توليف وتوصيف متعدد مشروط مرحلة التغيير قطرات بورفيرين
Summary
في هذا البروتوكول، يتم تحديد طرق توليف وتميز قطرات بورفيرين متعددة الوسائط لتغيير الطور.
Abstract
قطرات تغيير المرحلة هي فئة من عوامل التباين بالموجات فوق الصوتية التي يمكن تحويلها إلى فقاعات صغيرة صدى في الموقع مع تطبيق الطاقة الصوتية الكافية. قطرات هي أصغر وأكثر استقرارا من نظرائهم microbubble. ومع ذلك ، فإن عوامل التباين التقليدية بالموجات فوق الصوتية لا يمكن تعقبها بعد قياسات التغذية المرتدة الصوتية ، مما يجعل تحديد عامل التباين التوزيع الحيوي أو التراكم في الجسم الحي أمرا صعبا. قد يضطر الباحثون إلى الاعتماد على جزيئات التشخيص المصاحبة الفلورية أو الماصة بصريا للاستدلال على التوزيع الحيوي. الغرض من هذا البروتوكول هو تفصيل الخطوات اللازمة لإنشاء قطرات بورفيرين متعددة الوسائط لتغيير الطور باستخدام طريقة التكثيف. البورفيرينات هي جزيئات فلورية ذات نطاقات امتصاص متميزة يمكن اقترانها بالدهون ودمجها في قطرات لتوسيع براعة القطرات ، مما يتيح توزيعا بيولوجيا أكثر قوة مع الاحتفاظ بالخصائص الصوتية. تم إجراء سبع تركيبات ذات محتويات مختلفة من البورفيرين والدهون والدهون الأساسية للتحقيق في توزيعات حجم الفقاعات الدقيقة والقطيرات. كما يتم وصف الأوصاف المناسبة للهياكل المحتوية على البورفيرين في البروتوكول لإظهار براعة تحليلية في الحل. وأظهر التحجيم أن متوسط القطر بعد المكثف كان 1.72 إلى 2.38 مرة أصغر من مجموعات السلائف. وأظهر توصيف الامتصاص أن التجمعات السليمة بلغت ذروتها في نطاق Q 700 نانومتر في حين بلغت العينات المعطلة ذروة امتصاص عند 671 نانومتر. أظهر توصيف الفلورية أن تجمعات البورفيرين والدهون سليمة بنسبة 30٪ تم إخمادها فلوريا (>97٪) ، مع تحقيق انتعاش الفلورية عند التعطيل. وأظهر التبخير الصوتي أن قطرات البورفيرين غير صدى عند الضغط المنخفض ويمكن تحويلها إلى فقاعات صغيرة صدى مع ضغوط كافية. هذه التوصيفات تظهر إمكانية قطرات البورفيرين للقضاء على الحاجة إلى ماصة أو الاستراتيجيات التشخيصية الرفيق القائم على الفلورسينس لتحديد عامل التباين بالموجات فوق الصوتية التوزيع الحيوي للتسليم أو التطبيقات العلاجية في الجسم الحي أو الجسم الحي السابق.
Introduction
التصوير بالموجات فوق الصوتية هو شكل غير الغازية، غير المؤينة من التصوير الطبي الذي يستخدم الموجات الصوتية. في حين أن الماسحات الضوئية بالموجات فوق الصوتية أكثر قابلية للحمل ويمكن أن توفر صورا في الوقت الفعلي ، يمكن أن يعاني التصوير بالموجات فوق الصوتية من تباين منخفض ، مما يجعل من الصعب على السونوغرافيين التمييز بشكل موثوق بين الميزات المرضية ذات الصدى بالمثل. لمواجهة هذا القيد ، يمكن حقن الفقاعات الصغيرة في المضيف لتحسين تباين الأوعية الدموية. Microbubbles هي غاز بحجم ميكرون شغل عوامل التباين التي هي صدى عالية لموجات الصوتية ويمكن أن توفر تعزيز تباينالسفينة 1،2. يمكن تصميم الأصداف ونواة الغاز من الفقاعات الدقيقة لتطبيقات مختلفة ، مثل التصوير ، انحلال الجلطات ، تغلغل غشاء الخلية ، أو فتح الأوعية الدمويةالعابرة 2.
عيب من microbubbles هو تداولها قصيرة نصف العمر. على سبيل المثال، المتاحة سريريا البيرفلوترين الدهون المجهرية لديها فقط نصف عمر 1.3 دقيقة3. لجلسات التصوير الطويلة، هناك حاجة إلى حقن متعددة من الفقاعات الدقيقة. عيب آخر من الفقاعات الصغيرة هي أقطارها الكبيرة. في حين أن الفلورفلورين الدهون المجهرية حوالي 1 إلى 3 ميكرومتر في القطر، صغيرة بما يكفي لتعميم في الأوعية الدموية، فهي كبيرة جدا للبذخ وتتراكم بشكل سلبي في الأنسجة ذات الأهمية، مثل الأورام4. استراتيجية واحدة للتغلب على هذه القيود هو تكثيف الفقاعات الصغيرة الغاز الأساسية في أصغر، قطرات السائل الأساسية5،6. في حين أن القطرات ليست صدى في حالتها السائلة ، يمكن تبخيرها إلى فقاعات صغيرة عند التعرض للموجات فوق الصوتية مع ضغط سلبي ذروة عالية بما فيه الكفاية ، واستعادة قدرتها على توفير التباين. وهذا يسمح للقيرة للاستفادة من الدوائية أكثر ملاءمة من السائل الأساسية الصغيرة، مع الاحتفاظ بالقدرة على توفير التباين عند الرنانة ودون تغيير التركيب الكيميائي4،7.
