Synthese en karakterisering van multimodale faseverandering porfyrinedruppels
Summary
In dit protocol worden methoden voor het synthetiseren en karakteriseren van multimodale faseverandering porfyrinedruppels beschreven.
Abstract
Faseveranderingsdruppels zijn een klasse van ultrasone contrastmiddelen die kunnen worden omgezet in echogene microbubbels in situ met de toepassing van voldoende akoestische energie. Druppeltjes zijn kleiner en stabieler dan hun microbubbel tegenhangers. Traditionele ultrasone contrastmiddelen zijn echter niet traceerbaar buiten akoestische feedbackmetingen, wat het kwantificeren van contrastmiddel biodistributie of accumulatie ex vivo moeilijk maakt. Onderzoekers moeten mogelijk vertrouwen op fluorescerende of optisch absorberende begeleidende diagnostische deeltjes om biodistributie af te leiden. Het doel van dit protocol is om stappen te beschrijven voor het maken van multimodale porfyrinedruppels met faseverandering met behulp van een condensatiemethode. Porfyrinen zijn fluorescerende moleculen met verschillende absorptiebanden die kunnen worden geconjugeerd op lipiden en in druppels kunnen worden opgenomen om de veelzijdigheid van druppels uit te breiden, waardoor een robuustere biodistributie mogelijk wordt met behoud van akoestische eigenschappen. Zeven formuleringen met verschillende porfyrine-lipide- en baselipideninhouden werden gemaakt om microbubbel- en druppelgrootteverdelingen te onderzoeken. Karakteriseringen die geschikt zijn voor porfyrine-bevattende structuren worden ook beschreven in het protocol om hun analytische veelzijdigheid in-oplossing aan te tonen. Sizing toonde aan dat de post-gecondenseerde gemiddelde diameters 1,72 tot 2,38 keer kleiner waren dan voorloperpopulaties. Absorptiekarakterisering toonde aan dat intacte assemblages een Q-bandpiek van 700 nm hadden, terwijl verstoorde monsters een absorptiepiek hadden bij 671 nm. Fluorescentiekarakterisering toonde intacte 30% porfyrine-lipideassemblages waren fluorescerend geblust (>97%), waarbij fluorescentieherstel werd bereikt bij verstoring. Akoestische verdamping toonde aan dat porfyrinedruppels niet-echogeen waren bij lagere drukken en konden worden omgezet in echogene microbubbels met voldoende druk. Deze karakteriseringen tonen het potentieel voor porfyrinedruppels om de noodzaak van absorptie- of fluorescentiegebaseerde begeleidende diagnostische strategieën te elimineren om de biodistributie van echografiecontrastmiddelen te kwantificeren voor levering of therapeutische toepassingen in vivo of ex vivo.
Introduction
Echografie is een niet-invasieve, niet-ioniserende vorm van medische beeldvorming die akoestische golven gebruikt. Hoewel ultrasone scanners draagbaarder zijn en realtime beelden kunnen bieden, kunnen echografiebeelden last hebben van een laag contrast, waardoor het voor sonografen moeilijk is om op betrouwbare wijze vergelijkbare echogene pathologische kenmerken te onderscheiden. Om deze beperking tegen te gaan, kunnen microbubbels in de gastheer worden geïnjecteerd om het vasculaire contrast te verbeteren. Microbubbels zijn met micron gevulde contrastmiddelen ter grootte van een micron die zeer echogeen zijn voor akoestische golven en een verbeterd vatcontrast kunnen bieden1,2. De schelpen en gaskernen van microbubbels kunnen worden aangepast voor verschillende toepassingen, zoals beeldvorming, trombolyse, celmembraanpermeabilisatie of voorbijgaande vasculaire opening2.
Een nadeel van microbubbels is hun korte oplagehalfwaardetijd. Klinisch beschikbare perflutren lipidemicrosferen hebben bijvoorbeeld slechts een halfwaardetijd van 1,3 minuten3. Voor lange beeldvormingssessies zijn meerdere injecties van microbubbels nodig. Een ander nadeel van microbubbels is hun grote diameters. Hoewel perflutren lipide microsferen ongeveer 1 tot 3 μm in diameter zijn, klein genoeg om in vasculatuur te circuleren, zijn ze te groot om te extravaseren en zich passief op te hopen in weefsels van belang, zoals tumoren4. Een strategie om deze beperkingen te overwinnen is om de gaskernmicrobubbels te condenseren tot kleinere, vloeibare kerndruppels5,6. Hoewel druppels niet echogeen zijn in hun vloeibare toestand, kunnen ze worden verdampt tot microbubbels bij blootstelling aan echografie met voldoende hoge pieknegatieve druk, waardoor ze hun vermogen om contrast te bieden terugkrijgen. Hierdoor kan de druppel profiteren van de gunstigere farmacokinetiek van een kleine vloeistofkern, terwijl het vermogen om contrast te bieden behouden wanneer geïnsoneerd en zonder de chemische samenstelling te veranderen4,7.
