Synthese und Charakterisierung multimodaler Phasenwechsel-Porphyrintröpfchen
Summary
In diesem Protokoll werden Methoden zur Synthese und Charakterisierung multimodaler Phasenwechsel-Porphyrintröpfchen beschrieben.
Abstract
Phasenwechseltröpfchen sind eine Klasse von Ultraschallkontrastmitteln, die sich bei Anwendung ausreichender akustischer Energie in echogene Mikroblasen in situ umwandeln können. Tröpfchen sind kleiner und stabiler als ihre Mikroblasen-Gegenstücke. Herkömmliche Ultraschallkontrastmittel sind jedoch nicht über akustische Rückkopplungsmessungen hinaus verfolgbar, was die Quantifizierung der Bioverteilung oder Akkumulation von Kontrastmitteln ex vivo erschwert. Forscher müssen sich möglicherweise auf fluoreszierende oder optisch absorbierende diagnostische Begleitpartikel verlassen, um auf die Bioverteilung zu schließen. Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, die Schritte zur Erstellung multimodaler Phasenwechsel-Porphyrintröpfchen mit einer Kondensationsmethode detailliert zu beschreiben. Porphyrine sind fluoreszierende Moleküle mit unterschiedlichen Absorptionsbändern, die auf Lipide konjugiert und in Tröpfchen eingebaut werden können, um die Vielseitigkeit der Tröpfchen zu erweitern und eine robustere Bioverteilung zu ermöglichen und gleichzeitig die akustischen Eigenschaften beizubehalten. Sieben Formulierungen mit unterschiedlichen Porphyrin-Lipid- und Basenlipidgehalten wurden hergestellt, um Mikroblasen- und Tröpfchengrößenverteilungen zu untersuchen. Charakterisierungen, die für porphyrinhaltige Strukturen geeignet sind, werden ebenfalls im Protokoll beschrieben, um ihre analytische Vielseitigkeit in lösungshaltig zu demonstrieren. Die Dimensionierung zeigte, dass die nachkondensierten mittleren Durchmesser 1,72 bis 2,38 Mal kleiner waren als die Vorläuferpopulationen. Die Absorptionscharakterisierung zeigte, dass intakte Baugruppen einen Q-Band-Peak von 700 nm aufwiesen, während gestörte Proben einen Absorptionspeak bei 671 nm aufwiesen. Die Fluoreszenzcharakterisierung zeigte, dass intakte 30% Porphyrin-Lipid-Anordnungen fluoreszierend abgeschreckt wurden (>97%), wobei die Fluoreszenzrückgewinnung bei Störung erreicht wurde. Die akustische Verdampfung zeigte, dass Porphyrintröpfchen bei niedrigeren Drücken nicht echogen waren und bei ausreichenden Drücken in echogene Mikroblasen umgewandelt werden konnten. Diese Charakterisierungen zeigen das Potenzial für Porphyrintröpfchen, die Notwendigkeit von Absorptions- oder fluoreszenzbasierten begleitenden diagnostischen Strategien zur Quantifizierung der Bioverteilung von Ultraschallkontrastmitteln für die Verabreichung oder therapeutische Anwendungen in vivo oder ex vivozu eliminieren.
Introduction
Ultraschallbildgebung ist eine nicht-invasive, nichtionisierende Form der medizinischen Bildgebung, die akustische Wellen nutzt. Während Ultraschallgeräte tragbarer sind und Echtzeitbilder liefern können, kann die Ultraschallbildgebung unter einem geringen Kontrast leiden, was es für Sonographen schwierig macht, ähnlich echogene pathologische Merkmale zuverlässig zu unterscheiden. Um dieser Einschränkung entgegenzuwirken, können Mikroblasen in den Wirt injiziert werden, um den Gefäßkontrast zu verbessern. Mikroblasen sind mikrometergroße gasgefüllte Kontrastmittel, die sehr echogen zu akustischen Wellen sind und einen verbesserten Gefäßkontrast1,2bieten können. Die Schalen und Gaskerne von Mikroblasen können für verschiedene Anwendungen wie Bildgebung, Thrombolyse, Zellmembranpermeabilisierung oder transiente Gefäßöffnung angepasst werden2.