ديكافلوروبوتان هو مركب البيرفلوروكربون المثالي لتحويل المرحلة بين الدول الغازية والسائلة5،6،7. Decafluorobutane يسمح لتكثيف الفقاعات الصغيرة في قطرات مع انخفاض درجة الحرارة وحدها، في حين أن أقل كثافة البيرفلوروكربون تتطلب الضغط إضافية5. هذا الأسلوب لطيف يقلل من تدمير فقاعات أثناء التكثيف7،8،9. كما النوى السائلة، قطرات غير echogenic وغير مرئية للموجات فوق الصوتية. ومع ذلك ، مع تطبيق ما يكفي من الطاقة الصوتية أو الحرارية ، يمكن للنوى السائلة أن تتبخر مرة أخرى إلى حالة غازية ، مما يولد فقاعات صغيرة صدى8. يسمح هذا التبخير بالتحكم في متى وأين تولد الفقاعات الصغيرة.
في حين أن قطرات مفيدة للتراكم السلبي، في الموقع التبخير، أو تحسين نفاذية الخلية4،قطرات (وشظاياها) لا يمكن تصويرها أو كميا ex vivo. لذلك ، يتم استخدام عامل التشخيص المصاحب القابل للقياس الكمي ، مثل الفلورسنت4و10و11والجسيمات المغناطيسية12والعوامل الماصة بصريا13، كنظير لقياس تسليم القطيرات إلى الأنسجة ذات الاهتمام. على سبيل المثال، استخدم هيلفيلد وآخرون حقنة مشتركة من حبات النانو الفلورية للقياس الكمي لصورة الأنسجة لأعضاء الماوس حيث لا يمكن اكتشاف قطرات فلورية4. عيب عوامل التشخيص المصاحبة هو أن المكون القابل للتتبع قد يعمل بشكل مستقل عن القطيرات اعتمادا على ملفه الدوائي الفردي.
لحسن الحظ ، يمكن تخصيص قشرة الفقاعات الصغيرة والقطرات. على سبيل المثال، أظهرت Huynh وآخرون وكلاء التباين بالموجات فوق الصوتية مع قذائف البورفيرين الدهون، وخلق microbubbles متعددة الوسائط14. البورفيرينات هي فئة من المركبات العضوية مع هيكل دوري العطرية14،15. فهي ماصة بصريا، الفلورسنت، ويمكن أن تكون chelated إلى مجموعة واسعة من المعادن للعلاج الإشعاعي، والتصوير القائم على النويدات المشعة، أو تتبع القياس الكمي القائم على المعادن14. ومن الأمثلة على البورفيرين بيروفيوفورد (بيرو). من خلال اقتران بيرو على الدهون ، ودمج الدهون في الدهون في الفقاعات الصغيرة أو قطرات تسمح لهم أن تكون مصورة وتتبع من خلال طرائق متعددة : صوتيا ، فلوريا ، ومن خلال امتصاص14. ويمكن استخدام عامل التباين المتعدد الوسائط هذا لتتبع التراكم وقياسه كميا. وهذا يمكن أن يلغي الحاجة إلى عوامل التشخيص المصاحبة حيث يتم الآن اقتران المكون القابل للقياس الكمي على القشرة ، مما يتيح تحديد كمية التسليمبدقة أكبر 16.
هنا ، يتم تحديد بروتوكول لإنشاء قطرات بورفيرين متعددة الوسائط لتغيير المرحلة. كما الموجات فوق الصوتية التناقضات وكلاء يمكن استخدامها كمنصة لتسليم المخدرات إلى الأنسجة ذات الأهمية، مثل الأورام2،4،وتوسيع نطاق الكشف عنها وراء الموجات فوق الصوتية يمكن أن تكون مفيدة لقياس كمية فعالية التسليم. الغرض من هذه القطرات هو توفير عوامل التباين بالموجات فوق الصوتية القابلة للتتبع القادرة على التراكم السلبي في الجسم الحي، في التبخير الصوتي في الموقع ، ومع إمكانية تحديد التوزيع الحيوي أو التراكم من أجهزة الجسم الحي السابق دون الاعتماد على أجهزة الاستشعار الثانوية. كما يتم تحديد طرق التوصيف لعرض إمكانات قطرات البورفيرين كأجهزة استشعار للتوزيع الحيوي. كما تناقش آثار تحميل الدهون بيرو في قذيفة (0٪ إلى 50٪ بنسبة الضرس).
