önerilmez (Şekil 1E).

Adım 2.10’da lipid çözeltisi, klinik olarak onaylanmış ultrason kontrast ajanı perflutren lipid mikroküreçlerinin nasıl satıldığına benzer şekilde basınçlı bir kafa boşluğuna sahip bir serum şişesindedir (Şekil 1F’yebenzer). İç çalışma, kapak kauçuk durdurucu gibi yumuşak bir malzemeyse Pyro-lipidlerin varlığı ile mekanik ajitasyon yoluyla kararlı mikrobubbles üretilemediğini göstermiştir. Bu nedenle, lipid çözeltisi kauçuk olmayan fenolik kapaklı bir örnek şişeye aktarılmıştı (Adım 4.1 ila 4.4, Şekil 3A ve 3B). Kafeunsuzorobütan gazı numune şişesine aktığında (Adım 4.1 ila 4.4), daha yoğun decafluorobutane numune şişesi kafa boşluğundaki atmosferik havayı yerinden etmelidir. Şu anda, Pyro-lipidlerin neden kauçuk durdurucularla mikrobubbles oluşturamadığı bilinmemektedir. Pyro-lipid olmadan, stabil mikrobubbles doğrudan kauçuk durduruculu serum şişelerinde yapılabilir4,7. Bu nedenle, serum şişesini gazdan arındırmak ve yeniden basınçlandırmak için Gaz Eşanjörü’nün kullanılması ve ardından serum şişesinin kendisini Pyro-lipid olmayan formülasyonlar4, 5,6, 7için ajite etmesi önerilir (bkz. “Diğer Protokoller ve Veriler”). Serum şişesinde mekanik olarak ajite edebilmenin avantajı, kafa boşluğunun basınçlandırılabilmesi ve serum şişesinin baş aşağı çevrilmesiyle boyut seçimi yapılabilmesidir8. Bu protokolde, %0 Pyro-lipid formülasyonu, Pyro-lipid içeren formülasyonlarla tutarlı olması için örnek bir şişeye (Adım 4.1 ila 4.4) aktarıldı. Ek olarak, daha uzun acyl lipid zincir uzunlukları, daha iyi van der Waals etkileşimleri nedeniyle daha kararlı damlacıklara neden olur19. Lipid kabuğu bileşimi, tüm lipit tipleri için 18-acyl zincir uzunluğu, ticari olarak mevcut olanlara göre seçildi. DSPE-PEG5K, polietilen glikol zincirlerinin varlığı, yapıların itici sterik kuvvetler yoluyla birleşmesini önlediği için tüm formülasyona dahil edildi (Adım1.1). Lipid hidrasyon sırasında, banyo sonicator banyo 70 °C (Adım 2.1) 18-acyl zincir uzunluğu lipid film18tamamen dağıtmak için yeterince yüksek olarak ayarlanmıştır. Daha uzun akil zincir uzunlukları için daha yüksek sıcaklıklar gerekecektir.

Daha yüksek Pyro-lipid yüklemesi, en üst düzeye çıkar porfirin yüklemesinden yararlanan belirli uygulamalar için istenebilecek optik emici ve floresan bileşenlerin konsantrasyonunu artıracaktır. Bununla birlikte, Pyro-lipid içeriği arttıkça, gözlemlenebilir damlacık konsantrasyonu azaldı ve çaplar arttı (Şekil 4 ve Tablo 1). Bu, optik floresan ve emiciliği özellikleri ile damlacık konsantrasyonu ve çapı arasındaki bir takası göstermektedir. Küçük sızdıran kaplar aracılığıyla in vivo birikimi için küçük çaplara öncelik vermesi gereken araştırmacılara veya yüksek miktarda damlacık enjekte edilmesi gerekiyorsa, Pyro-lipid yüklemesini artırmak damlacık dimeterinde artışa veya damlacık konsantrasyonunda azalmaya değmeyebilir. Yüksek damlacık konsantrasyonları ve/veya küçük damlacık çapları her şeyden önemliyse, Pyro-lipidler yerine benzer büyüklükteki eşlik eden tanı ajanları düşünülmelidir. % 1 Pyro-lipid damlacıkları konsantrasyonda bir azalmaya veya boyut artışına neden olmazken,% 1 Pyro-lipid yüklemesi doku arka planından floresan olarak makul bir şekilde tespit edilemeyecek kadar düşük olabilir. Bununla birlikte, porfirin moiety esnekliği, düşük konsantrasyonlu uygulamalar için daha uygun alternatif nicelik araçları sağlayacak fonksiyonelleştirme için birden fazla seçenek sunar. Örneğin, Pyro-lipidler positon emisyon tomografi görüntüleme ve gama sayma20için bakır-64 veya kütle spektrometresi kullanarak iz-metal nicelemesi için paladyum veya manyetik rezonans görüntüleme için manganez ile şelatlanabilir14.

