Síntese e Caracterização de Gotículas de Porfirina multimodal de mudança de fase
Summary
Neste protocolo, são traçados métodos para sintetizar e caracterizar gotículas de porfirina multimodal de mudança de fase.
Abstract
As gotículas de mudança de fase são uma classe de agentes de contraste de ultrassom que podem se converter em microbolhas ecogênicas in situ com a aplicação de energia acústica suficiente. As gotículas são menores e mais estáveis do que suas contrapartes de microbolhas. No entanto, os agentes tradicionais de contraste de ultrassom não são rastreáveis além das medidas de feedback acústico, o que dificulta a quantificação da bio-distribuição ou acúmulo de agentes de contraste. Os pesquisadores podem ter que contar com partículas de diagnóstico companheiro fluorescente ou opticamente absorventes para inferir a bio-distribuição. O objetivo deste protocolo é detalhar etapas para a criação de gotículas de porfirina multimodal de mudança de fase usando um método de condensação. Porfirinas são moléculas fluorescentes com faixas de absorção distintas que podem ser conjugadas em lipídios e incorporadas em gotículas para ampliar a versatilidade de gotículas, permitindo uma bio-distribuição mais robusta, mantendo propriedades acústicas. Sete formulações com diferentes conteúdos de porfirina-lipídica e lipídio base foram feitas para investigar distribuições de microbolhas e tamanho de gotícula. Caracterizações adequadas às estruturas contendo porphyrin também são descritas no protocolo para demonstrar sua versatilidade analítica em solução. O dimensionamento mostrou que os diâmetros médios pós-condensados foram 1,72 a 2,38 vezes menores do que as populações precursoras. A caracterização da absorvência mostrou que os conjuntos intactos tinham um pico de banda Q de 700 nm, enquanto as amostras interrompidas tinham um pico de absorção de 671 nm. A caracterização da fluorescência mostrou que os conjuntos de porfirina-lipídico foram extintos fluorescentemente (>97%), com recuperação de fluorescência alcançada após a interrupção. A vaporização acústica mostrou que as gotículas de porfirina não eram ecogênicas a pressões mais baixas e podiam ser convertidas em microbolhas ecogênicas com pressões suficientes. Essas caracterizações mostram o potencial de gotículas porfiliais para eliminar a necessidade de absorção ou estratégias de diagnóstico companheiro baseadas em fluorescência para quantificar a bio-distribuição de agentes de contraste de ultrassom para aplicações de entrega ou terapêutica in vivo ou ex vivo.
Introduction
A imagem de ultrassom é uma forma não invasiva, não ionizante de imagens médicas que utiliza ondas acústicas. Embora os scanners de ultrassom sejam mais portáteis e possam fornecer imagens em tempo real, a imagem de ultrassom pode sofrer de baixo contraste, tornando difícil para os sonografistas distinguir de forma confiável características patológicas ecogênicas. Para neutralizar essa limitação, microbolhas podem ser injetadas no hospedeiro para melhorar o contraste vascular. Microbolhas são agentes de contraste do tamanho de micron que são altamente ecogênicos às ondas acústicas e podem fornecer contraste aprimorado do vaso1,2. As conchas e núcleos de gás de microbolhas podem ser adaptados para diferentes aplicações, como imagem, trombiolise, permeabilização da membrana celular ou abertura vascular transitória2.
Uma desvantagem dos microbolhas é sua meia-vida de curta circulação. Por exemplo, microesferas lipídicas perflutrenas clinicamente disponíveis têm apenas uma meia-vida de 1,3 minutos3. Para longas sessões de imagem, são necessárias múltiplas injeções de microbolhas. Outra desvantagem dos microbolhas são seus grandes diâmetros. Enquanto as microesferas lipídicas perflutren têm cerca de 1 a 3 μm de diâmetro, pequenas o suficiente para circular em vasculatura, elas são muito grandes para extravasar e se acumulam passivamente em tecidos de interesse, como tumores4. Uma estratégia para superar essas limitações é condensar as microbolhas do núcleo de gás em gotículas menores e líquidas5,6. Embora as gotículas não sejam ecogênicas em seu estado líquido, elas podem ser vaporizadas em microbolhas após a exposição ao ultrassom com pressão negativa de pico suficientemente alta, recuperando sua capacidade de fornecer contraste. Isso permite que a gotícula aproveite a farmacocinética mais favorável de um pequeno núcleo líquido, mantendo a capacidade de proporcionar contraste quando inssonado e sem alterar a composição química4,7.