Decafluorbutaan is een ideale perfluorkoolstofverbinding voor faseverschuiving tussen gasvormige en vloeibare toestanden5,6,7. Decafluorbutaan maakt condensatie van microbubbels in druppels met alleen temperatuurverlaging mogelijk, terwijl minder dichte perfluorkoolwaterstoffen extra druk vereisen5. Deze zachte methode minimaliseert de vernietiging van bellen tijdens condensatie7,8,9. Omdat hun kernen vloeibaar zijn, zijn druppels niet-echogeen en onzichtbaar voor echografie. Met de toepassing van voldoende akoestische of thermische energie kunnen de vloeibare kernen echter weer verdampen in een gasvormige toestand, waardoor echogene microbubbels worden gegenereerd8. Deze verdamping maakt het mogelijk om te bepalen wanneer en waar microbubbels moeten worden gegenereerd.
Hoewel druppels nuttig zijn voor passieve accumulatie, in situ verdamping of verbetering van de celdoorlaatbaarheid4, kunnen druppels (en hun fragmenten) niet ex vivoin beeld worden gebracht of gekwantificeerd. Daarom worden kwantificeerbare begeleidende diagnostische middelen, zoals fluorescerend4,10,11,magnetische deeltjes12,optisch absorberende middelen13,gebruikt als een analoog om druppelafgifte aan weefsels van belang te meten. Helfield et al. gebruikten bijvoorbeeld een co-injectie van fluorescerende nanoparels voor histologische beeldkwantificering van muisorganen, omdat druppels niet fluorescerend konden worden gedetecteerd4. Het nadeel van begeleidende diagnostische middelen is dat de traceerbare component onafhankelijk van de druppel kan werken, afhankelijk van het individuele farmacokinetische profiel.
Gelukkig kan de schaal van microbubbels en druppels worden aangepast. Huynh et al. demonstreerden bijvoorbeeld ultrasone contrastmiddelen met porfyrine-lipideschalen, waardoor multimodale microbubbelsontstonden 14. Porfyrines zijn een klasse van organische verbindingen met een aromatische macrocylische structuur14,15. Ze zijn optisch absorberend, fluorescerend en kunnen worden gechelateerd tot een breed scala aan metalen voor radiotherapie, beeldvorming op basis van radionucliden of op sporenmetaal gebaseerde kwantificering14. Een voorbeeld van porfyrine is pyropheophorbide (Pyro). Door Pyro op lipiden te conjugeren, pyro-lipiden in microbubbels of druppels op te nemen, kunnen ze in beeld worden gebracht en gevolgd via meerdere modaliteiten: akoestisch, fluorescerend en door absorptie14. Dit multimodale contrastmiddel kan worden gebruikt om accumulatie te volgen en te kwantificeren. Dit zou de behoefte aan begeleidende diagnostische middelen kunnen elimineren, aangezien de kwantificeerbare component nu op de schaal is geconjugeerd, waardoor een nauwkeurigere leveringskwantificering mogelijk is16.
Hierin wordt een protocol voor het maken van multimodale faseverandering porfyrinedruppels geschetst. Omdat ultrasone contrastmiddelen kunnen worden gebruikt als een platform voor medicijnafgifte aan weefsels van belang, zoals tumoren2,4,kan het uitbreiden van hun detecteerbaarheid buiten echografie nuttig zijn voor de kwantificering van de werkzaamheid van de afgifte. Het doel van deze druppels is om traceerbare ultrasone contrastmiddelen te bieden die in staat zijn tot passieve accumulatie in vivo, in situ verdamping en akoestiek, en met het potentieel om biodistributie of accumulatie van ex vivo organen te kwantificeren zonder de afhankelijkheid van secundaire sensoren. Karakteriseringsmethoden worden ook geschetst om het potentieel van porfyrinedruppels als biodistributiesensoren te demonstreren. De effecten van Pyro-lipide belasting in de schaal (0% tot 50% door molaire verhouding) worden ook besproken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Na het toevoegen van alle lipidecomponenten samen (stappen 1.2 en 1.4.5, figuur 1A),werd een oplossing van chloroform en methanol (en water als fosfatidische zure lipiden zoals DSPA aanwezig zijn) toegevoegd om ervoor te zorgen dat de pyro-lipide en niet-pyrolipidecomponenten volledig werden gehomogeniseerd (stap 1.5, figuur 1B). Om de vorming van lipidenblaasjes met heterogene lipidesamenstelling te voorkomen, werden de opgeloste lipiden gedroogd en als een dunne film op de binnenkant van de wand van de injectieflacon gecoat (figuur 1C). De coating (stap 1.6) maakt ook de hydratatie (stap 2.1 tot 2.4) gemakkelijker omdat het het oppervlak van de gedroogde film vergroot. Het drogen (stap 1.6, figuur 1C)en het stofzuigen (stap 1.8, figuur 1D)werden gedaan om ervoor te zorgen dat de chloroform en methanol volledig verdampt waren, omdat deze chemicaliën de vorming van microbubbels kunnen verstoren. Hoewel het protocol kan worden verkleind om lipide-oplossingsvolumes zo laag als 1 ml te maken, kunnen grotere volumes de variatie tussen injectieflacons en flacons verminderen. Hoewel dit het risico kan lopen de Pyro-SPC te degraderen terwijl deze niet in gebruik is, was de opslagconditie van de lipide-oplossing (stap 2.9 tot 2.10) bedoeld om dat risico te verminderen. De ontgassingsstap met de gaswisselaar (Stap 2.9.2, Figuur 1F en Figuur 2) dient om zoveel mogelijk zuurstof te elimineren om oxidatie te voorkomen. Het wordt niet aanbevolen lipideoplossingen die porfyrine-lipiden bevatten op te slaan terwijl atmosferische gassen nog steeds in de oplossing zijn opgelost(figuur 1E).