Bazı deneyler sadece küçük bir damlacık çözeltisi hacmi gerektirebilirken, 1.85 mL örnek şişeyi doldurmak için lipid çözeltisinin 1 mL’si gereklidir. Goertz ve ark. elleçleme, kafa boşluğu basıncı, sıvı-gaz oranı ve hatta şişe şekli değişikliklerinin mikrobubble popülasyonlarını etkileyebileceğini göstermiştir17. Ajitasyon sırasında şişe sıcaklığı ve boyut seçimi de boyut dağılımını etkileyebilir. Bu nedenle, son kullanıcı tarafından optimize edilen yöntemler için damlacık yaparken mümkün olduğunca tutarlı olmak önemlidir. Açılmamış damlacıklar dondurulabilir (-20 °C) ve daha sonra ileride kullanılmak üzere çözülebilir, ancak bu durum boyut popülasyonlarını etkileyecektir.

Bir lipid çözeltisini mikrobubbles içine aktive eden ajitasyon prosedürü morfolojik olarak homojen bir popülasyon üretmez (Adım 4.6); bunun yerine, örnek mikrobubbles, multilameller vesicles, lipozomlar ve miseller18,21,22ile doldurulur. Mikrobubble boyutları mikron ve nanometre aralığını kapsarken, diğer yapılar büyük ölçüde 800 nm 23’ünaltındadır. Kullanılan boyutlandırma teknikleri bu çeşitli yapılar arasında ayrım yapmaz ve bu nedenle tedirgin sonrası mikrobubble örnekleri (Adım 4.6, Şekil 3C)ve yoğunlaşmış damlacık örnekleri (Adım 4.14, Şekil 3F)karışım olarak kabul edilmelidir. Ultrasona duyarsız montajlar (multilameller veziklinler, lipozomlar ve micelles) muhtemelen yoğuşma sonrası korunur ve faz değiştirilebilir çekirdekleri olmadığı için boyut değiştirmez. Coulter Sayacı bu farklı supramoleküler montajları ayırt edemediğinden, yoğuşma sonrasında nüfus büyüklüğündeki değişim, nano ölçekli yapıların bir kısmının geri döndürülemez olduğu ve bu büyüklükteki bölgede gözlemlenen nüfusa katkıda bulunduğu varsayımıyla yorumlanmalıdır. Ek olarak, bu yapılar bu örneklerin spektroskopik ve floresan imzalarına katkıda bulunur14. Misellerin, lipozomların/ vesiklelerin ve damlacıkların floresan ve emici imzaları, floresan söndürme dereceleri de dahil olmak üzerebenzerdir 14. Bu nedenle, Şekil 3C ila 3F, Şekil 4 , Şekil 5’tekiPBS seyreltilmiş örnek ve Şekil 6’dakiPBS seyreltilmiş numunede montajların bir karışımının olduğunu göz önünde bulundurmakönemlidir.