Ein Nachteil von Mikroblasen ist ihre kurze Zirkulationshalbwertszeiten. Zum Beispiel haben klinisch verfügbare Perflutren-Lipid-Mikrosphären nur eine Halbwertszeit von 1,3 Minuten3. Für lange Bildgebungssitzungen sind mehrere Injektionen von Mikroblasen erforderlich. Ein weiterer Nachteil von Mikroblasen sind ihre großen Durchmesser. Während Perflutren-Lipid-Mikrosphären etwa 1 bis 3 μm Durchmesser haben, klein genug, um in Gefäßen zu zirkulieren, sind sie zu groß, um zu extravasieren und sich passiv in interessanten Geweben wie Tumorenanzusammeln 4. Eine Strategie, um diese Einschränkungen zu überwinden, besteht darin, die Gaskern-Mikroblasen zu kleineren Flüssigkerntröpfchen zu kondensieren5,6. Während Tröpfchen in ihrem flüssigen Zustand nicht echogen sind, können sie bei Ultraschall mit ausreichend hohem Spitzenunterdruck zu Mikroblasen verdampft werden, wodurch ihre Fähigkeit, Kontrast zu liefern, wiedererlangt wird. Dies ermöglicht es dem Tröpfchen, die günstigere Pharmakokinetik eines kleinen Flüssigkeitskerns zu nutzen, während die Fähigkeit erhalten bleibt, Kontrast zu liefern, wenn er insoniert ist und ohne die chemische Zusammensetzung zu verändern4,7.
Decafluorbutan ist eine ideale Perfluorkohlenstoffverbindung zur Phasenverschiebung zwischen gasförmigen und flüssigenZuständen5,6,7. Decafluorbutan ermöglicht die Kondensation von Mikroblasen zu Tröpfchen mit Temperaturreduktion allein, während weniger dichte Perfluorkohlenwasserstoffe eine zusätzliche Druckbeauftauung erfordern5. Dieses schonende Verfahren minimiert die Zerstörung von Blasen während der Kondensation7,8,9. Da ihre Kerne flüssig sind, sind Tröpfchen nicht echogen und für Ultraschall unsichtbar. Bei Anwendung ausreichender akustischer oder thermischer Energie können die Flüssigkeitskerne jedoch wieder in einen gasförmigen Zustand verdampfen und echogene Mikroblasen erzeugen8. Diese Verdampfung ermöglicht die Kontrolle darüber, wann und wo Mikroblasen erzeugt werden sollen.
Während Tröpfchen für die passive Akkumulation, In-situ-Verdampfung oder Verbesserung der Zellpermeabilität4nützlich sind, können Tröpfchen (und ihre Fragmente) ex vivonicht abgebildet oder quantifiziert werden. Daher werden quantifizierbare Begleitdiagnostika, wie fluoreszierende4,10,11,magnetische Partikel12,optisch absorbierende Mittel13,als Analogon verwendet, um die Tröpfchenabgabe an gewebe von Interesse zu messen. Zum Beispiel verwendeten Helfield et al. eine Co-Injektion von fluoreszierenden Nanoperlen zur histologischen Bildquantifizierung von Mausorganen, da Tröpfchen nicht fluoreszierend nachgewiesen werden konnten4. Der Nachteil von Begleitdiagnostika besteht darin, dass die verfolgbare Komponente abhängig von ihrem individuellen pharmakokinetischen Profil unabhängig vom Tröpfchen wirken kann.
Glücklicherweise kann die Hülle aus Mikroblasen und Tröpfchen angepasst werden. Zum Beispiel demonstrierten Huynh et al. Ultraschallkontrastmittel mit Porphyrin-Lipid-Schalen, wodurch multimodale Mikroblasen erzeugt wurden14. Porphyrine sind eine Klasse organischer Verbindungen mit einer aromatischen Makrozyllstruktur14,15. Sie sind optisch absorbierend, fluoreszierend und können zu einer Vielzahl von Metallen für die Strahlentherapie, radionuklidbasierte Bildgebung oder spurenmetallbasierte Quantifizierung chelatisiert werden14. Ein Beispiel für Porphyrin ist Pyropheophorbid (Pyro). Durch die Konjugation von Pyro auf Lipide und die Einarbeitung von Pyro-Lipiden in Mikroblasen oder Tröpfchen können sie durch mehrere Modalitäten abgebildet und verfolgt werden: akustisch, fluoreszierend und durch Absorption14. Dieses multimodale Kontrastmittel könnte verwendet werden, um die Akkumulation zu verfolgen und zu quantifizieren. Dies könnte die Notwendigkeit von Begleitdiagnostika eliminieren, da die quantifizierbare Komponente jetzt auf die Schale konjugiert ist, was eine genauere Lieferquantifizierung ermöglicht16.