In stap 2.10 bevindt de lipideoplossing zich in een serumflacon met een hoofdruimte onder druk, vergelijkbaar met hoe de klinisch goedgekeurde ultrasone contrastmiddel perflutren lipidemicrosferen worden verkocht (vergelijkbaar met figuur 1F). Intern werk heeft aangetoond dat stabiele microbubbels niet konden worden gegenereerd via mechanische agitatie met de aanwezigheid van Pyro-lipiden als de dop een zacht materiaal was zoals de rubberen stop. Daarom werd de lipide-oplossing overgebracht naar een monsterflacon met een niet-rubberen fenolische dop (stappen 4.1 tot 4.4, figuur 3A en 3B). Wanneer het decafluobutaangas in de injectieflacon van het monster werd gestroomd (stappen 4.1 tot en met 4.4), moet het dichtere decafluorbutaan de atmosferische lucht in de kopruimte van de injectieflacon van het monster verplaatsen. Momenteel is het onbekend waarom Pyro-lipiden geen microbubbels kunnen vormen met rubberen stoppen. Zonder Pyro-lipiden kunnen stabiele microbubbels direct in de serumflacons worden gemaakt met rubberen stoppen4,7. Daarom wordt aanbevolen om de gaswisselaar te gebruiken om de serumflacon te ontgassen en opnieuw onder druk te zetten en vervolgens de serumflacon zelf te roeren voor niet-pyrolipideformuleringen4,5,6,7 (zie “Andere protocollen en gegevens”). Het voordeel van het mechanisch kunnen roeren in de serumflacon is dat de headspace onder druk kan worden gezet en dat de grootteselectie kan worden gedaan door de serumflacon ondersteboven om te keren8. In dit protocol werd de 0% Pyro-lipide formulering overgebracht naar een monsterflacon (stappen 4.1 tot 4.4) om consistent te zijn met de formuleringen die pyrolipiden bevatten. Bovendien resulteren langere acyl lipide ketenlengtes in stabielere druppels door betere van der Waals interacties19. De samenstelling van de lipideschaal werd gekozen op basis van wat in de handel verkrijgbaar was, 18-acylketenlengte voor alle lipidetypen. DSPE-PEG5K werd opgenomen in alle formuleringen (stap 1.1) omdat de aanwezigheid van de polyethyleenglycolketens coalescentie van structuren via afstotende sterische krachten voorkomt19. Tijdens lipidenhydratatie werd het badsonapparaat ingesteld op 70 °C (stap 2.1) zo hoog genoeg om de lipidefilm met een lengte van 18 acylketens volledig te verspreiden18. Voor langere acylketenlengtes zijn hogere temperaturen vereist.
Hogere pyro-lipidebelasting zou de concentratie van optisch absorberende en fluorescerende componenten verhogen, wat gewenst kan zijn voor bepaalde toepassingen die profiteren van een maximale porfyrinebelasting. Naarmate het pyrolipidengehalte echter toenam, nam de waarneembare druppelconcentratie af en namen de diameters toe(figuur 4 en tabel 1). Dit illustreert een afweging tussen optische fluorescentie en absorptie-eigenschappen versus druppelconcentratie en diameter. Voor onderzoekers die prioriteit moeten geven aan kleine diameters voor in vivo accumulatie door kleine lekkende vaten of als een hoge concentratie druppels moet worden geïnjecteerd, is het verhogen van de pyro-lipidebelasting mogelijk niet de moeite waard om de druppeldimeter of de druppelconcentratie te verlagen. Als hoge druppelconcentraties en/of kleine druppeldiameters van het grootste belang zijn, moeten begeleidende diagnostische middelen van vergelijkbare grootte worden overwogen in plaats van pyrolipiden. Hoewel 1% pyro-lipidedruppels niet leidden tot een afname van de concentratie of toename in grootte, kan de pyro-lipidebelasting van 1% te laag zijn om redelijkerwijs fluorescerend te kunnen worden gedetecteerd vanaf de weefselachtergrond. De flexibiliteit van porfyrinegedeelte biedt echter meerdere opties voor functionalisatie die alternatieve manieren van kwantificering zullen bieden die meer geschikt zijn voor toepassingen met een lage concentratie. Pyro-lipiden kunnen bijvoorbeeld worden gechelateerd met koper-64 voor positonemissietomografie beeldvorming en gammatelling20, of met palladium voor trace-metaal kwantificering met behulp van massaspectrometrie, of met mangaan voor magnetische resonantie beeldvorming14.