Protocol
Representative Results
Discussion
بعد إضافة جميع مكونات الدهون معا (الخطوتان 1.2 و 1.4.5، الشكل 1A)،تمت إضافة محلول الكلوروفورم والميثانول (والماء إذا كانت الدهون الحمضية فوسفاتيديك مثل DSPA موجودة) لضمان أن مكونات الدهون بيرو والدهون وغير بيرو كانت متجانسة تماما (الخطوة 1.5، الشكل 1B). لمنع تشكيل الحويصلات الدهنية مع تكوين الدهون غير المتجانسة ، تم تجفيف الدهون الذائبة والمغلفة على الجزء الداخلي من جدار القارورة كفيلم رقيق(الشكل 1C). الطلاء (الخطوة 1.6) يجعل أيضا الترطيب (الخطوة 2.1 إلى 2.4) أسهل لأنه يزيد من مساحة سطح الفيلم المجفف. وقد تم التجفيف (الخطوة 1.6، الشكل 1C)والكنس (الخطوة 1.8، الشكل 1D)لضمان تبخر الكلوروفورم والميثانول بالكامل لأن هذه المواد الكيميائية يمكن أن تعطل تكوين الفقاعات الدقيقة. في حين يمكن تقليص البروتوكول لجعل أحجام محلول الدهون منخفضة إلى 1 مل ، يمكن أن تقلل الأحجام الكبيرة من التباين من القارورة إلى القارورة. وفي حين أن هذا قد ينطوي على خطر الحط من قدرة البرو – SPC في حين لا تستخدم، فإن حالة تخزين محلول الدهون (الخطوة 2-9 إلى 2.10) كان المقصود منها الحد من هذا الخطر. تعمل خطوة إزالة الغاز مع مبادل الغاز (الخطوة 2.9.2 والشكل 1F والشكل 2)على القضاء على أكبر قدر ممكن من الأكسجين لمنع الأكسدة. لا ينصح بتخزين المحاليل الدهنية التي تحتوي على البورفيرين الدهون في حين لا تزال تذاب غازات الغلاف الجوي في المحلول(الشكل 1E).
في الخطوة 2.10 ، يكون محلول الدهون في قارورة مصل مع مساحة رأس مضغوطة ، على غرار كيفية بيع عامل التباين بالموجات فوق الصوتية المعتمد سريريا perflutren lipid microspheres (على غرار الشكل 1F). وقد أظهرت الأعمال الداخلية الفقاعات الدقيقة مستقرة لا يمكن أن تتولد عن طريق التحريض الميكانيكية مع وجود الدهون بيرو إذا كان الغطاء مادة لينة مثل سدادة المطاط. لذلك ، تم نقل محلول الدهون إلى قارورة عينة ذات غطاء فينول غير مطاطي (الخطوات 4.1 إلى 4.4 ، الشكل 3A و 3B). عندما تم تدفق غاز ديكافلوروبوتان إلى قارورة العينة (الخطوات من 4.1 إلى 4.4)، يجب أن يحل ديكافلوروبوتان الأكثر كثافة محل الهواء الجوي في مساحة رأس القارورة العينة. حاليا، من غير المعروف لماذا الدهون بيرو غير قادر على تشكيل الفقاعات الصغيرة مع سدادات المطاط. مع عدم وجود الدهون بيرو، يمكن إجراء microbubbles مستقرة مباشرة في قارورة المصل مع سدادات المطاط4،7. وهكذا، فمن المستحسن استخدام مبادل الغاز إلى ديغا وإعادة الضغط على قارورة المصل ثم هياج قارورة المصل نفسها لصياغات غير بيرو الدهون4،5،6،7 (انظر “بروتوكولات وبيانات أخرى”). ميزة القدرة على التحريض ميكانيكيا في قارورة المصل هو مساحة الرأس يمكن الضغط عليها ويمكن القيام به من خلال اختيار حجم عكس قارورة المصل رأسا على عقب8. في هذا البروتوكول، تم نقل صيغة بيرو-الدهون 0٪ إلى قارورة عينة (الخطوات 4.1 إلى 4.4) لتكون متسقة مع الصيغ التي تحتوي على الدهون بيرو. بالإضافة إلى ذلك، أطول أطوال سلسلة الدهون أسيل يؤدي إلى قطرات أكثر استقرارا بسبب أفضل فان دير والس التفاعلات19. تم اختيار تكوين قذيفة الدهون على أساس ما كان متاحا تجاريا، وطول سلسلة 18 أسيل لجميع أنواع الدهون. تم دمج DSPE-PEG5K في جميع الصياغة (الخطوة 1.1) حيث أن وجود سلاسل جليكول البولي إيثيلين يمنع تجمع الهياكل عن طريق قوى ستيريك مثيرة للاشمئزاز19. خلال ترطيب الدهون، تم تعيين حمام سونيكاتور حمام إلى 70 درجة مئوية (الخطوة 2.1) عالية بما يكفي لتفريق تماما 18-acyl سلسلة طول فيلم الدهون18. لأطول أطوال سلسلة أسيل، وسوف تكون هناك حاجة إلى ارتفاع درجات الحرارة.
ومن شأن التحميل العالي للبيرو والدهون أن يزيد من تركيز مكونات الامتصاص البصري والفلور، وهو ما قد يكون مرغوبا فيه لبعض التطبيقات التي تستفيد من زيادة تحميل البورفيرين إلى أقصى حد. ومع ذلك، ومع زيادة محتوى البيرو-الدهون، انخفض تركيز القطيرات الملحوظة وزادت الأقطار(الشكل 4 والجدول 1). وهذا يوضح المفاضلة بين الفلورسينس البصري وخصائص الامتصاص مقابل تركيز قطرة وقطرها. للباحثين الذين يجب أن تعطي الأولوية لأقطار صغيرة لتراكم في الجسم الحي من خلال الأوعية الصغيرة راشح أو إذا كان تركيز عال من قطرات يحتاج إلى حقن, زيادة تحميل بيرو الدهون قد لا يكون يستحق الزيادة في ديميتر قطرة أو انخفاض في تركيز قطرة. إذا كانت تركيزات قطرات عالية و / أو قطر قطرة صغيرة هي ذات أهمية قصوى ، وينبغي النظر في عوامل التشخيص رفيق الحجم بالمثل بدلا من الدهون بيرو. في حين أن 1٪ قطرات بيرو الدهون لم تسفر عن انخفاض في التركيز أو زيادة في الحجم، 1٪ تحميل بيرو الدهون قد تكون منخفضة جدا لتكون قابلة للكشف بشكل معقول من خلفية الأنسجة الفلورية. ومع ذلك ، فإن مرونة moiety البورفيرين يوفر خيارات متعددة للوظائف التي من شأنها أن تضفي وسائل بديلة للقياس الكمي أكثر ملاءمة للتطبيقات منخفضة التركيز. على سبيل المثال، يمكن أن تكون chelated Pyro-lipids مع النحاس-64 للتصوير المقطعي انبعاثات البوزيتون وغاما العد20،أو مع البلاديوم لقياس كمي تتبع المعادن باستخدام قياس الطيف الكتلي، أو مع المنغنيز للتصوير بالرنين المغناطيسي14.