O decafluorobutano é um composto perfluorocarbono ideal para a mudança de fase entre estados gasosos e líquidos5,6,7. O decafluorobutano permite a condensação de microbolhas em gotículas apenas com redução de temperatura, enquanto perfluorocarbonos menos densos requerem pressurização adicional5. Este método suave minimiza a destruição de bolhas durante a condensação7,8,9. Como seus núcleos são líquidos, gotículas não são ecogênicas e invisíveis ao ultrassom. No entanto, com a aplicação de energia acústica ou térmica suficiente, os núcleos líquidos podem vaporizar de volta em um estado gasoso, gerando microbolhas ecogênicas8. Essa vaporização permite o controle de quando e onde gerar microbolhas.
Embora as gotículas sejam úteis para acumulação passiva, vaporização in situ ou melhoria da permeabilidade celular4,gotículas (e seus fragmentos) não podem ser imagens ou ex vivoquantificadas . Portanto, o agente de diagnóstico companheiro quantificável, como fluorescente4,10,11, partículas magnéticas12, agentes opticamente absorventes13, são utilizados como um análogo para medir a entrega de gotículas a tecidos de interesse. Por exemplo, Helfield et al. usaram uma co-injeção de nano-contas fluorescentes para quantificação de imagem histologia de órgãos do rato, pois gotículas não podiam ser detectadas fluorescentemente4. A desvantagem dos agentes diagnósticos companheiros é que o componente rastreável pode agir independentemente da gotícula, dependendo do seu perfil farmacocinético individual.
Felizmente, a casca de microbolhas e gotículas pode ser personalizada. Por exemplo, Huynh et al. demonstraram agentes de contraste de ultrassom com conchas porphyrin-lipídicas, criando microbolhas multimodais14. Porfirinas são uma classe de compostos orgânicos com uma estrutura macrocílica aromática14,15. Eles são opticamente absorventes, fluorescentes, e podem ser quelados a uma grande variedade de metais para radioterapia, imagens baseadas em radionuclídeos ou quantificação baseada em metal de rastreamento14. Um exemplo de porfirina é o piropheophorbida (Pyro). Ao conjugar Pyro em lipídios, incorporar piro-lipídios em microbolhas ou gotículas permitem que sejam imagens e rastreadas através de múltiplas modalidades: acústica, fluorescente e através da absorvância14. Este agente de contraste multimodal poderia ser usado para rastrear e quantificar o acúmulo. Isso poderia eliminar a necessidade de agentes de diagnóstico companheiros, uma vez que o componente quantificável é agora conjugado na concha, permitindo uma quantificação de entrega mais precisa16.