Hoewel sommige experimenten slechts een klein volume van de druppeloplossing vereisen, is 1 ml lipide-oplossing nodig om de injectieflacon met het monster van 1,85 ml te vullen. Goertz et al. toonden aan dat veranderingen in hantering, headspace-druk, vloeistof-tot-gasverhouding en zelfs de vorm van de injectieflacon allemaal van invloed kunnen zijn op microbubbelpopulaties17. De temperatuur van de injectieflacon tijdens het roeren en de grootteselectie kan ook van invloed zijn op de grootteverdeling. Daarom is het voor de methoden die door de eindgebruiker zijn geoptimaliseerd, van cruciaal belang om zo consistent mogelijk te zijn bij het maken van druppels. Ongeopende druppels kunnen worden ingevroren (-20 °C) en later worden ontdooid voor toekomstig gebruik, maar dit zal van invloed zijn op de grootte van populaties.
De agitatieprocedure die een lipide-oplossing in microbubbels activeert, produceert geen morfologisch homogene populatie (stap 4.6); in plaats daarvan is het monster gevuld met microbubbels, multilamellaire blaasjes, liposomen en micellen18,21,22. Terwijl microbubbelgroottes het micron- en nanometerbereik overspannen, liggen de andere structuren grotendeels onder 800 nm 23. De gebruikte dimensioneringstechnieken maken geen onderscheid tussen deze verschillende structuren, en daarom moeten de nageroerde microbubbelmonsters (stap 4.6, figuur 3C)en de nagecondenseerde druppelmonsters (stap 4.14, figuur 3F) als mengsels worden aangenomen. De echo-ongevoelige assemblages (multilamellaire blaasjes, liposomen en micellen) zijn waarschijnlijk geconserveerd na condensatie en zullen niet van grootte veranderen omdat ze geen fasewisselbare kernen hebben. Aangezien de Coulter Counter geen onderscheid kan maken tussen deze verschillende supramoleculaire assemblages, moet de verschuiving in populatiegrootte na condensatie worden geïnterpreteerd met de veronderstelling dat een deel van de nanoschaalstructuren onoverwinnelijk is en bijdraagt aan de waargenomen populatie in dat groottegebied. Bovendien dragen deze structuren bij aan de spectroscopische en fluorescerende handtekeningen van deze monsters14. De fluorescentie- en absorptiehandtekeningen van micellen, liposoom / blaasjes en druppels zijn allemaal vergelijkbaar, inclusief hun mate van fluorescentie doven14. Het is dus belangrijk om te overwegen dat er een mengsel van samenstellingen is in de figuren 3C tot en met 3F, figuur 4,het pbs-verdunde monster in figuur 5en het pbs-verdunde monster in figuur 6.
Na het selecteren van de grootte en voorafgaand aan de condensatie (stap 4.9), is het mogelijk om de niet-bubbelassemblages te elimineren door het microbubbelmonster te centrifugeren om de drijvende bellen te scheiden van de niet-drijvende assemblages zoals beschreven door Feshitan et al.21 De mate van scheiding kan worden geregeld door de spinkracht en -duur aan te passen. Experimenten met microbubbelcondensatie van dergelijke grootte-geïsoleerde monsters onthulden echter dat het gebruik van de grotere voorlopermicrobubbelpopulaties die worden geselecteerd met behulp van grootte-isolatieprocedures grotere druppels opleverde (zie “Andere protocollen en gegevens” Stap S5 voor post-gesponnen bubbel- en druppelgrootte). Aangezien een beoogde toepassing van druppels geproduceerd met dit protocol een platform is voor passieve extravasatie en accumulatie vanwege hun kleine omvang in vergelijking met microbubbels4,8, druppelpopulaties die zo klein mogelijk zijn, waren gewenst. Dit protocol gebruikte dus post-geagiteerde microbubbelmonsters die niet op grootte werden geïsoleerd via centrifugatie, zelfs als dat betekende dat echo-ongevoelige micellen, liposomen en blaasjes aanwezig waren in de uiteindelijke oplossing. Dit impliceert wel dat kwantificeringsprocedures voor biodistributie signaal zullen afleiden voor alle geïnjecteerde structuren en niet beperkt zijn tot alleen de druppels. Aangezien deze structuren van vergelijkbare grootte zich echter hoogstwaarschijnlijk ophopen via een passief mechanisme dat voornamelijk wordt gedicteerd door de grootte, wordt niet vermoed dat dit de belangrijkste gevolgtrekkingen zou moeten veranderen die kunnen worden gemaakt als dit platform in vivomoet worden gebruikt , hoewel al deze aspecten individueel moeten worden overwogen, afhankelijk van de context waarin het platform kan worden gebruikt. Tests met experimentele armen met en zonder echografie kunnen worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat het de echogevoelige druppels zijn die verantwoordelijk zijn voor eventuele veranderingen in de bioverdeling, omdat alleen de perfluorkoolstofkernassemblages in de oplossing reageren op echografie.