Boyut seçimi ve yoğuşma öncesinde (Adım 4.9) sonra, şamandıra kabarcıklarını Feshitan ve ark.21 tarafından açıklandığı gibi şamandıra olmayan montajlardan ayırmak için mikrobubble örneğini santrifüj ederek kabarcıksız montajları ortadan kaldırmak mümkündür. Bununla birlikte, bu tür boyut yalıtımlı örneklerin mikrobubble yoğuşması deneyleri, boyut yalıtım prosedürleri kullanılarak seçilen daha büyük öncül mikrobubble popülasyonlarının kullanılmasının daha büyük damlacıklar sağladığını ortaya koydu (spun sonrası kabarcık ve damlacık boyutlandırması için “Diğer Protokoller ve Veriler” Adım S5’e bakın). Bu protokol ile üretilen damlacıkların amaçlanan bir uygulaması mikrobubbles4,8,damlacık popülasyonlarına göre küçük boyutları nedeniyle pasif ekstravazasyon ve birikim platformu olduğundan mümkün olduğunca küçük damlacık popülasyonları istendi. Bu nedenle, bu protokol, son çözümde ultrasona duyarsız miseller, lipozomlar ve vesicles bulunsa bile, santrifüjleme yoluyla boyut izole edilmemiş tedirgin mikrobubble örnekleri kullandı. Bu, biyo-dağılım için nicelleştirme prosedürlerinin enjekte edilen tüm yapılar için sinyal elde edeceği ve sadece damlacıklarla sınırlı olmadığı anlamına gelir. Bununla birlikte, benzer büyüklükteki bu yapılar büyük olasılıkla öncelikle boyuta göre dikte edilen pasif bir mekanizma ile biriktiğinden, bu platformun vivoolarak kullanılması durumunda yapılabilecek ana çıkarımları değiştirmesi gerektiğinden şüphelenilmemektedir . Ultrasonlu ve ultrasonsuz deneysel kollar kullanan testler, sadece çözeltideki perflorokarbon çekirdek montajları ultrasona yanıt vereceği için biyo-dağılımdaki herhangi bir değişiklikden sorumlu olan ultrasona duyarlı damlacıklar olduğundan emin olmak için yapılabilir.

Ajitasyondan sonra, şişe 15 dakika dinlendi ve şişede bir bölüm gözlendi(Şekil 3C’ye karşı 3D). Yüzdürme yoluyla boyut seçimi, aktif bir mikrobubble çözeltisinden daha büyük yapıları / kabarcıkları ortadan kaldırmak için basit bir yöntemdir8,17. Bu durumda, çapı 5 μm’den büyük olan parçacıklar çoğunlukla boyut seçiminden sonra çıkarılmıştır (Şekil 4). Boyut seçiminin kapsamı, boyut seçimi17’ninsüresi kontrol edilerek ayarlanabilir. Sheeran ve arkadaşları, boyut seçmemenin, vaskülat8’itıkayan mikrobubbles üretilebileceği gösterilmiştir.

Perflorokarbonlar biyolojik olarak atıl olma avantajına sahiptir7. Decafluorobutane’nin kaynama noktası vücut sıcaklığının üzerinde -1,7 °C iken, damlacıklar 37 °C’ye maruz kaldığında hemen buharlaşmaz (Şekil 7B). Damlacıklar 37 °C’de meta-stabil olduğundan, damlacıkları mikrobubbles7,9’abuharlaştırmak için ek akustik enerjiye ihtiyaç vardır. Poprosky ve ark. basınçlandırma ile yoğunlaştırılmış porfirin damlacıklarını göstermiştir22. Bu, daha az yoğun perflorokarbonlar kullanırken uygulanabilir ve hatta gerekli bir yöntemdir, ancak yüksek basınçlar süreçte bazı kabarcıkları yok edebilir. Octafluoropropane (C3F8)-36.7 °C kaynama noktasına sahiptir, bu nedenle damlacık yoğuşması için hem soğutma hem de basınçlandırma gerekir. Bununla birlikte, daha hafif perflorokarbon daha az kararlı damlacıklara yol açar. Dodecafluoropentane (C5F12), 28° C kaynama noktası ile daha kararlı damlacıklara yol açabilir. Bununla birlikte, oda sıcaklığında bir sıvıdır ve buharlaşmak için daha güçlü akustik enerjilere ihtiyaç duyacaktır. Bu nedenle, ultrason kontrast maddesinin içeren gazının seçimi, imalat parametrelerine ek olarak amaçlanan biyolojik uygulamanın koşullarını göz önünde bulundurmalıdır. Bu protokolde yoğuşma için izopropanol banyosu -15 ila -17 °C (Adım 4.7.1 ve Adım 4.13) olarak ayarlanırken, diğer protokoller -10 °C 5,6kullandı. Yaygın bir kafeunsizorbütan çekirdekte bile, yoğuşma sıcaklığı eksipient bileşime, toplam lipit konsantrasyonuna ve lipid kabuğu bileşimine bağlı olarak değişebilir. Diğer formülasyonları kullanıyorsanız, çözeltinin donmasına neden olmadan uygun damlacık yoğuşmasını sağlamak için optimizasyon gerekebilir.