Aqui, um protocolo para a criação de gotículas de porfirina multimodal de mudança de fase é delineado. Como os agentes de contrastes de ultrassom podem ser usados como plataforma para o fornecimento de medicamentos a tecidos de interesse, como tumores2,4, estender sua detectabilidade além do ultrassom pode ser útil para quantificação da eficácia do parto. O objetivo dessas gotículas é fornecer agentes de contraste de ultrassom rastreáveis capazes de acumulação passiva in vivo, in situ vaporização e acústica, e com o potencial de quantificar a bio distribuição ou acúmulo de órgãos ex vivo sem a dependência de sensores secundários. Métodos de caracterização também são delineados para mostrar o potencial das gotículas de porfirina como sensores de bio-distribuição. Os efeitos do carregamento piro-lipídide na casca (0% a 50% pela razão molar) também são discutidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Depois de adicionar todos os componentes lipídicos juntos (etapas 1.2 e 1.4.5, Figura 1A), uma solução de clorofórmio e metanol (e água se lipídios ácido fosfádico como dSPA estão presentes) foi adicionado para garantir que os componentes piro-lipídicos e não-Piro lipídios fossem totalmente homogeneizados (Passo 1.5, Figura 1B). Para evitar a formação de vesículas lipídicas com composição lipídica heterogênea, os lipídios dissolvidos foram secos e revestidos no interior da parede do frasco como uma película fina(Figura 1C). O revestimento (Passo 1.6) também facilita a hidratação (Passo 2.1 a 2.4) à medida que aumenta a área superficial do filme seco. A secagem (Passo 1.6, Figura 1C) e o aspirador (Passo 1.8, Figura 1D) foram feitos para garantir que o clorofórmio e o metanol fossem totalmente evaporados, pois esses produtos químicos podem interromper a formação de microbolhas. Embora o protocolo possa ser reduzido para tornar os volumes de solução lipídica tão baixos quanto 1 mL, volumes maiores podem reduzir a variação do frasco para o frasco. Embora isso possa correr o risco de degradar o Pyro-SPC enquanto não estiver em uso, a condição de armazenamento da solução lipídica (Passo 2.9 a 2.10) foi destinada a reduzir esse risco. O passo de desgaseamento com o trocador de gás (Passo 2.9.2, Figura 1F e Figura 2) serve para eliminar o máximo de oxigênio possível para evitar a oxidação. Não é recomendado armazenar soluções lipídicas contendo porfirina-lipídios enquanto os gases atmosféricos ainda são dissolvidos na solução(Figura 1E).
Na etapa 2.10, a solução lipídica está em um frasco de soro com um headspace pressurizado, semelhante à forma como as microesferas lipídicas do agente de contraste de ultrassom clinicamente aprovadas são vendidas (semelhante à Figura 1F). O trabalho interno mostrou que microbolhas estáveis não poderiam ser geradas através de agitação mecânica com a presença de Piro-lipídios se a tampa fosse um material macio como a rolha de borracha. Assim, a solução lipídica foi transferida para um frasco de amostra com tampa fenólica não-borracha (Passos 4.1 a 4.4, Figura 3A e 3B). Quando o gás decafluorobutano foi fluído para o frasco de amostra (Passos 4.1 a 4.4), o decafluorobutano mais denso deve deslocar o ar atmosférico no espaço de cabeça do frasco amostral. Atualmente, não se sabe por que os piro-lipídios são incapazes de formar microbolhas com rolhas de borracha. Sem piro-lipídios, microbolhas estáveis podem ser feitas diretamente nos frascos de soro com rolhas de borracha4,7. Assim, recomenda-se utilizar o Trocador de Gás para degas e repressurizar o frasco de soro e, em seguida, agitar o próprio frasco de soro para formulações não-piro-lipídicas4,5,6,7 (ver “Outros Protocolos e Dados”). A vantagem de ser capaz de agitar mecanicamente em frasco de soro é que o headspace pode ser pressurizado e a seleção de tamanho pode ser feita invertendo o frasco de soro de cabeça para baixo8. Neste protocolo, a formulação piro-lipídica de 0% foi transferida para um frasco de amostra (Passos 4.1 a 4.4) para ser consistente com as formulações que continham piro-lipídios. Além disso, maiores comprimentos da cadeia lipídica de acilho resultam em gotículas mais estáveis devido a melhores interações van der Waals19. A composição da casca lipídica foi escolhida com base no que estava comercialmente disponível, comprimento da cadeia de 18 acimais para todos os tipos lipídicos. O DSPE-PEG5K foi incorporado em toda a formulação (Passo 1.1) como a presença das cadeias de polietileno glicol impede a coalescência das estruturas através de forças estéricas repulsivas19. Durante a hidratação lipídica, o banho de sonicator de banho foi definido para 70 °C (Passo 2.1) tão alto o suficiente para dispersar totalmente o filme lipídico de 18 acyl de comprimento da cadeia18. Para maiores comprimentos da cadeia de aciis, serão necessárias temperaturas mais altas.