Hierin wird ein Protokoll zur Erstellung multimodaler Phasenwechsel-Porphyrintröpfchen beschrieben. Da Ultraschallkontrastmittel als Plattform für die Verabreichung von Medikamenten an interessante Gewebe wie Tumore2,4verwendet werden können, könnte sich die Erweiterung ihrer Nachweisbarkeit über den Ultraschall hinaus als nützlich für die Quantifizierung der Wirksamkeit der Verabreichung erweisen. Der Zweck dieser Tröpfchen besteht darin, verfolgbare Ultraschallkontrastmittel bereitzustellen, die in der Lage sind, passive Akkumulation in vivo, In-situ-Verdampfung und Akustik zu erzeugen und die Bioverteilung oder Akkumulation von Ex-vivo-Organen zu quantifizieren, ohne auf sekundäre Sensoren angewiesen zu sein. Charakterisierungsmethoden werden auch beschrieben, um das Potenzial von Porphyrintröpfchen als Bioverteilungssensoren aufzuzeigen. Die Auswirkungen der Pyro-Lipid-Belastung in der Schale (0% bis 50% durch molares Verhältnis) werden ebenfalls diskutiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nach Addition aller Lipidkomponenten (Schritte 1.2 und 1.4.5, Abbildung 1A)wurde eine Lösung von Chloroform und Methanol (und Wasser, wenn Phosphatidsäurelipide wie DSPA vorhanden sind) zugegeben, um sicherzustellen, dass die Pyro-Lipid- und Nicht-Pyro-Lipidkomponenten vollständig homogenisiert waren (Schritt 1.5, Abbildung 1B). Um die Bildung von Lipidvesikeln mit heterogener Lipidzusammensetzung zu verhindern, wurden die gelösten Lipide getrocknet und als dünner Film auf das Innere der Wand der Durchstechflasche aufbeschichtet (Abbildung 1C). Die Beschichtung (Schritt 1.6) erleichtert auch die Hydratation (Schritt 2.1 bis 2.4), da sie die Oberfläche des getrockneten Films vergrößert. Die Trocknung (Schritt 1.6, Abbildung 1C)und das Staubsaugen (Schritt 1.8, Abbildung 1D)wurden durchgeführt, um sicherzustellen, dass das Chloroform und das Methanol vollständig verdampft sind, da diese Chemikalien die Bildung von Mikroblasen stören können. Während das Protokoll verkleinert werden kann, um Lipidlösungsvolumina von nur 1 ml zu erreichen, können größere Volumina die Variation von Fläschchen zu Durchstechflaschen reduzieren. Während dies das Risiko bergen kann, den Pyro-SPC bei Nichtgebrauch abzubauen, sollte der Lagerzustand der Lipidlösung (Schritt 2.9 bis 2.10) dieses Risiko verringern. Der Entgasungsschritt mit dem Gasaustauscher (Schritt 2.9.2, Abbildung 1F und Abbildung 2) dient dazu, so viel Sauerstoff wie möglich zu eliminieren, um eine Oxidation zu verhindern. Es wird nicht empfohlen, Lipidlösungen zu lagern, die Porphyrin-Lipide enthalten, während atmosphärische Gase noch in der Lösung gelöst sind (Abbildung 1E).
In Schritt 2.10 befindet sich die Lipidlösung in einer Serumdurchstechflasche mit einem unter Druck stehenden Kopfraum, ähnlich wie das klinisch zugelassene Ultraschallkontrastmittel Perflutren Lipidmikrosphären verkauft wird (ähnlich Abbildung 1F). Interne Arbeiten haben gezeigt, dass stabile Mikroblasen nicht durch mechanisches Rühren mit pyro-lipiden erzeugt werden können, wenn die Kappe ein weiches Material wie der Gummistopfen ist. Daher wurde die Lipidlösung in eine Probendurchstechflasche mit einer nicht gummiartigen Phenolkappe überführt (Schritte 4.1 bis 4.4, Abbildung 3A und 3B). Wenn das Decafluorbutangas in die Probendurchstechflasche (Schritte 4.1 bis 4.4) geflossen ist, sollte das dichtere Decafluorbutan die atmosphärische Luft im Kopfraum der Probenfläschchen verdrängen. Derzeit ist nicht bekannt, warum Pyro-Lipide keine Mikroblasen mit Gummistopfen bilden können. Ohne Pyro-Lipide können stabile Mikrobläschen direkt in den Serumfläschchen mit Gummistopfen hergestellt werden4,7. Daher wird empfohlen, den Gasaustauscher zu verwenden, um die Serumfläschchen zu entgasen und erneut unter Druck zu halten und dann die Serumfläschchen selbst für Nicht-Pyro-Lipid-Formulierungen4,5,6,7 zurühren (siehe “Andere Protokolle und Daten”). Der Vorteil der mechanischen Rühren in der Serumfläschchen besteht darin, dass der Kopfraum unter Druck stehen kann und die Größenauswahl durch Umkehren der Serumdurchstechflasche auf den Kopf gestellt werden kann8. In diesem Protokoll wurde die 0%ige Pyro-Lipid-Formulierung in eine Probendurchstechflasche (Schritte 4.1 bis 4.4) übertragen, um mit den Formulierungen übereinzusässen, die Pyro-Lipide enthielten. Darüber hinaus führen längere Acyllipidkettenlängen aufgrund besserer Van-der-Waals-Wechselwirkungen zu stabileren Tröpfchen19. Die Zusammensetzung der Lipidschale wurde auf der Grundlage der im Handel erhältlichen 18-Acyl-Kettenlänge für alle Lipidtypen ausgewählt. DSPE-PEG5K wurde in alle Formulierungen (Schritt 1.1) eingebaut, da das Vorhandensein der Polyethylenglykolketten das Zusammenwachsen von Strukturen durch abstoßende sterische Kräfte verhindert19. Während der Lipidhydratation wurde das Badbeschallungsbad auf 70 °C (Schritt 2.1) so hoch eingestellt, dass der 18-Acyl-Kettenlängen-Lipidfilm18vollständig dispergiert werden konnte. Für längere Acylkettenlängen sind höhere Temperaturen erforderlich.