Damlacıklar mikrobubble öncüllerinden daha küçük ve daha kararlı olduğundan7, bazı tümör tiplerinin gelişmiş geçirgenlik ve tutma etkisi gibi belirli ilgi çekici dokulara ekstravaze etmek için pasif birikim mekanizmalarından daha iyi yararlanabilirler4,24. Floresan, optik emici ve akustik algılama yöntemleri ile14, alımı ölçmek için tek bir formülasyon kullanmak mümkündür. Ek olarak, bu platform damlacıkların akustik buharlaşmasının pasif seviyelerin ötesinde teslim edilen ajan fraksiyonunu iyileştirip iyileştiremeyeceği araştırmak için kullanılabilir16. Enjeksiyondan sonra ilgi çekici doku ve organlarda ajan biyo-dağılımını ölçmek için, hayvana bilinen miktarda Pyro-lipid damlacık enjekte edilmeli, kontrol setine bağlı olarak ultrason uygulanabilir veya uygulanamayabilir, hayvan önceden belirlenmiş bir zaman noktası feda edilmeli ve organlar çıkarılmalı ve tartılmalıdır. Organlar homojenize edilmeli, filtrelenmeli, dokuyu hücreden çıkarmak için yüzey aktif madde (deterjan) ile seyreltilmeli ve Pyro sinyallerine dayanarak organ kütlesi başına enjekte edilen doz yüzdelerini elde etmek için floresan veya UV-Vis spektroskopisi ile ölçülmelidir. Adım 5.4.5 (Şekil 5) ve Adım 5.5.5 (Şekil 6) için, Triton X-100 yüzey aktif madde (deterjan) 410 nm’de floresan olmadığı ve emici dalga boyları Pyro’nunkiyle örtüşmediği için numuneleri bozmak için kullanılmıştır.

Mikrobubbles UV-Vis absorbansı ile karakterize değildi. UV-Vis spektroskopunun lazer kaynağı dedektörle paralel olduğundan, herhangi bir büyük kabarcık ışığı dedektörden uzağa saçabilir ve daha optik emici görünmelerini sağlayabilir14. UV-Vis spektrofotometresinin aksine, floresan spektrofotometrenin dedektörü, kaynağın dedektöre müdahale etmesini önlemek için lazer kaynağına diktir/olmalıdır. UV-Vis, bozulmamış ve bozulmuş damlacık örneklerinin emilmesini ölçmek için kullanılmıştır (Adım 5.4, Şekil 5). 300 ila 800 nm, piro-lipid, Soret bandı (340 ila 500 nm) ve Q-bandı (640 ila 730 nm) olmak üzere iki ana absorbans bandı olarak absorbans dalga boyları olarak seçildi, bu aralıkta14. Bir damlacık (veya diğer supramoleküler yapılar) içine monte edildiğinde, Pyro-lipid’in Q-bant zirvesi kırmızı banttan 671 nm’den 700 nm’ye kaydırılır (Şekil 5). Bu supramoleküler yapı Triton gibi bir yüzey aktif madde tarafından bozulduğunda, tepe tekrar 671 nm14,15‘e kayar. Bu değişime dayanarak, Pyro-lipitlerin birleştirilmiş bir durumda mı yoksa bozulmuş bir durumda mı olduğunu söylemek mümkündür. İki tepenin oranı, zaman içinde montajların çürümesini tahmin etmek için kullanılabilir.

Floresan ölçümleri için (Adım 5.5, Şekil 6),birleştirilmemiş Pyro-lipid 14 için Soret bandı zirvesine karşılık geldiği için410nm’lik bir heyecan dalga boyu seçildi. PBS’deki bozulmamış montajların zirveleri olarak 600 ila 800 nm arasında bir emisyon dalga boyu aralığı seçildi ve Triton’daki bozulan Pyro lipitleri bu aralıkta yer alıyor. Floresandaki değişim ve artış (Şekil 6) bozulmamış (PBS’de 704 nm) ve bozulan (Triton’da 674 nm) numuneler yapı kaynaklı söndürme nedeniyle meydana geldi. Birleştirilmiş formda, Pyro-lipid molekülleri birbirine yakın bir şekilde paketlendi, böylece üretilen fotonlar yakındaki Pyro-lipid molekülleri tarafından emildi. Bu, bozulmamış ve bozulmuş söndürme verimliliğinde belirgindir. Bu nedenle, söndürmeyi hafifletmek ve biyo-dağıtım niceliği için sinyali en üst düzeye çıkarmak için örnekleri% 1 Triton X-100 gibi yüzey aktif madde (deterjan) olarak seyreltmek gerekir14.