Um carregamento mais alto de piro-lipídios aumentaria a concentração de componentes de absorção óptica e fluorescing, que podem ser desejados para certas aplicações que se beneficiam do carregamento maximizado de porfirina. No entanto, à medida que o teor piro-lipídide aumentou, a concentração de gotículas observáveis diminuiu e os diâmetros aumentaram(Figura 4 e Tabela 1). Isso ilustra uma troca entre fluorescência óptica e propriedades de absorção versus concentração de gotículas e diâmetro. Para pesquisadores que devem priorizar pequenos diâmetros para o acúmulo in vivo através de pequenos vasos com vazamento ou se uma alta concentração de gotículas precisa ser injetada, o aumento do carregamento piro-lipídico pode não valer o aumento do diômetro gotícula ou diminuição na concentração de gotículas. Se altas concentrações de gotículas e/ou pequenos diâmetros de gotículas forem primordiais, agentes de diagnóstico companheiro de tamanho semelhante devem ser considerados em vez de piro-lipídios. Embora 1% das gotículas piro-lipídicas não resultem em uma diminuição na concentração ou aumento de tamanho, 1% o carregamento piro-lipídide pode ser muito baixo para ser razoavelmente detectável a partir do fundo do tecido fluorescentemente. No entanto, a flexibilidade da porfirina moiety fornece múltiplas opções de funcionalização que darão meios alternativos de quantificação mais adequados para aplicações de baixa concentração. Por exemplo, piro-lipídios podem ser quelados com cobre-64 para tomografia de emissão de positon e contagem gama20, ou com paládio para quantificação de trace-metal usando espectrometria de massa, ou com manganês para ressonância magnética14.
Enquanto alguns experimentos podem exigir apenas um pequeno volume da solução de gotícula, 1 mL da solução lipídica é necessário para preencher o frasco de amostra de 1,85 mL. Goertz et al. demonstraram que mudanças no manuseio, pressão do headspace, relação líquido-gás e até mesmo a forma do frasco podem afetar as populações de microbolhas17. A temperatura do frasco durante a agitação e a seleção de tamanho também podem influenciar a distribuição de tamanho. Portanto, para os métodos otimizados pelo usuário final, é fundamental ser o mais consistente possível ao fazer gotículas. Gotículas não abertas podem ser congeladas (-20 °C) e descongeladas mais tarde para uso futuro, mas isso afetará as populações de tamanho.
O procedimento de agitação que ativa uma solução lipídica em microbolhas não produz uma população morfologicamente homogênea (Passo 4.6); em vez disso, a amostra é preenchida com microbolhas, vesículas multilamellar, lipossomos e micelas18,21,22. Enquanto os tamanhos de microbolhas abrangem a faixa de míces e nanômetros, as outras estruturas estão em grande parte abaixo de 800 nm 23. As técnicas de dimensionamento utilizadas não distinguem entre essas várias estruturas e, portanto, as amostras de microbolhas pós-agitadas (Etapa 4.6, Figura 3C) e as amostras de gotículas pós-condensadas (Passo 4.14, Figura 3F) devem ser assumidas como misturas. Os conjuntos insensíveis de ultrassom (vesículas multilamellar, lipossomos e micelas) são provavelmente conservados pós-condensação e não mudarão de tamanho, pois não têm núcleos mutáveis de fase. Uma vez que o Contador Coulter não pode distinguir entre esses diferentes conjuntos supramoleculares, a mudança no tamanho populacional após a condensação deve ser interpretada com a suposição de que alguma proporção das estruturas nanoescala são inconversíveis e contribuem para a população observada nessa região de tamanho. Além disso, essas estruturas contribuem para as assinaturas espectroscópicas e fluorescentes dessas amostras14. As assinaturas de fluorescência e absorvência de micelas, liposomos/vesículas e gotículas são todas semelhantes, incluindo seu grau de fluorescência saciando14. Assim, é importante considerar que há uma mistura de montagens nas Figuras 3C a 3F, Figura 4, a amostra diluída do PBS na Figura 5e a amostra diluída do PBS na Figura 6.