في حين أن بعض التجارب قد تتطلب فقط حجم صغير من محلول القطيرات ، هناك حاجة إلى 1 مل من محلول الدهون لملء قارورة عينة 1.85 مل. أثبت جورتز وآخرون أن التغييرات في المناولة وضغط مساحة الرأس ونسبة السائل إلى الغاز وحتى شكل القارورة يمكن أن تؤثر جميعها على مجموعات الفقاعات الدقيقة17. يمكن أن تؤثر درجة حرارة القارورة أثناء الهياج واختيار الحجم أيضا على توزيع الحجم. لذلك ، بالنسبة للأساليب الأمثل من قبل المستخدم النهائي ، من الأهمية بمكان أن تكون متسقة قدر الإمكان عند صنع قطرات. قد يتم تجميد قطرات غير مفتوحة (-20 درجة مئوية) وتذوب في وقت لاحق للاستخدام في المستقبل ولكن هذا سيؤثر على أعداد السكان الحجم.
إجراء التحريض الذي ينشط محلول الدهون في الفقاعات الدقيقة لا ينتج مجموعة متجانسة شكليا (الخطوة 4.6)؛ بدلا من ذلك ، يتم تعبئة العينة مع microbubbles ، vesicles multilamellar ، الليبوسومات ، وmicelles18،21،22. في حين أن أحجام microbubble تمتد على نطاق ميكرون ونانمتر، والهياكل الأخرى هي إلى حد كبير أقل من 800 نانومتر 23. تقنيات التحجيم المستخدمة لا تميز بين هذه الهياكل المختلفة، وبالتالي يجب افتراض عينات الفقاعات الصغيرة بعد الهياج (الخطوة 4.6، الشكل 3C)وعينات القطيرات بعد المكثف (الخطوة 4.14، الشكل 3F)كخلائط. من المرجح أن يتم الحفاظ على التجميعات غير الحساسة بالموجات فوق الصوتية (الحويصلات متعددة المصابيح والليبوسومات والميشيل) بعد التكثيف ولن تتغير حجمها لأنها لا تحتوي على نواة قابلة للتغيير التدريجي. وبما أن عداد كولتر لا يستطيع التمييز بين هذه التجمعات فوق الجزيئية المختلفة، ينبغي تفسير التحول في حجم السكان بعد التكثيف بافتراض أن نسبة ما من الهياكل النانوية غير قابلة للعكس وتسهم في السكان الملاحظين في تلك المنطقة ذات الحجم. بالإضافة إلى ذلك، تساهم هذه الهياكل في التوقيعات الطيفية والفلورسنتلهذه العينات 14. الفلورسينس والامتصاص التوقيعات من micelles، ليبوسوم / الحويصلات، وقطرات كلها متشابهة، بما في ذلك درجة من مضان إخماد14. وهكذا، من المهم أن تنظر إلى أن هناك خليط من الجمعيات في الأرقام 3C إلى 3F، الشكل 4،عينة برنامج تلفزيوني المخفف في الشكل 5،وعينة برنامج تلفزيوني المخفف في الشكل 6.
بعد اختيار الحجم وقبل التكثيف (الخطوة 4.9) ، من الممكن القضاء على التجميعات غير الفقاعة عن طريق الطرد المركزي لعينة الفقاعات الدقيقة لفصل الفقاعات المزدهرة عن التجميعات غير المزدهرة كما وصفها Feshitanوآخرون. ومع ذلك ، كشفت تجارب تكثيف microbubble لمثل هذه العينات المعزولة الحجم أن استخدام مجموعات الفقاعات الصغيرة السلائف الأكبر التي يتم اختيارها باستخدام إجراءات عزل الحجم أسفرت عن قطرات أكبر (انظر “بروتوكولات وبيانات أخرى” الخطوة S5 لفقاعة ما بعد نسج وتحجيم قطرة). منذ تطبيق المقصود من قطرات المنتجة مع هذا البروتوكول هو منصة للبذخ السلبي وتراكم بسبب صغر حجمها مقارنة مع microbubbles4،8، وكانت هناك حاجة مجموعات قطرات صغيرة قدر الإمكان. وهكذا، استخدم هذا البروتوكول عينات الفقاعات الدقيقة بعد الهياج التي لم تكن معزولة الحجم عن طريق الطرد المركزي، حتى لو كان ذلك يعني أن الميكليس غير الحساس بالموجات فوق الصوتية، والليبوسومات، والحويصلات كانت موجودة في الحل النهائي. وهذا يعني أن إجراءات القياس الكمي للتوزيع البيولوجي ستستمد إشارة لجميع الهياكل المحقونة ولا تقتصر على القطرات فقط. ومع ذلك ، نظرا لأن هذه الهياكل ذات الحجم المماثل تتراكم على الأرجح عبر آلية سلبية يمليها الحجم في المقام الأول ، فلا يشتبه فيأن هذا يجب أن يغير الاستدلالات الرئيسية التي يمكن إجراؤها إذا كان لهذا المنبر أن يستخدم في الجسم الحي ، على الرغم من أنه يجب النظر في جميع هذه الجوانب بشكل فردي اعتمادا على السياق الذي يمكن فيه استخدام المنصة. يمكن إجراء اختبارات باستخدام أذرع تجريبية باستخدام الموجات فوق الصوتية وبدونها لضمان أن القطرات الحساسة للموجات فوق الصوتية هي المسؤولة عن أي تغييرات في التوزيع الحيوي ، حيث أن التجميعات الأساسية للبيرفلوروكربون في المحلول فقط هي التي ستستجيب للموجات فوق الصوتية.