Eine höhere Pyrolipidbelastung würde die Konzentration optisch absorbierender und fluoreszierender Komponenten erhöhen, was für bestimmte Anwendungen, die von einer maximierten Porphyrinbelastung profitieren, wünschenswert sein kann. Mit zunehmendem Pyrolipidgehalt nahm jedoch die beobachtbare Tröpfchenkonzentration ab und die Durchmesser nahmen zu (Abbildung 4 und Tabelle 1). Dies veranschaulicht einen Kompromiss zwischen optischen Fluoreszenz- und Absorptionseigenschaften gegenüber Tröpfchenkonzentration und -durchmesser. Für Forscher, die kleine Durchmesser für die In-vivo-Akkumulation durch kleine undichte Gefäße priorisieren müssen oder wenn eine hohe Konzentration von Tröpfchen injiziert werden muss, ist eine Erhöhung der Pyrolipidbelastung möglicherweise nicht die Erhöhung des Tröpfchendimeters oder die Abnahme der Tröpfchenkonzentration wert. Wenn hohe Tröpfchenkonzentrationen und/oder kleine Tröpfchendurchmesser von größter Bedeutung sind, sollten anstelle von Pyrolipiden ähnlich große Begleitdiagnostika in Betracht gezogen werden. Während 1% Pyro-Lipid-Tröpfchen nicht zu einer Abnahme der Konzentration oder Vergrößerung führten, kann 1% Pyro-Lipid-Belastung zu niedrig sein, um aus dem Gewebehintergrund fluoreszierend nachweisbar zu sein. Die Flexibilität des Porphyrin-Anteils bietet jedoch mehrere Optionen für die Funktionalisierung, die alternative Quantifizierungsmittel bieten, die für Anwendungen mit niedriger Konzentration besser geeignet sind. Zum Beispiel können Pyro-Lipide mit Kupfer-64 für die Positon-Emissions-Tomographie und Gammazählung20oder mit Palladium für die Spurenmetallquantifizierung mittels Massenspektrometrie oder mit Mangan für die Magnetresonanztomographie14chelatisiert werden.
Während einige Experimente möglicherweise nur ein kleines Volumen der Tröpfchenlösung erfordern, wird 1 ml der Lipidlösung benötigt, um die 1,85 ml Probendurchstechflasche zu füllen. Goertz et al. zeigten, dass Änderungen der Handhabung, des Kopfraumdrucks, des Flüssigkeits-Gas-Verhältnisses und sogar der Form der Durchstechflasche alle Mikroblasenpopulationen beeinflussen können17. Die Fläschchentemperatur während des Rührens und der Größenauswahl kann auch die Größenverteilung beeinflussen. Daher ist es für die vom Endbenutzer optimierten Methoden wichtig, bei der Tröpfchenherstellung so konsistent wie möglich zu sein. Ungeöffnete Tröpfchen können eingefroren (-20 ° C) und später für die zukünftige Verwendung aufgetaut werden, dies wirkt sich jedoch auf die Größenpopulationen aus.
Das Agitationsverfahren, bei dem eine Lipidlösung in Mikroblasen aktiviert wird, erzeugt keine morphologisch homogene Population (Schritt 4.6); Vielmehr ist die Probe mit Mikroblasen, multilamellaren Vesikeln, Liposomen und Mizellengefüllt 18,21,22. Während Mikroblasengrößen den Mikrometer- und Nanometerbereich umfassen, liegen die anderen Strukturen weitgehend unter 800 nm 23. Die verwendeten Größentechniken unterscheiden nicht zwischen diesen verschiedenen Strukturen, so dass die nachrührten Mikroblasenproben (Schritt 4.6, Abbildung 3C)und die nachkondensierten Tröpfchenproben (Schritt 4.14, Abbildung 3F) als Mischungen angenommen werden müssen. Die ultraschallempfindlichen Anordnungen (multilamellare Vesikel, Liposomen und Mizellen) sind wahrscheinlich nach der Kondensation konserviert und ändern ihre Größe nicht, da sie keine phasenwechselbaren Kerne haben. Da der Coulter Counter nicht zwischen diesen verschiedenen supramolekularen Anordnungen unterscheiden kann, sollte die Verschiebung der Populationsgröße nach kondensation mit der Annahme interpretiert werden, dass ein teil der nanoskaligen Strukturen nicht konvertierbar ist und zur beobachteten Population in dieser Größenregion beiträgt. Zusätzlich tragen diese Strukturen zu den spektroskopischen und fluoreszierenden Signaturen dieser Probenbei 14. Die Fluoreszenz- und Absorptionssignaturen von Mizellen, Liposomen/Vesikeln und Tröpfchen sind alle ähnlich, einschließlich ihres Grades der Fluoreszenzabschreckung14. Daher ist es wichtig zu berücksichtigen, dass es eine Mischung von Baugruppen in den Abbildungen 3C bis 3F, Abbildung 4, der PBS-verdünnten Probe in Abbildung 5und der PBS-verdünnten Probe in Abbildung 6gibt.