Após a seleção de tamanho e antes da condensação (Etapa 4.9), é possível eliminar os conjuntos não-bolhas centrifugando a amostra de microbolhas para separar as bolhas flutuantes dos conjuntos não flutuantes, conforme descrito por Feshitan et al.21 O grau de separação pode ser controlado ajustando a força e duração do spin. No entanto, experimentos de condensação de microbolhas de amostras isoladas de tamanho revelaram que o uso das populações precursoras de microbolhas que são selecionadas usando procedimentos de isolamento de tamanho rendeu gotículas maiores (ver “Outros Protocolos e Dados” Passo S5 para dimensionamento de bolhas pós-giradas e gotículas). Uma vez que uma aplicação pretendida de gotículas produzidas com este protocolo é uma plataforma para extravasão passiva e acúmulo devido ao seu pequeno tamanho em comparação com microbolhas4,8, populações de gotículas que são tão pequenas quanto possível foram desejadas. Assim, este protocolo utilizou amostras de microbolhas pós-agitadas que não foram isoladas via centrifugação, mesmo que isso significasse micelas insensíveis de ultrassom, lipossomos e vesículas estavam presentes na solução final. Isso implica que os procedimentos de quantificação para a biosco distribuição derivarão sinal para todas as estruturas injetadas e não se limitarão apenas às gotículas. No entanto, uma vez que essas estruturas de tamanho semelhante provavelmente se acumulam através de um mecanismo passivo que é ditado principalmente pelo tamanho, não se suspeita que isso deve mudar as principais inferências que podem ser feitas se essa plataforma for utilizada in vivo,embora todos esses aspectos devem ser considerados individualmente dependendo do contexto em que a plataforma possa ser utilizada. Testes utilizando braços experimentais com e sem ultrassom podem ser realizados para garantir que sejam as gotículas sensíveis ao ultrassom que são responsáveis por quaisquer alterações na biosco distribuição, pois apenas os conjuntos do núcleo de perfluorocarbono na solução responderão ao ultrassom.
Após agitação, o frasco ficou descansado por 15 minutos e observou-se uma partição no frasco (Figura 3C versus 3D). A seleção de tamanho via flutuação é um método simples de eliminar as estruturas/bolhas maiores de uma solução de microbolhas ativada8,17. Neste caso, partículas com diâmetros superiores a 5 μm foram removidas principalmente após a seleção de tamanho(Figura 4). A extensão da seleção de tamanho pode ser ajustada controlando a duração da seleção de tamanho17. Sheeran et al. mostraram que a não seleção de tamanho pode resultar em microbolhas geradas que ocluem a vasculatura8.
Perfluorocarbonos têm a vantagem de serem biologicamente inertes7. Enquanto o ponto de ebulição da decafluorobutana é de -1,7 °C, acima da temperatura corporal, as gotículas não vaporizam imediatamente quando expostas a 37 °C (Figura 7B). Como as gotículas são metaeveis a 37 °C, é necessária energia acústica adicional para vaporizar as gotículas para microbolhas7,9. Poprosky et al. demonstraram gotículas de porfirina condensadas via pressurização22. Este é um método viável e até essencial ao usar perfluorocarbonos menos densos, mas altas pressões podem destruir algumas bolhas no processo. Octafluoropropano (C3F8) tem um ponto de ebulição de -36,7 °C, de modo que tanto o resfriamento quanto a pressurização são necessários para a condensação de gotículas. No entanto, o perfluorocarbono mais leve leva a gotículas menos estáveis. Dodecafluoropentane (C5F12) pode levar a gotículas mais estáveis com um ponto de ebulição de 28 °C. No entanto, é um líquido à temperatura ambiente e precisará de energias acústicas mais fortes para vaporizar. Assim, a escolha do gás contendo do agente de contraste do ultrassom deve considerar as condições de sua aplicação biológica pretendida, além dos parâmetros de sua fabricação. Neste protocolo, o banho de isopropanol para condensação foi definido de -15 a -17 °C (Etapa 4.7.1 e Passo 4.13), enquanto outros protocolos utilizados -10 °C 5,6. Mesmo com um núcleo de decafluorobutano comum, a temperatura de condensação pode variar dependendo da composição excipiente, concentração lipídica total e composição da casca lipídica. Se usar outras formulações, a otimização pode ser necessária para garantir a condensação adequada da gotícula sem fazer com que a solução congele.