Na agitatie werd de injectieflacon gedurende 15 minuten uitgerust en werd een partitie waargenomen in de injectieflacon(figuur 3C versus 3D). Grootteselectie via drijfvermogen is een eenvoudige methode om de grotere structuren / bubbels uit een geactiveerde microbubbeloplossingte elimineren 8,17. In dit geval werden deeltjes met een diameter van meer dan 5 μm meestal verwijderd na grootteselectie(figuur 4). De mate van grootte-selectie kan worden afgestemd door de duur van de maatselectie17te regelen. Sheeran et al. hebben aangetoond dat het niet selecteren van de grootte kan resulteren in gegenereerde microbubbels die vasculatuurafsluiten 8.
Perfluorkoolwaterstoffen hebben het voordeel dat ze biologisch inert zijn7. Hoewel het kookpunt van decafluorbutaan -1,7 °C is, boven de lichaamstemperatuur, verdampen de druppels niet onmiddellijk bij blootstelling aan 37 °C(figuur 7B). Omdat de druppels meta-stabiel zijn bij 37 °C, is extra akoestische energie nodig om de druppels te verdampen tot microbubbels7,9. Poprosky et al. hebben porfyrinedruppeltjes aangetoond die gecondenseerd zijn via druk22. Dit is een haalbare en zelfs essentiële methode bij het gebruik van minder dichte perfluorkoolwaterstoffen, maar hoge drukken kunnen sommige bellen in het proces vernietigen. Octafluorpropaan (C3F8) heeft een kookpunt van -36,7 °C, dus zowel koeling als overdruk is nodig voor druppelcondensatie. De lichtere perfluorkoolstof leidt echter tot minder stabiele druppels. Dodecafluoropentane (C5F12) kan leiden tot stabielere druppels met een kookpunt van 28 °C. Het is echter een vloeistof bij kamertemperatuur en heeft sterkere akoestische energieën nodig om te verdampen. De keuze van het bevattende gas van het ultrasone contrastmiddel moet dus rekening houden met de omstandigheden van de beoogde biologische toepassing ervan, naast de parameters van de fabricage. In dit protocol werd het isopropanolbad voor condensatie ingesteld op -15 tot -17 °C (stap 4.7.1 en stap 4.13), terwijl andere protocollen -10 °C 5,6. Zelfs met een gemeenschappelijke decafluorbutaankern kan de condensatietemperatuur variëren, afhankelijk van de samenstelling van de hulpstof, de totale lipidenconcentratie en de samenstelling van de lipideschil. Als u andere formuleringen gebruikt, kan optimalisatie nodig zijn om een goede druppelcondensatie te garanderen zonder dat de oplossing bevriest.
Omdat de druppels kleiner en stabieler zijn dan hun microbubbelvoorloper7, kunnen ze beter profiteren van passieve accumulatiemechanismen om te extravaseren in bepaalde weefsels van belang, zoals de verbeterde permeabiliteit en het retentie-effect van bepaalde tumortypen4,24. Met fluorescerende, optisch absorberende en akoestische detectiemethoden14is het mogelijk om een enkele formulering te gebruiken om de opname te kwantificeren. Bovendien kan dit platform worden gebruikt om te onderzoeken of de akoestische verdamping van druppels de geleverde agentfractie kan verbeteren boven passieve niveaus16. Om de biodistributie van het middel in weefsels en organen van belang na injectie te kwantificeren, moet een bekende hoeveelheid pyro-lipidedruppeltjes in het dier worden geïnjecteerd, kan echografie al dan niet worden toegepast afhankelijk van de controleset, moet het dier een vooraf gespecificeerd tijdstip worden opgeofferd en moeten de organen worden verwijderd en gewogen. De organen moeten worden gehomogeniseerd, gefilterd, verdund in oppervlakteactieve stof (detergent) om het weefsel te decellulariseren en gekwantificeerd met fluorescentie of UV-Vis-spectroscopie om geïnjecteerde dosispercentages per orgaanmassa te verkrijgen op basis van de Pyro-signalen. Voor stap 5.4.5 (figuur 5) en stap 5.5.5 (figuur 6) werd Triton X-100 oppervlakteactieve stof (detergent) gebruikt om de monsters te verstoren, omdat deze niet-fluorescerend is bij 410 nm en de absorptiegolflengten niet overlappen met die van Pyro.