Basitlik için, aynı doğrusal dizi ultrason dönüştürücüsü hem buharlaştırmak hem de görüntü için kullanılmıştır (Adım 6.5 ve 6.7, Şekil 7). Bu ultrason dönüştürücü (Malzeme Tablosu) damlacıkları buharlaştırmak için gerekli pik negatif basınçlara ulaşabiliyordu8. Bir tankın musluktan deiyonize su ile doldurulması, suda çözünen gazlar üretir (Adım 6.1). Buharlaşma ve görüntüleme ile sudaki çözünmüş gazlardan kaynaklanan paraziti en aza indirmek için, sudaki gazların atmosferle dengelenmesi için tankta 24 saat dinlendirildi (Adım 6.1). Alternatif olarak, deiyonize su yeterince güçlü bir vakuma bağlı yeterince büyük, sızdırmaz bir kapla gazdan arındırılabilir. Ultrason görüntüleri, damlacıklar düşük basınçlarda göze çarpmayan / ekojenik olmadığı için mikrobubbles’ın başarıyla yoğunlandığını göstermiştir (Şekil 7B). Damlacıkların gözlemlenebilir, ekojenik mikrobubbles içine buharlaştırdığı sadece daha yüksek çıkış basınçlarındaydı(Şekil 7D, 7F, 7H). Yoğunlaşma sonrası damlacık örneği miseller ve lipozomlar/veziküller içerirken, bu montajlar ekojenik olmayandır ve sadece damlacıklar ekojenik mikrobubbles içine buhar olabilir. Temel görüntüler oluşturmak için hayaletten bir PBS kontrolü aktı(Şekil 7A, 7C, 7E, 7G). PBS’de basınç arttıkça, kontrast oluşturulmedi. Bu, dönüştürücüden gelen yüksek basınçların tek başına su bazlı bir ortamda kendiliğinden kavitasyon üretemediğini ve bu nedenle üretilen diğer tüm kontrastın kullanılan ultrason kontrast maddesine atfedilebileceğini gösterdi. Çıkış basıncı çok yüksekse, üretilen mikrobubbles yok edilebilir. Basıncı kademeli olarak artırarak ve oluşturulan kontrastı gözlemleyerek, en uygun basınçbulunabilir 8. Damlacıkların dolaşım yarı ömrü, damlacıkların belirli zaman aralıkları olan buharlaştırılması ve zamanla oluşan kontrastın gözlemlenmesiyle benzer şekilde belirlenebilir7.

Özetle yoğuşma yöntemi ile farklı Pyro-lipid içeriğine sahip çok modlu faz değiştirme damlacıkları oluşturulmuştur. Boyutlandırma, Pyro-lipid yüklemesi ile mikrobubble/damlacık konsantrasyonu arasında bir takas olduğunu gösterdi. Nitelemeler, hem emicilik hem de floresanlarda bozulmamış ve bozulmuş formlarda farklılıklar olduğunu göstermiştir. Ultrason görüntüleme damlacıkların 37 °C’de ekojenik olmadığını ve yeterli basınçta ekojenik mikrobubbles içine buharlaştırılabilir olduğunu gösterdi. Nitelemeler ayrıca Pyro-lipid damlacıklarının damlacık biyo-dağılımı veya biriktirme testleri için eşlik eden tanı maddelerinin yerini alma potansiyelini göstermiştir. Gelecekteki çalışmalar, çıplak farelerde çözelti içi buharlaşma eşiklerini, çözelti içi stabiliteyi ve in vivo dolaşım sürelerini araştıracaktır.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, gaz değiştiricinin inşasına yardımcı olduğu için Dr. Brandon Helfield’a ve teknik tartışmalar için Dr. Miffy Hok Yan Cheng’e teşekkür eder. Yazarlar aşağıdaki finansman kaynaklarına teşekkür etmek istiyor: Ontario Lisansüstü Bursu, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri, Terry Fox Araştırma Enstitüsü ve Prenses Margaret Kanser Vakfı.