بعد الهياج ، استراحت القارورة لمدة 15 دقيقة ولوحظ وجود قسم في القارورة(الشكل 3C مقابل 3D). اختيار الحجم عن طريق الطفو هو وسيلة بسيطة للقضاء على أكبر هياكل / فقاعات من حل microbubble تنشيط8،17. في هذه الحالة، تمت إزالة الجسيمات التي يزيد قطرها عن 5 ميكرومتر في الغالب بعد اختيار الحجم(الشكل 4). يمكن ضبط مدى تحديد الحجم من خلال التحكم في مدة اختيار الحجم17. وقد أظهرت شيران وآخرون أن عدم اختيار الحجم يمكن أن يؤدي إلى الفقاعات الصغيرة المتولدة التي تحصين الأوعيةالدموية 8.
البيرفلوروكربونات لديها ميزة كونها خاملة بيولوجيا7. في حين أن نقطة الغليان ديكافلوروبوتان هو -1.7 درجة مئوية، فوق درجة حرارة الجسم، وقطرات لا تتبخر على الفور عندما تتعرض ل37 درجة مئوية (الشكل 7B). كما قطرات هي الفوقية مستقرة في 37 درجة مئوية، وهناك حاجة إلى طاقة صوتية إضافية لتبخير قطرات إلى microbubbles7،9. وقد أظهرت Poprosky وآخرون قطرات البورفيرين مكثفة عن طريق الضغط22. هذا هو وسيلة قابلة للتطبيق وحتى ضرورية عند استخدام أقل كثافة البيرفلوروكربونات ولكن الضغوط العالية قد تدمر بعض الفقاعات في هذه العملية. Octafluoropropane (C3F8) لديه نقطة غليان -36.7 درجة مئوية ، لذلك هناك حاجة إلى كل من التبريد والضغط لتكثيف القطيرات. ومع ذلك ، فإن البيرفلوروكربون الأخف يؤدي إلى قطرات أقل استقرارا. دوديكافلوروبينتان (C5F12) يمكن أن يؤدي إلى قطرات أكثر استقرارا مع نقطة الغليان من 28 درجة مئوية. ومع ذلك، فهو سائل في درجة حرارة الغرفة، وسوف تحتاج إلى طاقات صوتية أقوى لتبخير. وبالتالي ، فإن اختيار الغاز المحتوي على عامل التباين بالموجات فوق الصوتية يجب أن يأخذ في الاعتبار شروط تطبيقه البيولوجي المقصود بالإضافة إلى معايير تصنيعه. في هذا البروتوكول، تم تعيين حمام ايزوبروبانول للتكثيف إلى -15 إلى -17 درجة مئوية (الخطوة 4.7.1 والخطوة 4.13) في حين استخدمت بروتوكولات أخرى -10 درجة مئوية 5،6. حتى مع وجود نواة ديكافلوروبوتان شائعة ، قد تختلف درجة حرارة التكثيف اعتمادا على التركيب الأولي ، وتركيز الدهون الكلي ، وتكوين قشرة الدهون. إذا كنت تستخدم تركيبات أخرى، قد تكون هناك حاجة إلى التحسين لضمان التكثيف القطيرات المناسبة دون التسبب في حل لتجميد.
كما قطرات هي أصغر وأكثر استقرارا من السلائف microbubble7، فإنها يمكن أن تستفيد بشكل أفضل من آليات التراكم السلبي للبذخ في بعض الأنسجة ذات الأهمية ، مثل نفاذية وتعزيز تأثير الاحتفاظ ببعض أنواع الأورام4،24. مع الفلورسنت، ماصة بصريا، والأساليب الصوتية للكشف14،فمن الممكن استخدام صياغة واحدة لقياس امتصاص. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذه المنصة للتحقيق فيما إذا كان التبخير الصوتي للقطرات يمكن أن يحسن كسر العامل المسلم خارج المستوياتالسلبية 16. لتحديد التوزيع الحيوي للعامل في الأنسجة والأعضاء ذات الأهمية بعد الحقن ، يجب حقن كمية معروفة من قطرات الدهون في الحيوان ، وقد يتم تطبيق الموجات فوق الصوتية أو لا يتم تطبيقها اعتمادا على مجموعة التحكم ، وينبغي التضحية بالحيوان بنقطة زمنية محددة مسبقا ، وينبغي إزالة الأعضاء ووزنها. يجب تجانس الأعضاء وتصفيتها وتمييعها في السطحي (المنظفات) لإزالة الخلايا من الأنسجة ، وقياسها كميا مع التحليل الطيفي الفلوري أو الأشعة فوق البنفسجية للحصول على نسب الجرعة المحقونة لكل كتلة عضو استنادا إلى إشارات بيرو. بالنسبة للخطوة 5.4.5(الشكل 5)والخطوة 5.5.5(الشكل 6)،تم استخدام مادة Triton X-100 السطحية (المنظفات) لتعطيل العينات لأنها غير فلورية عند 410 نانومتر ولا تتداخل أطوالها الموجية للامتصاص مع أطوال بيرو.