Nach der Größenauswahl und vor der Kondensation (Schritt 4.9) ist es möglich, die Nicht-Blasen-Baugruppen zu eliminieren, indem die Mikroblasenprobe zentrifugiert wird, um die auftriebsfähigen Blasen von den nicht auftriebsfähigen Baugruppen zu trennen, wie von Feshitan et al.beschrieben. 21 Der Grad der Trennung kann durch Einstellung der Spinkraft und -dauer gesteuert werden. Experimente zur Mikroblasenkondensation solcher größenisolierten Proben ergaben jedoch, dass die Verwendung der größeren Vorläufer-Mikroblasenpopulationen, die mit Größenisolationsverfahren ausgewählt wurden, größere Tröpfchen ergab (siehe “Andere Protokolle und Daten” Schritt S5 für die Dimensionierung von blasen und Tröpfchen nachgesponnen). Da eine beabsichtigte Anwendung von Tröpfchen, die mit diesem Protokoll hergestellt werden, aufgrund ihrer geringen Größe im Vergleich zu Mikroblasen4,8eine Plattform für passive Extravasation und Akkumulation ist, wurden möglichst kleine Tröpfchenpopulationen gewünscht. So verwendete dieses Protokoll post-agitierte Mikroblasenproben, die nicht durch Zentrifugation größenisoliert wurden, auch wenn dies bedeutete, dass ultraschallunempfindliche Mizellen, Liposomen und Vesikel in der vorhanden waren. Dies bedeutet, dass Quantifizierungsverfahren für die Bioverteilung Signale für alle injizierten Strukturen ableiten und nicht nur auf die Tröpfchen beschränkt sind. Da sich diese ähnlich großen Strukturen jedoch höchstwahrscheinlich über einen passiven Mechanismus ansammeln, der in erster Linie von der Größe diktiert wird, wird nicht vermutet, dass dies die wichtigsten Rückschlüsse ändern sollte, die gemacht werden können, wenn diese Plattform in vivoverwendet werden soll, obwohl alle diese Aspekte je nach Kontext, in dem die Plattform verwendet werden kann, individuell betrachtet werden sollten. Tests mit Experimentellenarmen mit und ohne Ultraschall können durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die ultraschallempfindlichen Tröpfchen für Änderungen der Bioverteilung verantwortlich sind, da nur die Perfluorkohlenstoff-Kernanordnungen in der Lösung auf Ultraschall reagieren.
Nach dem Rühren wurde die Durchstechflasche 15 Minuten lang ruhen und eine Trennwand in der Durchstechflasche beobachtet (Abbildung 3C versus 3D). Die Größenauswahl über Auftrieb ist eine einfache Methode, um die größeren Strukturen/Blasen aus einer aktivierten Mikroblasenlösung8,17zuentfernen. In diesem Fall wurden Partikel mit Durchmessern größer als 5 μm meist nach Größenauswahl entfernt (Abbildung 4). Der Umfang der Größenauswahl kann durch Steuern der Dauer der Größenauswahl17eingestellt werden. Sheeran et al. haben gezeigt, dass keine Größenauswahl zu erzeugten Mikroblasen führen kann, die vaskulatureverschließen 8.