Materials

1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-5000] (ammonium salt) Avanti Polar Lipids 880220 Also known as "DSPE-PEG5K"
1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 855775 Also known as "DSPC"
Aluminum Foil Any brand
Aluminum Seals, Tear-Off VWR 16171-840 Standard Aluminum, 13 mm outer diameter
Bath Sonicator Any brand Capable of  sonicating and heating up to 70 °C,
Bio-Stor Screw Cap Vials National Scientific BS20NABP Plastic, 2 mL Skirted, with O-ring
Borosilicate glass clear serum vials VWR 16171-285 3 mL, 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter
Borosilicate Glass Sample Vial with Phenolic Screw Cap VWR 66011-020 1.85 mL, Short Form Style, 12 mm outer diameter, 35 mm height, 8-425 cap size
Borosilicate Glass Vial with Screw-On cap Any brand Sizes will depend on desired volumes
Chloroform  Any brand
Coulter Counter Elctrolyte Diluent Any brand Compatible with Coulter Counter
Decafluorobutane (C4F10) FluoroMed 355-25-9
Deionized Water Any brand
Dry Ice (Carbon Dioxide) Any brand
Dynamic Light Scattering (DLS) Particle Analyzer Any brand Capable of temperature control
E-Z Crimper, 13 mm Wheaton W225302 13 mm Standard Aluminum Seals
E-Z Decapper, 13 mm Wheaton W225352 13 mm Standard Aluminum Seals
Fluorescent Spectrophotometer Any brand Capable of 400 to 600 excitation and 300 to 800 nm emission detection, detector perpendicular to laser source
Fluorescent Spectrophotometer Compatible Cuvette Any brand Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm, all four sides are  optical windows 
Gas Exchanger Made in-house Refer to Supplementary Information – "Other Protocols and Data" for assembly instructions.
Glass syringes Any brand Sizes will depend on desired volumes
GLWR Custom Aperture Tube 10 um Beckman Coulter B42812 10 µm aperture, compatible with Beckman Coulter MultiSizer 4e
Glycerol Any brand
Insulated Styrofaom containers with lids Any brand
Isopropanol Any brand
Lyophilization-Style Rubber Stoppers VWR 71000-060 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter, 2-leg, Chlorobutyl
Membrane Diaphram Vacuum Pump Sartorius Stedim 16694-1-60-06 Adjustable pressure
Metal Tongs Any brand
Methanol Any brand
MS250 21 MHz Linear Array Ultrasound Transducer VisualSonics 21 MHz, Capable of B-mode and non-linear imaging.
MultiSizer 4e Beckman Coulter Capable of sizing from 0.2µm to 6 µm
Nalgene Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units Thermo Scientific 567-0010 Polyethersulfone (PES) membrane, 0.1μm pore size, 1000 mL volume. As Isoton II is non-sterile, can use Filter units multiple times
Needles, Conventional BD 305176 20 gauge, 1.5 inch length
Nitrogen Gas Any brand Make sure there are regulator valves and tubes to direct the flow. Setup will be dependend on brand and source.
Parafilm Any brand Called "wax film" in the protocol.
Phosphate Buffered Saline (PBS) Any brand 1X, 7.4 pH
Pipette Any brand Sizes will depend on desired volumes
Pipette Tips Any brand Sizes will depend on desired volumes
Plastic Syringes Any brand 1 mL, 3 mL, and 30 mL. With Luer Lock connections
Polyethersulfone (PES) Membrane Filter Any brand 0.2 µm pore size
Propylene Glycol Any brand
Pyropheophorbide conjugated 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine Made in-house Also known as "Pyro-SPC". Refer to "Supplementary Information – Other Protocols and Data" for synthesis.
Thermometer Any brand (-20 to 100 °C)
Triton X-100 Any brand Also known as "2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol"
Ultrapure Water Any brand Type 1 Purity
Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer Any brand Capable of absorbance from 300 to 800 nm, at least 0.5 nm resolution
Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer Compatible Cuvette, 1 cm Path Length Any brand Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm
Vacuum Desiccator Any brand
Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform VisualSonics Pre-clinical ultrasound imaging system
Vialmix Bristol-Myers-Squibb Called "mechanical agitator" in the protocol. Agitates for 45 s.
Vortex Mixer Any brand
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gramiak, R., Shah, P. M. Echocardiography of the aortic root. Investigative Radiology. 3 (5), 356-366 (1968).
  2. Ferrara, K., Pollard, R., Borden, M. Ultrasound microbubble contrast agents: fundamentals and application to gene and drug delivery. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 415-447 (2007).