Como as gotículas são menores e mais estáveis do que seu precursor de microbolhas7,elas podem aproveitar melhor os mecanismos de acumulação passiva para extravasar em certos tecidos de interesse, como o efeito de permeabilidade e retenção aprimorado de certos tipos de tumor4,24. Com métodos fluorescentes, opticamente absorventes e acústicos de detecção14,é possível usar uma única formulação para quantificar a absorção. Além disso, esta plataforma pode ser usada para investigar se a vaporização acústica de gotículas pode melhorar a fração de agente entregue além dosníveis passivos 16. Para quantificar a bio-distribuição do agente em tecidos e órgãos de interesse após a injeção, uma quantidade conhecida de gotículas piro-lipídicas deve ser injetada no animal, o ultrassom pode ou não ser aplicado dependendo do conjunto de controle, o animal deve ser sacrificado um ponto de tempo pré-especificado, e os órgãos devem ser removidos e pesados. Os órgãos devem ser homogeneizados, filtrados, diluídos em surfactante (detergente) para descelularizar o tecido, e quantificados com fluorescência ou espectroscopia UV-Vis para obter percentuais de dose injetada por massa de órgão com base nos sinais de Pyro. Para o passo 5.4.5 (Figura 5) e Passo 5.5.5(Figura 6),Triton X-100 surfactante (detergente) foi usado para interromper as amostras, pois não é fluorescente a 410 nm e seus comprimentos de onda de absorvância não se sobrepõem aos de Pyro.
Os microbolhas não foram caracterizados com absorvência UV-Vis. Como a fonte laser do espectroscópio UV-Vis é paralela ao detector, qualquer grande bolha poderia dispersar a luz para longe do detector, fazendo com que pareçam mais absorventes opticamente14. Ao contrário do espectrofotômetro UV-Vis, o detector de espectrofotômetro de fluorescência é/deve ser perpendicular à fonte laser para evitar que a fonte interfira no detector. UV-Vis foi utilizado para quantificar a absorvância das amostras de gotículas intactas e interrompidas (Passo 5.4, Figura 5). 300 a 800 nm foi escolhido como os comprimentos de onda de absorção como as duas principais bandas de absorção de piro-lipídio, a banda Soret (340 a 500 nm) e a banda Q (640 a 730 nm), caindo dentro desta faixa14. Quando montado em uma gotícula (ou outras estruturas supramoleculares), o pico da banda Q de Piro-lipída é recotado de 671 nm para 700 nm(Figura 5). Quando esta estrutura supramolecular é interrompida por um surfactante como Tritão, o pico muda de volta para 671 nm14,15. Com base nesta mudança, é possível dizer se os Piro-lipídios estão em um estado montado ou em um estado interrompido. A proporção dos dois picos pode ser usada para estimar a decadência das assembleias ao longo do tempo.
Para as medidas de fluorescência (Passo 5.5, Figura 6), foi escolhido um comprimento de onda de excitação de 410 nm, pois corresponde ao pico da banda Soret para piro-lipídio não remontado14. Um comprimento de onda de emissão de 600 a 800 nm foi selecionado à medida que os picos dos conjuntos intactos na PBS e piro-lipídios interrompidos em Tritão estão contidos dentro desta faixa. A mudança e o aumento da fluorescência(Figura 6) entre as amostras intactas (704 nm em PBS) e interrompidas (674 nm em Tritão) ocorreram devido à extinção induzida pela estrutura. Na forma montada, as moléculas piro-lipídicas foram embaladas de perto para que os fótons gerados fossem absorvidos por moléculas piro-lipídicas próximas. Isso é evidente na eficiência de sacieçação intacta versus interrompida. Assim, é necessário diluir amostras em surfactante (detergente) como 1% Triton X-100 para aliviar a sacieciação e maximizar o sinal para quantificação de bio-distribuição14.