Perfluorkohlenwasserstoffe haben den Vorteil, dass sie biologisch inertsind 7. Während der Siedepunkt von Decafluorbutan -1,7 °C über der Körpertemperatur liegt, verdampfen die Tröpfchen nicht sofort, wenn sie 37 °C ausgesetzt werden (Abbildung 7B). Da die Tröpfchen bei 37 °C metastabil sind, wird zusätzliche akustische Energie benötigt, um die Tröpfchen zu Mikroblasen zu verdampfen7,9. Poprosky et al. haben Porphyrintröpfchen nachgewiesen, die durch Druckbeaufschlagung kondensiert wurden22. Dies ist eine praktikable und sogar essentielle Methode, wenn weniger dichte Perfluorkohlenwasserstoffe verwendet werden, aber hohe Drücke können dabei einige Blasen zerstören. Octafluorpropan(C3F8)hat einen Siedepunkt von -36,7 °C, so dass sowohl Kühlung als auch Druckbeaufigung für die Tröpfchenkondensation erforderlich ist. Der leichtere Perfluorkohlenstoff führt jedoch zu weniger stabilen Tröpfchen. Dodecafluoropentan(C5F12)kann zu stabileren Tröpfchen mit einem Siedepunkt von 28 °C führen. Es ist jedoch eine Flüssigkeit bei Raumtemperatur und benötigt stärkere akustische Energien, um zu verdampfen. Daher sollte bei der Wahl des enthaltenden Gases des Ultraschallkontrastmittels neben den Parametern seiner Herstellung auch die Bedingungen seiner beabsichtigten biologischen Anwendung berücksichtigt werden. In diesem Protokoll wurde das Isopropanolbad für die Kondensation auf -15 bis -17 °C eingestellt (Schritt 4.7.1 und Schritt 4.13), während andere Protokolle -10 °C 5,6verwendeten. Selbst bei einem gemeinsamen Decafluorbutankern kann die Kondensationstemperatur je nach Zusammensetzung des Hilfsstoffs, Gesamtlipidkonzentration und Lipidschalenzusammensetzung variieren. Bei Verwendung anderer Formulierungen kann eine Optimierung erforderlich sein, um eine ordnungsgemäße Tröpfchenkondensation zu gewährleisten, ohne dass die Lösung gefriert.
Da die Tröpfchen kleiner und stabiler sind als ihr Mikroblasenvorläufer7, können sie passive Akkumulationsmechanismen besser nutzen, um in bestimmte Gewebe von Interesse zu extravasieren, wie die erhöhte Permeabilität und Retentionswirkung bestimmter Tumortypen4,24. Mit fluoreszierenden, optisch absorbierenden und akustischen Nachweismethoden14ist es möglich, eine einzige Formulierung zur Quantifizierung der Aufnahme zu verwenden. Darüber hinaus kann diese Plattform verwendet werden, um zu untersuchen, ob die akustische Verdampfung von Tröpfchen die Zugeführte Wirkstofffraktion über die passiven Ebenen hinaus verbessern kann16. Um die Bioverteilung des Wirkstoffs in Geweben und Organen von Interesse nach der Injektion zu quantifizieren, sollte eine bekannte Menge an Pyro-Lipidtröpfchen in das Tier injiziert werden, Ultraschall kann je nach Kontrollsatz angewendet werden oder nicht, das Tier sollte zu einem vorher festgelegten Zeitpunkt geopfert werden und die Organe sollten entfernt und gewogen werden. Die Organe sollten homogenisiert, filtriert, in Tensid (Reinigungsmittel) verdünnt werden, um das Gewebe zu dezellularisieren, und mit Fluoreszenz- oder UV-Vis-Spektroskopie quantifiziert werden, um injizierte Dosisprozentsätze pro Organmasse basierend auf den Pyrosignalen zu erhalten. Für Schritt 5.4.5 (Abbildung 5) und Schritt 5.5.5 (Abbildung 6) wurde Triton X-100 Tensid (Reinigungsmittel) verwendet, um die Proben zu stören, da es bei 410 nm nicht fluoreszierend ist und seine Absorptionswellenlängen sich nicht mit pyros überlappen.
Mikroblasen wurden nicht mit UV-Vis-Absorption charakterisiert. Da die Laserquelle des UV-Vis-Spektroskops parallel zum Detektor ist, könnten alle großen Blasen Licht vom Detektor wegstreuen, wodurch sie optisch absorbierender erscheinen14. Im Gegensatz zum UV-Vis-Spektralphotometer ist/sollte der Detektor des Fluoreszenzspektrophotometers senkrecht zur Laserquelle stehen, um zu verhindern, dass die Quelle den Detektor stört. UV-Vis wurde verwendet, um die Absorption der intakten und gestörten Tröpfchenproben zu quantifizieren (Schritt 5.4, Abbildung 5). Als Absorptionswellenlängen wurden 300 bis 800 nm gewählt, da die beiden Hauptabsorptionsbänder des Pyrolipids, das Soret-Band (340 bis 500 nm) und das Q-Band (640 bis 730 nm), in diesen Bereichfallen 14. Wenn es zu einem Tröpfchen (oder anderen supramolekularen Strukturen) zusammengesetzt wird, wird der Q-Band-Peak von Pyro-Lipid von 671 nm auf 700 nm rot verschoben(Abbildung 5). Wenn diese supramolekulare Struktur durch ein Tensid wie Triton gestört wird, verschiebt sich der Peak zurück auf 671 nm14,15. Anhand dieser Verschiebung lässt sich feststellen, ob sich die Pyrolipide in einem zusammengesetzten Zustand oder in einem gestörten Zustand befinden. Das Verhältnis der beiden Peaks kann verwendet werden, um den Zerfall der Baugruppen im Laufe der Zeit abzuschätzen.