لم تكن تتميز الفقاعات الدقيقة بامتصاص الأشعة فوق البنفسجية. وبما أن مصدر الليزر للأشعة فوق البنفسجية-فيس يوازي الكاشف، فإن أي فقاعات كبيرة يمكن أن تبعثر الضوء بعيدا عن الكاشف، مما يجعلها تبدو أكثر امتصاصا بصريا14. وخلافا لمطياف الأشعة فوق البنفسجية- فيس، فإن كاشف مطياف الطيف الفلوري هو/ينبغي أن يكون عموديا على مصدر الليزر لمنع المصدر من التداخل مع الكاشف. تم استخدام الأشعة فوق البنفسجية فيس لقياس امتصاص عينات القطيرات السليمة والمعطلة (الخطوة 5.4، الشكل 5). تم اختيار 300 إلى 800 نانومتر كأطوال موجية للامتصاص حيث يقع النطاقان الرئيسيان للامتصاص من البيرو-الدهون، وهما نطاق سوريت (340 إلى 500 نانومتر) والفرقة Q (640 إلى 730 نانومتر)، ضمن هذا النطاق14. عند تجميعها في قطرة (أو غيرها من الهياكل فوق الجزيئية)، وQ-الفرقة الذروة من بيرو الدهون هو أحمر تحول من 671 نانومتر إلى 700 نانومتر(الشكل 5). عندما يتم تعطيل هذا الهيكل فوق الجزيئي من قبل السطحي مثل تريتون، والتحولات الذروة مرة أخرى إلى 671 نانومتر14،15. وبناء على هذا التحول، من الممكن معرفة ما إذا كانت الدهون في بيرو في حالة تجميع أو في حالة تعطل. ويمكن استخدام نسبة من اثنين من قمم لتقدير تسوس الجمعيات مع مرور الوقت.
لقياسات الفلورسينس (الخطوة 5.5، الشكل 6)،تم اختيار الطول الموجي للإثارة من 410 نانومتر كما يتوافق مع ذروة الفرقة سوريت لبيرو الدهون غير مجمعة14. تم اختيار نطاق الطول الموجي للانبعاثات من 600 إلى 800 نانومتر حيث يتم احتواء قمم التجميعات السليمة في PBS وتعطل الدهون البيرو في تريتون ضمن هذا النطاق. التحول وزيادة في الفلورسينس(الشكل 6)بين سليمة (704 نانومتر في برنامج تلفزيوني) وتعطل (674 نانومتر في تريتون) وقعت العينات بسبب التبريد الناجم عن الهيكل. في الشكل المجمع ، كانت جزيئات بيرو الدهون معبأة معا بشكل وثيق بحيث تم امتصاص الفوتونات المولدة بواسطة جزيئات Pyro-lipid القريبة. وهذا واضح في كفاءة التبريد السليمة مقابل المعطلة. وبالتالي ، فمن الضروري لتخفيف العينات في السطحي (المنظفات) مثل 1 ٪ تريتون X – 100 لتخفيف إخماد وتعظيم إشارة لتوزيع الحيوية الكمي14.
للبساطة، تم استخدام محول الموجات فوق الصوتية الصفيف الخطي نفسه للتبخير والصورة (الخطوتان 6.5 و 6.7، الشكل 7). وكان هذا محول الموجات فوق الصوتية (جدول المواد) قادرة على الوصول إلى ذروة الضغوط السلبية اللازمة اللازمة لتبخيرقطرات 8. ملء خزان مع الماء deionized من الصنبور يولد الغازات التي تصبح مذابة في الماء (الخطوة 6.1). لتقليل التداخل من الغازات المذابة في الماء مع التبخير والتصوير ، تم استراحة الماء لمدة 24 ساعة في الخزان للسماح للغازات في الماء بالتوازن مع الغلاف الجوي (الخطوة 6.1). بدلا من ذلك، يمكن إزالة الغاز من الماء deionized مع حاوية قابلة للغلق بحجم كاف متصلة فراغ قوي بما فيه الكفاية. وأظهرت الصور بالموجات فوق الصوتية الفقاعات الدقيقة تم تكثيف بنجاح كما كانت قطرات غير قابلة للخطر / غير echogenic في الضغوط المنخفضة (الشكل 7B). إلا أنه في ارتفاع ضغط الناتج أن قطرات تبخرت في الفقاعات الدقيقة يمكن ملاحظتها ، echogenic (الشكل 7D، 7F ، 7H). في حين أن عينة القطيرات بعد المكثف تحتوي على micelles وliposomes / vesicles ، فإن هذه التجميعات غير صدى ويمكن أن تتبخر فقط قطرات في الفقاعات الدقيقة صدى. تدفق عنصر تحكم برنامج تلفزيوني من خلال الشبح لإنشاء صور خط الأساس(الأرقام 7A، 7C، 7E، 7G). ومع تزايد الضغط في برنامج تلفزيوني، لم يتم توليد أي تباين. وهذا يشير إلى أن الضغوط العالية من محول لا يمكن أن تنتج التجويف التلقائي في وسط المياه القائمة وحدها، وبالتالي يمكن أن يعزى كل التباين الأخرى المتولدة إلى عامل التباين بالموجات فوق الصوتية المستخدمة. إذا كان ضغط الناتج مرتفعا جدا ، فيمكن تدمير الفقاعات الصغيرة المتولدة. من خلال زيادة الضغط تدريجيا ومراقبة التباين المتولد ، يمكن العثور على الضغط الأمثل8. الدورة الدموية نصف عمر قطرات يمكن تحديدها بطريقة مماثلة عن طريق تبخير قطرات هي فترات زمنية معينة ومراقبة التباين المتولدة على مر الزمن7.