Para simplificar, o mesmo transdutor de ultrassom de matriz linear foi usado tanto para vaporizar quanto para imagem (Etapas 6.5 e 6.7, Figura 7). Este transdutor de ultrassom (Tabela de Materiais) foi capaz de atingir o pico de pressões negativas necessárias para vaporizar gotículas8. Encher um tanque com água deionizada de uma torneira gera gases que se dissolvem na água (Passo 6.1). Para minimizar a interferência dos gases dissolvidos na água com vaporização e imagem, a água ficou descansada por 24 h no tanque para permitir que os gases na água se equilibrem com a atmosfera (Passo 6.1). Alternativamente, a água deionizada pode ser desgaseada com um recipiente vedado suficientemente dimensionado conectado a um vácuo suficientemente poderoso. As imagens de ultrassom demonstraram que os microbolhas foram condensados com sucesso, pois as gotículas eram inobserváveis/não ecogênicas a baixas pressões(Figura 7B). Foi apenas em pressões de saída mais altas que as gotículas vaporizaram em microbolhas observáveis e ecogênicas(Figura 7D, 7F, 7H). Embora a amostra de gotícula pós-condensada contenha micelas e lipossóculos/vesículas, esses conjuntos são não ecogênicos e apenas gotículas podem vaporizar em microbolhas ecogênicas. Um controle PBS foi fluído através do fantasma para estabelecer imagens de linha de base (Figuras 7A, 7C, 7E, 7G). À medida que a pressão aumentava na PBS, não foi gerado contraste. Isso indicou que as altas pressões do transdutor não poderiam produzir cavitação espontânea apenas em um meio à base de água, e, portanto, todos os outros contrastes gerados poderiam ser atribuídos ao agente de contraste de ultrassom empregado. Se a pressão de saída for muito alta, microcompletos gerados podem ser destruídos. Aumentando gradualmente a pressão e observando o contraste gerado, a pressão ideal pode ser encontrada8. A meia-vida de circulação das gotículas pode ser determinada de forma semelhante, vaporizando as gotículas são certos intervalos de tempo e observando o contraste gerado ao longo do tempo7.
Em resumo, gotículas multimodal de mudança de fase com conteúdo piro-lipídicos variado foram criadas com o método de condensação. O dimensionamento mostrou que houve uma troca entre o carregamento piro-lipídeca e a concentração de microbolhas/gotículas. Caracterizações mostraram que havia diferenças nas formas intactas e interrompidas tanto na absorção quanto na fluorescência. As imagens de ultrassom mostraram que as gotículas não eram ecogênicas a 37 °C e eram vaporizáveis em microbolhas ecogênicas a pressões suficientes. Caracterizações também mostraram o potencial de gotículas piro-lipídicas para substituir agentes de diagnóstico companheiro para testes de bio-distribuição ou acumulação de gotículas. O trabalho futuro investigará limiares de vaporização na solução, estabilidade na solução e durações de circulação in vivo em camundongos nus.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Brandon Helfield por ajudar a construir o trocador de gás e o Dr. Miffy Hok Yan Cheng por discussões técnicas. Os autores gostariam de agradecer às seguintes fontes de financiamento: Ontário Graduate Scholarship, Canadian Institutes of Health Research, Terry Fox Research Institute e Princess Margaret Cancer Foundation.