Microbubbels werden niet gekenmerkt door UV-Vis absorptie. Omdat de laserbron van de UV-Vis-spectroscoop parallel loopt aan de detector, kunnen grote bellen licht van de detector verstrooien, waardoor ze optisch absorberender lijken14. In tegenstelling tot de UV-Vis spectrofotometer staat/moet de detector van de fluorescentiespectrofotometer loodrecht op de laserbron staan/moeten staan om te voorkomen dat de bron de detector verstoort. UV-Vis werd gebruikt om de absorptie van de intacte en verstoorde druppelmonsters te kwantificeren (stap 5.4, figuur 5). 300 tot 800 nm werd gekozen als de absorptiegolflengten omdat de twee belangrijkste absorptiebanden van pyro-lipide, de Soret-band (340 tot 500 nm) en de Q-band (640 tot 730 nm), binnen dit bereikvallen 14. Bij montage in een druppel (of andere supramoleculaire structuren) is de Q-band piek van Pyro-lipide rood verschoven van 671 nm naar 700 nm(figuur 5). Wanneer deze supramoleculaire structuur wordt verstoord door een oppervlakteactieve stof zoals Triton, verschuift de piek terug naar 671 nm14,15. Op basis van deze verschuiving is het mogelijk om te zien of de Pyro-lipiden zich in een geassembleerde toestand of in een verstoorde toestand bevinden. De verhouding van de twee pieken kan worden gebruikt om het verval van de assemblages in de loop van de tijd te schatten.
Voor de fluorescentiemetingen (stap 5.5, figuur 6)werd een excitatiegolflengte van 410 nm gekozen omdat deze overeenkomt met de soretbandpiek voor niet-gemonteerd pyrolipide14. Een emissiegolflengtebereik van 600 tot 800 nm werd geselecteerd omdat de pieken van de intacte assemblages in PBS en verstoorde Pyro-lipiden in Triton zich binnen dit bereik bevinden. De verschuiving en toename van fluorescentie (figuur 6) tussen de intacte (704 nm in PBS) en verstoorde (674 nm in Triton) monsters vond plaats als gevolg van structuur-geïnduceerde blussing. In de geassembleerde vorm werden de Pyro-lipidemoleculen dicht op elkaar gepakt, zodat gegenereerde fotonen werden geabsorbeerd door nabijgelegen Pyro-lipidemoleculen. Dit is duidelijk te zien in de intacte versus verstoorde blusefficiëntie. Het is dus noodzakelijk om monsters te verdunnen in oppervlakteactieve stof (wasmiddel) zoals 1% Triton X-100 om het blussen te verlichten en het signaal voor biodistributiekwantificering te maximaliseren14.
Voor de eenvoud werd dezelfde lineaire array ultrasone transducer gebruikt om zowel te verdampen als in beeld te brengen (stappen 6.5 en 6.7, figuur 7). Deze ultrasone transducer (Table of Materials) was in staat om de nodige piek negatieve drukken te bereiken die nodig zijn om druppels te verdampen8. Het vullen van een tank met gedeïoniseerd water uit een kraan genereert gassen die in het water worden opgelost (stap 6.1). Om interferentie van de opgeloste gassen in het water met verdamping en beeldvorming te minimaliseren, werd het water gedurende 24 uur in de tank rusten om de gassen in het water in evenwicht te brengen met de atmosfeer (stap 6.1). Als alternatief kan het gedeïoniseerde water worden ontgast met een voldoende grote, afsluitbare container die is aangesloten op een voldoende krachtig vacuüm. De echografiebeelden toonden aan dat de microbubbels met succes werden gecondenseerd omdat de druppels niet waarneembaar / niet-echogeen waren bij lage druk(figuur 7B). Het was alleen bij hogere uitgangsdrukken dat de druppels verdampten tot waarneembare, echogene microbubbels(Figuur 7D,7F, 7H). Hoewel het post-gecondenseerde druppelmonster micellen en liposomen / blaasjes bevat, zijn deze assemblages niet-echogeen en kunnen alleen druppels verdampen tot echogene microbubbels. Een PBS-controle werd door het fantoom gestroomd om basisbeelden vast te stellen(figuren 7A, 7C, 7E, 7G). Naarmate de druk in de PBS toenam, werd er geen contrast gegenereerd. Dit gaf aan dat de hoge drukken van de transducer alleen in een medium op waterbasis geen spontane cavitatie konden veroorzaken, en dus kon alle andere gegenereerde contrast worden toegeschreven aan het gebruikte ultrasone contrastmiddel. Als de uitgangsdruk te hoog is, kunnen gegenereerde microbubbels worden vernietigd. Door de druk stapsgewijs te verhogen en het gegenereerde contrast te observeren, kan de optimale druk worden gevonden8. De circulatiehalfwaardetijd van de druppels kan op een vergelijkbare manier worden bepaald door de druppels met bepaalde tijdsintervallen te verdampen en het contrast te observeren dat in de loop van de tijd wordt gegenereerd7.