Für die Fluoreszenzmessungen (Schritt 5.5, Abbildung 6)wurde eine Anregungswellenlänge von 410 nm gewählt, da sie dem Soret-Bandpeak für unmontiertes Pyrolipid14entspricht. Es wurde ein Emissionswellenlängenbereich von 600 bis 800 nm gewählt, da die Peaks der intakten Baugruppen in PBS und gestörte Pyrolipide in Triton in diesem Bereich enthalten sind. Die Verschiebung und Zunahme der Fluoreszenz (Abbildung 6) zwischen den intakten (704 nm in PBS) und gestörten (674 nm in Triton) Proben trat aufgrund strukturinduzierter Abschreckung auf. In der zusammengesetzten Form wurden die Pyro-Lipidmoleküle eng zusammengepackt, so dass erzeugte Photonen von nahe gelegenen Pyro-Lipidmolekülen absorbiert wurden. Dies zeigt sich in der intakten versus gestörten Abschreckeffizienz. Daher ist es notwendig, Proben in Tensid (Reinigungsmittel) wie 1% Triton X-100 zu verdünnen, um das Abschrecken zu entlasten und das Signal für die Bioverteilungsquantifizierung zu maximieren14.
Der Einfachheit halber wurde derselbe lineare Array-Ultraschallwandler sowohl zum Verdampfen als auch zum Abbilden verwendet (Schritte 6.5 und 6.7, Abbildung 7). Dieser Ultraschallwandler (Table of Materials) war in der Lage, die notwendigen Spitzennegpressdrücke zu erreichen, die zum Verdampfen von Tröpfchen erforderlich waren8. Beim Befüllen eines Tanks mit entionisiertem Wasser aus einem Wasserhahn entstehen Gase, die sich im Wasser auflösen (Schritt 6.1). Um Störungen durch die gelösten Gase im Wasser durch Verdampfung und Bildgebung zu minimieren, wurde das Wasser für 24 h im Tank ruhen, damit sich die Gase im Wasser mit der Atmosphäre ausgleichen konnten (Schritt 6.1). Alternativ kann das entionisierte Wasser mit einem ausreichend großen, verschließbaren Behälter entgast werden, der mit einem ausreichend starken Vakuum verbunden ist. Die Ultraschallbilder zeigten, dass die Mikroblasen erfolgreich kondensiert wurden, da die Tröpfchen bei niedrigen Drücken nicht beobachtbar / nicht echogen waren (Abbildung 7B). Erst bei höheren Ausgangsdrücken verdampften die Tröpfchen zu beobachtbaren, echogenen Mikroblasen (Abbildung 7D, 7F, 7H). Während die postkondensierte Tröpfchenprobe Mizellen und Liposomen/ Vesikel enthält, sind diese Anordnungen nicht echogen und nur Tröpfchen können zu echogenen Mikroblasen verdampfen. Eine PBS-Steuerung wurde durch das Phantom geflossen, um Basisbilder zu erstellen (Abbildungen 7A, 7C, 7E, 7G). Als der Druck im PBS zunahm, wurde kein Kontrast erzeugt. Dies deutete darauf hin, dass die hohen Drücke des Wandlers in einem wasserbasierten Medium allein keine spontane Kavitation erzeugen konnten und somit alle anderen erzeugten Kontraste auf das verwendete Ultraschallkontrastmittel zurückzuführen waren. Ist der Ausgangsdruck zu hoch, können erzeugte Mikroblasen zerstört werden. Durch inkrementelle Erhöhung des Drucks und Beobachtung des erzeugten Kontrastes kann der optimale Druck gefunden werden8. Die Zirkulationshalbwertszeit der Tröpfchen kann auf ähnliche Weise bestimmt werden, indem die Tröpfchen in bestimmten Zeitintervallen verdampft und der im Laufe der Zeit erzeugte Kontrast beobachtet wird7.
Zusammenfassend wurden mit dem Kondensationsverfahren multimodale Phasenwechseltröpfchen mit unterschiedlichem Pyrolipidgehalt erzeugt. Die Dimensionierung zeigte, dass es einen Kompromiss zwischen pyrolipider Belastung und Mikroblasen-/Tröpfchenkonzentration gab. Charakterisierungen zeigten, dass es Unterschiede in intakten und gestörten Formen sowohl in der Absorption als auch in der Fluoreszenz gab. Ultraschallaufnahmen zeigten, dass Tröpfchen bei 37 °C nicht echogen waren und bei ausreichendem Druck in echogene Mikroblasen verdampfbar waren. Charakterisierungen zeigten auch das Potenzial von Pyro-Lipid-Tröpfchen, begleitende diagnostische Mittel für Tröpfchen-Bioverteilungs- oder Akkumulationstests zu ersetzen. Zukünftige Arbeiten werden Verdampfungsschwellen in Lösung, Stabilität in Lösung und In-vivo-Zirkulationsdauer bei nackten Mäusen untersuchen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Brandon Helfield für die Unterstützung beim Bau des Gasaustauschers und Dr. Miffy Hok Yan Cheng für technische Diskussionen. Die Autoren danken den folgenden Finanzierungsquellen: Ontario Graduate Scholarship, Canadian Institutes of Health Research, Terry Fox Research Institute und Princess Margaret Cancer Foundation.