وباختصار، تم إنشاء قطرات متعددة الوسائط لتغيير المرحلة مع محتوى الدهون ببيرو متفاوتة مع طريقة التكثيف. وأظهر التحجيم أن هناك مقايضة بين تحميل الدهون بيرو وتركيز microbubble / قطرة. وأظهرت الأوصاف وجود اختلافات في الأشكال السليمة والمعطلة في كل من الامتصاص والفلور. أظهر التصوير بالموجات فوق الصوتية أن القطرات غير صدى عند 37 درجة مئوية وكانت قابلة للتبخير في فقاعات صغيرة صدى في ضغوط كافية. كما أظهرت الأوصاف إمكانية استبدال قطرات البيرو-الدهون بعوامل التشخيص المصاحبة لاختبارات التوزيع البيولوجي أو التراكم القطيرات. وسوف يحقق العمل المستقبلي في عتبات التبخير في المحلول ، والاستقرار في الحل ، وفي فترات الدورة الدموية في الجسم الحي في الفئران العارية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفان أن يشكرا الدكتور براندون هيلفيلد على المساعدة في بناء مبادل الغاز والدكتور ميفي هوك يان تشنغ على المناقشات التقنية. ويود المؤلفون أن يشكروا مصادر التمويل التالية: منحة أونتاريو للدراسات العليا، والمعاهد الكندية للبحوث الصحية، ومعهد تيري فوكس للأبحاث، ومؤسسة الأميرة مارغريت للسرطان.
Materials
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-5000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880220 | Also known as "DSPE-PEG5K" |
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 855775 | Also known as "DSPC" |
| Aluminum Foil | Any brand | ||
| Aluminum Seals, Tear-Off | VWR | 16171-840 | Standard Aluminum, 13 mm outer diameter |
| Bath Sonicator | Any brand | Capable of sonicating and heating up to 70 °C, | |
| Bio-Stor Screw Cap Vials | National Scientific | BS20NABP | Plastic, 2 mL Skirted, with O-ring |
| Borosilicate glass clear serum vials | VWR | 16171-285 | 3 mL, 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter |
| Borosilicate Glass Sample Vial with Phenolic Screw Cap | VWR | 66011-020 | 1.85 mL, Short Form Style, 12 mm outer diameter, 35 mm height, 8-425 cap size |
| Borosilicate Glass Vial with Screw-On cap | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Chloroform | Any brand | ||
| Coulter Counter Elctrolyte Diluent | Any brand | Compatible with Coulter Counter | |
| Decafluorobutane (C4F10) | FluoroMed | 355-25-9 | |
| Deionized Water | Any brand | ||
| Dry Ice (Carbon Dioxide) | Any brand | ||
| Dynamic Light Scattering (DLS) Particle Analyzer | Any brand | Capable of temperature control | |
| E-Z Crimper, 13 mm | Wheaton | W225302 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| E-Z Decapper, 13 mm | Wheaton | W225352 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| Fluorescent Spectrophotometer | Any brand | Capable of 400 to 600 excitation and 300 to 800 nm emission detection, detector perpendicular to laser source | |
| Fluorescent Spectrophotometer Compatible Cuvette | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm, all four sides are optical windows | |
| Gas Exchanger | Made in-house | Refer to Supplementary Information – "Other Protocols and Data" for assembly instructions. | |
| Glass syringes | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| GLWR Custom Aperture Tube 10 um | Beckman Coulter | B42812 | 10 µm aperture, compatible with Beckman Coulter MultiSizer 4e |
| Glycerol | Any brand | ||
| Insulated Styrofaom containers with lids | Any brand | ||
| Isopropanol | Any brand | ||
| Lyophilization-Style Rubber Stoppers | VWR | 71000-060 | 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter, 2-leg, Chlorobutyl |
| Membrane Diaphram Vacuum Pump | Sartorius Stedim | 16694-1-60-06 | Adjustable pressure |
| Metal Tongs | Any brand | ||
| Methanol | Any brand | ||
| MS250 21 MHz Linear Array Ultrasound Transducer | VisualSonics | 21 MHz, Capable of B-mode and non-linear imaging. | |
| MultiSizer 4e | Beckman Coulter | Capable of sizing from 0.2µm to 6 µm | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 567-0010 | Polyethersulfone (PES) membrane, 0.1μm pore size, 1000 mL volume. As Isoton II is non-sterile, can use Filter units multiple times |
| Needles, Conventional | BD | 305176 | 20 gauge, 1.5 inch length |
| Nitrogen Gas | Any brand | Make sure there are regulator valves and tubes to direct the flow. Setup will be dependend on brand and source. | |
| Parafilm | Any brand | Called "wax film" in the protocol. | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Any brand | 1X, 7.4 pH | |
| Pipette | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Pipette Tips | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Plastic Syringes | Any brand | 1 mL, 3 mL, and 30 mL. With Luer Lock connections | |
| Polyethersulfone (PES) Membrane Filter | Any brand | 0.2 µm pore size | |
| Propylene Glycol | Any brand | ||
| Pyropheophorbide conjugated 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Made in-house | Also known as "Pyro-SPC". Refer to "Supplementary Information – Other Protocols and Data" for synthesis. | |
| Thermometer | Any brand | (-20 to 100 °C) | |
| Triton X-100 | Any brand | Also known as "2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol" | |
| Ultrapure Water | Any brand | Type 1 Purity | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer | Any brand | Capable of absorbance from 300 to 800 nm, at least 0.5 nm resolution | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer Compatible Cuvette, 1 cm Path Length | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm | |
| Vacuum Desiccator | Any brand | ||
| Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform | VisualSonics | Pre-clinical ultrasound imaging system | |
| Vialmix | Bristol-Myers-Squibb | Called "mechanical agitator" in the protocol. Agitates for 45 s. | |
| Vortex Mixer | Any brand |
References
- Gramiak, R., Shah, P. M. Echocardiography of the aortic root. Investigative Radiology. 3 (5), 356-366 (1968).