Samenvattend werden multimodale faseveranderingsdruppels met variërend Pyro-lipidegehalte gecreëerd met de condensatiemethode. Sizing toonde aan dat er een trade-off was tussen Pyro-lipide lading en microbubbel/ druppel concentratie. Karakteriseringen toonden aan dat er verschillen waren in intacte en verstoorde vormen in zowel absorptie als fluorescentie. Echografie toonde aan dat druppels niet-echogeen waren bij 37 °C en verdampt waren tot echogene microbubbels bij voldoende druk. Karakteriseringen toonden ook het potentieel voor Pyro-lipidedruppels om begeleidende diagnostische middelen te vervangen voor druppelbiodistributie- of accumulatietests. Toekomstig werk zal in-oplossing verdampingsdrempels, in-oplossing stabiliteit en in vivo circulatieduur bij naakte muizen onderzoeken.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Dr. Brandon Helfield bedanken voor het helpen bouwen van de gaswisselaar en Dr. Nijntje Hok Yan Cheng voor technische discussies. De auteurs willen graag de volgende financieringsbronnen bedanken: Ontario Graduate Scholarship, Canadian Institutes of Health Research, Terry Fox Research Institute en Princess Margaret Cancer Foundation.
Materials
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-5000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880220 | Also known as "DSPE-PEG5K" |
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 855775 | Also known as "DSPC" |
| Aluminum Foil | Any brand | ||
| Aluminum Seals, Tear-Off | VWR | 16171-840 | Standard Aluminum, 13 mm outer diameter |
| Bath Sonicator | Any brand | Capable of sonicating and heating up to 70 °C, | |
| Bio-Stor Screw Cap Vials | National Scientific | BS20NABP | Plastic, 2 mL Skirted, with O-ring |
| Borosilicate glass clear serum vials | VWR | 16171-285 | 3 mL, 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter |
| Borosilicate Glass Sample Vial with Phenolic Screw Cap | VWR | 66011-020 | 1.85 mL, Short Form Style, 12 mm outer diameter, 35 mm height, 8-425 cap size |
| Borosilicate Glass Vial with Screw-On cap | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Chloroform | Any brand | ||
| Coulter Counter Elctrolyte Diluent | Any brand | Compatible with Coulter Counter | |
| Decafluorobutane (C4F10) | FluoroMed | 355-25-9 | |
| Deionized Water | Any brand | ||
| Dry Ice (Carbon Dioxide) | Any brand | ||
| Dynamic Light Scattering (DLS) Particle Analyzer | Any brand | Capable of temperature control | |
| E-Z Crimper, 13 mm | Wheaton | W225302 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| E-Z Decapper, 13 mm | Wheaton | W225352 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| Fluorescent Spectrophotometer | Any brand | Capable of 400 to 600 excitation and 300 to 800 nm emission detection, detector perpendicular to laser source | |
| Fluorescent Spectrophotometer Compatible Cuvette | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm, all four sides are optical windows | |
| Gas Exchanger | Made in-house | Refer to Supplementary Information – "Other Protocols and Data" for assembly instructions. | |
| Glass syringes | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| GLWR Custom Aperture Tube 10 um | Beckman Coulter | B42812 | 10 µm aperture, compatible with Beckman Coulter MultiSizer 4e |
| Glycerol | Any brand | ||
| Insulated Styrofaom containers with lids | Any brand | ||
| Isopropanol | Any brand | ||
| Lyophilization-Style Rubber Stoppers | VWR | 71000-060 | 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter, 2-leg, Chlorobutyl |
| Membrane Diaphram Vacuum Pump | Sartorius Stedim | 16694-1-60-06 | Adjustable pressure |
| Metal Tongs | Any brand | ||
| Methanol | Any brand | ||
| MS250 21 MHz Linear Array Ultrasound Transducer | VisualSonics | 21 MHz, Capable of B-mode and non-linear imaging. | |
| MultiSizer 4e | Beckman Coulter | Capable of sizing from 0.2µm to 6 µm | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 567-0010 | Polyethersulfone (PES) membrane, 0.1μm pore size, 1000 mL volume. As Isoton II is non-sterile, can use Filter units multiple times |
| Needles, Conventional | BD | 305176 | 20 gauge, 1.5 inch length |
| Nitrogen Gas | Any brand | Make sure there are regulator valves and tubes to direct the flow. Setup will be dependend on brand and source. | |
| Parafilm | Any brand | Called "wax film" in the protocol. | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Any brand | 1X, 7.4 pH | |
| Pipette | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Pipette Tips | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Plastic Syringes | Any brand | 1 mL, 3 mL, and 30 mL. With Luer Lock connections | |
| Polyethersulfone (PES) Membrane Filter | Any brand | 0.2 µm pore size | |
| Propylene Glycol | Any brand | ||
| Pyropheophorbide conjugated 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Made in-house | Also known as "Pyro-SPC". Refer to "Supplementary Information – Other Protocols and Data" for synthesis. | |
| Thermometer | Any brand | (-20 to 100 °C) | |
| Triton X-100 | Any brand | Also known as "2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol" | |
| Ultrapure Water | Any brand | Type 1 Purity | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer | Any brand | Capable of absorbance from 300 to 800 nm, at least 0.5 nm resolution | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer Compatible Cuvette, 1 cm Path Length | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm | |
| Vacuum Desiccator | Any brand | ||
| Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform | VisualSonics | Pre-clinical ultrasound imaging system | |
| Vialmix | Bristol-Myers-Squibb | Called "mechanical agitator" in the protocol. Agitates for 45 s. | |
| Vortex Mixer | Any brand |
References
- Gramiak, R., Shah, P. M. Echocardiography of the aortic root. Investigative Radiology. 3 (5), 356-366 (1968).