Materials
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-5000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880220 | Also known as "DSPE-PEG5K" |
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 855775 | Also known as "DSPC" |
| Aluminum Foil | Any brand | ||
| Aluminum Seals, Tear-Off | VWR | 16171-840 | Standard Aluminum, 13 mm outer diameter |
| Bath Sonicator | Any brand | Capable of sonicating and heating up to 70 °C, | |
| Bio-Stor Screw Cap Vials | National Scientific | BS20NABP | Plastic, 2 mL Skirted, with O-ring |
| Borosilicate glass clear serum vials | VWR | 16171-285 | 3 mL, 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter |
| Borosilicate Glass Sample Vial with Phenolic Screw Cap | VWR | 66011-020 | 1.85 mL, Short Form Style, 12 mm outer diameter, 35 mm height, 8-425 cap size |
| Borosilicate Glass Vial with Screw-On cap | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Chloroform | Any brand | ||
| Coulter Counter Elctrolyte Diluent | Any brand | Compatible with Coulter Counter | |
| Decafluorobutane (C4F10) | FluoroMed | 355-25-9 | |
| Deionized Water | Any brand | ||
| Dry Ice (Carbon Dioxide) | Any brand | ||
| Dynamic Light Scattering (DLS) Particle Analyzer | Any brand | Capable of temperature control | |
| E-Z Crimper, 13 mm | Wheaton | W225302 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| E-Z Decapper, 13 mm | Wheaton | W225352 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| Fluorescent Spectrophotometer | Any brand | Capable of 400 to 600 excitation and 300 to 800 nm emission detection, detector perpendicular to laser source | |
| Fluorescent Spectrophotometer Compatible Cuvette | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm, all four sides are optical windows | |
| Gas Exchanger | Made in-house | Refer to Supplementary Information – "Other Protocols and Data" for assembly instructions. | |
| Glass syringes | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| GLWR Custom Aperture Tube 10 um | Beckman Coulter | B42812 | 10 µm aperture, compatible with Beckman Coulter MultiSizer 4e |
| Glycerol | Any brand | ||
| Insulated Styrofaom containers with lids | Any brand | ||
| Isopropanol | Any brand | ||
| Lyophilization-Style Rubber Stoppers | VWR | 71000-060 | 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter, 2-leg, Chlorobutyl |
| Membrane Diaphram Vacuum Pump | Sartorius Stedim | 16694-1-60-06 | Adjustable pressure |
| Metal Tongs | Any brand | ||
| Methanol | Any brand | ||
| MS250 21 MHz Linear Array Ultrasound Transducer | VisualSonics | 21 MHz, Capable of B-mode and non-linear imaging. | |
| MultiSizer 4e | Beckman Coulter | Capable of sizing from 0.2µm to 6 µm | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 567-0010 | Polyethersulfone (PES) membrane, 0.1μm pore size, 1000 mL volume. As Isoton II is non-sterile, can use Filter units multiple times |
| Needles, Conventional | BD | 305176 | 20 gauge, 1.5 inch length |
| Nitrogen Gas | Any brand | Make sure there are regulator valves and tubes to direct the flow. Setup will be dependend on brand and source. | |
| Parafilm | Any brand | Called "wax film" in the protocol. | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Any brand | 1X, 7.4 pH | |
| Pipette | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Pipette Tips | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Plastic Syringes | Any brand | 1 mL, 3 mL, and 30 mL. With Luer Lock connections | |
| Polyethersulfone (PES) Membrane Filter | Any brand | 0.2 µm pore size | |
| Propylene Glycol | Any brand | ||
| Pyropheophorbide conjugated 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Made in-house | Also known as "Pyro-SPC". Refer to "Supplementary Information – Other Protocols and Data" for synthesis. | |
| Thermometer | Any brand | (-20 to 100 °C) | |
| Triton X-100 | Any brand | Also known as "2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol" | |
| Ultrapure Water | Any brand | Type 1 Purity | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer | Any brand | Capable of absorbance from 300 to 800 nm, at least 0.5 nm resolution | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer Compatible Cuvette, 1 cm Path Length | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm | |
| Vacuum Desiccator | Any brand | ||
| Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform | VisualSonics | Pre-clinical ultrasound imaging system | |
| Vialmix | Bristol-Myers-Squibb | Called "mechanical agitator" in the protocol. Agitates for 45 s. | |
| Vortex Mixer | Any brand |
References
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