- Ferrara, K., Pollard, R., Borden, M. Ultrasound microbubble contrast agents: fundamentals and application to gene and drug delivery. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 415-447 (2007).
- Bing, K. F., Howles, G. P., Qi, Y., Palmeri, M. L., Nightingale, K. R. Blood-brain barrier (BBB) disruption using a diagnostic ultrasound scanner and Definity in mice. Ultrasound in Medicine and Biology. 35 (8), 1298-1308 (2009).
- Helfield, B. L., et al. Investigating the accumulation of submicron phase-change droplets in tumors. Ultrasound in Medicine and Biology. 49 (10), 2891 (2020).
- Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons. Biomaterials. 33 (11), 3262-3296 (2012).
- Sheeran, P. S., et al. Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2016).
- Yoo, K., et al. Impact of encapsulation on in vitro and in vivo performance of volatile nanoscale phase-shift perfluorocarbon droplets. Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (8), 1836-1852 (2018).
- Sheeran, P. S., et al. Image-guided ultrasound characterization of volatile sub-micron phase-shift droplets in the 20-40 MHz frequency range. Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (3), 795-807 (2016).
- Sheeran, P. S., et al. More than bubbles: creating phase-shift droplets from commercially available ultrasound contrast agents. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (2), 531-540 (2017).
- Chen, C. C., et al. Targeted drug delivery with focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening using acoustically-activated nanodroplets. Journal of Controlled Release. 172 (3), 795-804 (2013).
- Wu, S. Y., et al. Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets. Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002 (2018).
- Lee, J. Y., et al. Ultrasound-enhanced siRNA delivery using magnetic nanoparticle-loaded chitosan-deoxycholic acid nanodroplets. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), 1601246 (2017).
- Cao, Y., et al. Drug release from phase-changeable nanodroplets triggered by low-intensity focused ultrasound. Theranostics. 8 (5), 1327-1339 (2018).
- Huynh, E., Jin, C. S., Wilson, B. C., Zheng, G. Aggregate enhanced trimodal porphyrin shell microbubbles for ultrasound, photoacoustic, and fluorescence imaging. Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 796-801 (2014).
- Zheng, G., et al. Low-density lipoprotein reconstituted by pyropheophorbide cholesteryl oleate as target-specific photosensitizer. Bioconjugate Chemistry. 13 (3), 392-396 (2002).
- Dhaliwal, A., Zheng, G. Improving accessibility of EPR-insensitive tumor phenotypes using EPR-adaptive strategies: Designing a new perspective in nanomedicine delivery. Theranostics. 9 (26), 8091-8108 (2019).
- Goertz, D. E., de Jong, N., vander Steen, A. F. Attenuation and size distribution measurements of Definity and manipulated Definity populations. Ultrasound in Medicine and Biology. 33 (9), 1376 (2007).
- Pellow, C., Acconcia, C., Zheng, G., Goertz, D. E. Threshold-dependent nonlinear scattering from porphyrin nanobubbles for vascular and extravascular applications. Physics in Medicine and Biology. 63 (21), 215001 (2018).
- Kwan, J. J., Borden, M. A. Lipid monolayer collapse and microbubble stability. Advances in Colloid and Interface Science. 183, 82-99 (2012).
- Overchuk, M., et al. Subtherapeutic Photodynamic Treatment Facilitates Tumor Nanomedicine Delivery and Overcomes Desmoplasia. Nano Letters. 21 (1), 344-352 (2021).
- Feshitan, J., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. Microbubble size isolation by differential centrifugation. Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).
- Paproski, R. J., et al. Porphyrin nanodroplets: Sub-micrometer ultrasound and photoacoustic contrast imaging agents. Small. 12 (3), 371-380 (2016).
- Periyasamy, P. C., Leijten, J. C. H., Dijkstra, P. J., Karperien, M., Post, J. N. Nanomaterials for the local and targeted delivery of osteoarthritis drugs. Journal of Nanomaterials. 2021, 1-13 (2012).
- Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Research. 46 (12), 6387-6392 (1986).