  3. Bing, K. F., Howles, G. P., Qi, Y., Palmeri, M. L., Nightingale, K. R. Blood-brain barrier (BBB) disruption using a diagnostic ultrasound scanner and Definity in mice. Ultrasound in Medicine and Biology. 35 (8), 1298-1308 (2009).
  4. Helfield, B. L., et al. Investigating the accumulation of submicron phase-change droplets in tumors. Ultrasound in Medicine and Biology. 49 (10), 2891 (2020).
  5. Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons. Biomaterials. 33 (11), 3262-3296 (2012).
  6. Sheeran, P. S., et al. Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2016).
  7. Yoo, K., et al. Impact of encapsulation on in vitro and in vivo performance of volatile nanoscale phase-shift perfluorocarbon droplets. Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (8), 1836-1852 (2018).
  8. Sheeran, P. S., et al. Image-guided ultrasound characterization of volatile sub-micron phase-shift droplets in the 20-40 MHz frequency range. Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (3), 795-807 (2016).
  9. Sheeran, P. S., et al. More than bubbles: creating phase-shift droplets from commercially available ultrasound contrast agents. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (2), 531-540 (2017).
  10. Chen, C. C., et al. Targeted drug delivery with focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening using acoustically-activated nanodroplets. Journal of Controlled Release. 172 (3), 795-804 (2013).
  11. Wu, S. Y., et al. Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets. Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002 (2018).
  12. Lee, J. Y., et al. Ultrasound-enhanced siRNA delivery using magnetic nanoparticle-loaded chitosan-deoxycholic acid nanodroplets. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), 1601246 (2017).
  13. Cao, Y., et al. Drug release from phase-changeable nanodroplets triggered by low-intensity focused ultrasound. Theranostics. 8 (5), 1327-1339 (2018).
  14. Huynh, E., Jin, C. S., Wilson, B. C., Zheng, G. Aggregate enhanced trimodal porphyrin shell microbubbles for ultrasound, photoacoustic, and fluorescence imaging. Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 796-801 (2014).
  15. Zheng, G., et al. Low-density lipoprotein reconstituted by pyropheophorbide cholesteryl oleate as target-specific photosensitizer. Bioconjugate Chemistry. 13 (3), 392-396 (2002).
  16. Dhaliwal, A., Zheng, G. Improving accessibility of EPR-insensitive tumor phenotypes using EPR-adaptive strategies: Designing a new perspective in nanomedicine delivery. Theranostics. 9 (26), 8091-8108 (2019).
  17. Goertz, D. E., de Jong, N., vander Steen, A. F. Attenuation and size distribution measurements of Definity and manipulated Definity populations. Ultrasound in Medicine and Biology. 33 (9), 1376 (2007).
  18. Pellow, C., Acconcia, C., Zheng, G., Goertz, D. E. Threshold-dependent nonlinear scattering from porphyrin nanobubbles for vascular and extravascular applications. Physics in Medicine and Biology. 63 (21), 215001 (2018).
  19. Kwan, J. J., Borden, M. A. Lipid monolayer collapse and microbubble stability. Advances in Colloid and Interface Science. 183, 82-99 (2012).
  20. Overchuk, M., et al. Subtherapeutic Photodynamic Treatment Facilitates Tumor Nanomedicine Delivery and Overcomes Desmoplasia. Nano Letters. 21 (1), 344-352 (2021).
  21. Feshitan, J., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. Microbubble size isolation by differential centrifugation. Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).
  22. Paproski, R. J., et al. Porphyrin nanodroplets: Sub-micrometer ultrasound and photoacoustic contrast imaging agents. Small. 12 (3), 371-380 (2016).
  23. Periyasamy, P. C., Leijten, J. C. H., Dijkstra, P. J., Karperien, M., Post, J. N. Nanomaterials for the local and targeted delivery of osteoarthritis drugs. Journal of Nanomaterials. 2021, 1-13 (2012).
  24. Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Research. 46 (12), 6387-6392 (1986).

Tags

Porphyrin DropletsMulti-modal Phase-changeLipid FilmLipid SolutionMicrobubblesDroplet FormationDecafluorobutane GasGas ExchangeInsulated ContainerDry IceRefrigeration

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Yoo, K., Dhaliwal, A., Chen, J., Sheeran, P. S., Zheng, G. Synthesis and Characterization of Multi-Modal Phase-Change Porphyrin Droplets. J. Vis. Exp. (176), e62665, doi:10.3791/62665 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image