Materials
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-5000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880220 | Also known as "DSPE-PEG5K" |
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 855775 | Also known as "DSPC" |
| Aluminum Foil | Any brand | ||
| Aluminum Seals, Tear-Off | VWR | 16171-840 | Standard Aluminum, 13 mm outer diameter |
| Bath Sonicator | Any brand | Capable of sonicating and heating up to 70 °C, | |
| Bio-Stor Screw Cap Vials | National Scientific | BS20NABP | Plastic, 2 mL Skirted, with O-ring |
| Borosilicate glass clear serum vials | VWR | 16171-285 | 3 mL, 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter |
| Borosilicate Glass Sample Vial with Phenolic Screw Cap | VWR | 66011-020 | 1.85 mL, Short Form Style, 12 mm outer diameter, 35 mm height, 8-425 cap size |
| Borosilicate Glass Vial with Screw-On cap | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Chloroform | Any brand | ||
| Coulter Counter Elctrolyte Diluent | Any brand | Compatible with Coulter Counter | |
| Decafluorobutane (C4F10) | FluoroMed | 355-25-9 | |
| Deionized Water | Any brand | ||
| Dry Ice (Carbon Dioxide) | Any brand | ||
| Dynamic Light Scattering (DLS) Particle Analyzer | Any brand | Capable of temperature control | |
| E-Z Crimper, 13 mm | Wheaton | W225302 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| E-Z Decapper, 13 mm | Wheaton | W225352 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| Fluorescent Spectrophotometer | Any brand | Capable of 400 to 600 excitation and 300 to 800 nm emission detection, detector perpendicular to laser source | |
| Fluorescent Spectrophotometer Compatible Cuvette | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm, all four sides are optical windows | |
| Gas Exchanger | Made in-house | Refer to Supplementary Information – "Other Protocols and Data" for assembly instructions. | |
| Glass syringes | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| GLWR Custom Aperture Tube 10 um | Beckman Coulter | B42812 | 10 µm aperture, compatible with Beckman Coulter MultiSizer 4e |
| Glycerol | Any brand | ||
| Insulated Styrofaom containers with lids | Any brand | ||
| Isopropanol | Any brand | ||
| Lyophilization-Style Rubber Stoppers | VWR | 71000-060 | 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter, 2-leg, Chlorobutyl |
| Membrane Diaphram Vacuum Pump | Sartorius Stedim | 16694-1-60-06 | Adjustable pressure |
| Metal Tongs | Any brand | ||
| Methanol | Any brand | ||
| MS250 21 MHz Linear Array Ultrasound Transducer | VisualSonics | 21 MHz, Capable of B-mode and non-linear imaging. | |
| MultiSizer 4e | Beckman Coulter | Capable of sizing from 0.2µm to 6 µm | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 567-0010 | Polyethersulfone (PES) membrane, 0.1μm pore size, 1000 mL volume. As Isoton II is non-sterile, can use Filter units multiple times |
| Needles, Conventional | BD | 305176 | 20 gauge, 1.5 inch length |
| Nitrogen Gas | Any brand | Make sure there are regulator valves and tubes to direct the flow. Setup will be dependend on brand and source. | |
| Parafilm | Any brand | Called "wax film" in the protocol. | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Any brand | 1X, 7.4 pH | |
| Pipette | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Pipette Tips | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Plastic Syringes | Any brand | 1 mL, 3 mL, and 30 mL. With Luer Lock connections | |
| Polyethersulfone (PES) Membrane Filter | Any brand | 0.2 µm pore size | |
| Propylene Glycol | Any brand | ||
| Pyropheophorbide conjugated 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Made in-house | Also known as "Pyro-SPC". Refer to "Supplementary Information – Other Protocols and Data" for synthesis. | |
| Thermometer | Any brand | (-20 to 100 °C) | |
| Triton X-100 | Any brand | Also known as "2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol" | |
| Ultrapure Water | Any brand | Type 1 Purity | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer | Any brand | Capable of absorbance from 300 to 800 nm, at least 0.5 nm resolution | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer Compatible Cuvette, 1 cm Path Length | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm | |
| Vacuum Desiccator | Any brand | ||
| Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform | VisualSonics | Pre-clinical ultrasound imaging system | |
| Vialmix | Bristol-Myers-Squibb | Called "mechanical agitator" in the protocol. Agitates for 45 s. | |
| Vortex Mixer | Any brand |
References
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