- Ferrara, K., Pollard, R., Borden, M. Ultrasound microbubble contrast agents: fundamentals and application to gene and drug delivery. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 415-447 (2007).
- Bing, K. F., Howles, G. P., Qi, Y., Palmeri, M. L., Nightingale, K. R. Blood-brain barrier (BBB) disruption using a diagnostic ultrasound scanner and Definity in mice. Ultrasound in Medicine and Biology. 35 (8), 1298-1308 (2009).
- Helfield, B. L., et al. Investigating the accumulation of submicron phase-change droplets in tumors. Ultrasound in Medicine and Biology. 49 (10), 2891 (2020).
- Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons. Biomaterials. 33 (11), 3262-3296 (2012).
- Sheeran, P. S., et al. Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2016).
- Yoo, K., et al. Impact of encapsulation on in vitro and in vivo performance of volatile nanoscale phase-shift perfluorocarbon droplets. Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (8), 1836-1852 (2018).
- Sheeran, P. S., et al. Image-guided ultrasound characterization of volatile sub-micron phase-shift droplets in the 20-40 MHz frequency range. Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (3), 795-807 (2016).
- Sheeran, P. S., et al. More than bubbles: creating phase-shift droplets from commercially available ultrasound contrast agents. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (2), 531-540 (2017).
- Chen, C. C., et al. Targeted drug delivery with focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening using acoustically-activated nanodroplets. Journal of Controlled Release. 172 (3), 795-804 (2013).
- Wu, S. Y., et al. Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets. Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002 (2018).
- Lee, J. Y., et al. Ultrasound-enhanced siRNA delivery using magnetic nanoparticle-loaded chitosan-deoxycholic acid nanodroplets. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), 1601246 (2017).
- Cao, Y., et al. Drug release from phase-changeable nanodroplets triggered by low-intensity focused ultrasound. Theranostics. 8 (5), 1327-1339 (2018).
- Huynh, E., Jin, C. S., Wilson, B. C., Zheng, G. Aggregate enhanced trimodal porphyrin shell microbubbles for ultrasound, photoacoustic, and fluorescence imaging. Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 796-801 (2014).
- Zheng, G., et al. Low-density lipoprotein reconstituted by pyropheophorbide cholesteryl oleate as target-specific photosensitizer. Bioconjugate Chemistry. 13 (3), 392-396 (2002).
- Dhaliwal, A., Zheng, G. Improving accessibility of EPR-insensitive tumor phenotypes using EPR-adaptive strategies: Designing a new perspective in nanomedicine delivery. Theranostics. 9 (26), 8091-8108 (2019).
- Goertz, D. E., de Jong, N., vander Steen, A. F. Attenuation and size distribution measurements of Definity and manipulated Definity populations. Ultrasound in Medicine and Biology. 33 (9), 1376 (2007).
- Pellow, C., Acconcia, C., Zheng, G., Goertz, D. E. Threshold-dependent nonlinear scattering from porphyrin nanobubbles for vascular and extravascular applications. Physics in Medicine and Biology. 63 (21), 215001 (2018).
- Kwan, J. J., Borden, M. A. Lipid monolayer collapse and microbubble stability. Advances in Colloid and Interface Science. 183, 82-99 (2012).
- Overchuk, M., et al. Subtherapeutic Photodynamic Treatment Facilitates Tumor Nanomedicine Delivery and Overcomes Desmoplasia. Nano Letters. 21 (1), 344-352 (2021).
- Feshitan, J., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. Microbubble size isolation by differential centrifugation. Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).
- Paproski, R. J., et al. Porphyrin nanodroplets: Sub-micrometer ultrasound and photoacoustic contrast imaging agents. Small. 12 (3), 371-380 (2016).
- Periyasamy, P. C., Leijten, J. C. H., Dijkstra, P. J., Karperien, M., Post, J. N. Nanomaterials for the local and targeted delivery of osteoarthritis drugs. Journal of Nanomaterials. 2021, 1-13 (2012).
- Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Research. 46 (12), 6387-6392 (1986).
