Síntesis y caracterización de gotas de porfirina de cambio de fase multimodal
Summary
En este protocolo, se describen métodos para sintetizar y caracterizar gotas de porfirina multimodales de cambio de fase.
Abstract
Las gotas de cambio de fase son una clase de agentes de contraste de ultrasonido que pueden convertirse en microburbujas ecogénicas in situ con la aplicación de suficiente energía acústica. Las gotas son más pequeñas y más estables que sus contrapartes de microburbujas. Sin embargo, los agentes de contraste de ultrasonido tradicionales no son rastreables más allá de las mediciones de retroalimentación acústica, lo que dificulta la cuantificación de la biodis distribución o acumulación ex vivo del agente de contraste. Es posible que los investigadores tengan que confiar en partículas de diagnóstico acompañantes fluorescentes u ópticamente absorbentes para inferir la biodis distribución. El propósito de este protocolo es detallar los pasos para crear gotas de porfirina de cambio de fase multimodal utilizando un método de condensación. Las porfirinas son moléculas fluorescentes con distintas bandas de absorbancia que pueden conjugarse en lípidos e incorporarse a gotas para extender la versatilidad de las gotas, lo que permite una biodisponsión más robusta al tiempo que conserva las propiedades acústicas. Se hicieron siete formulaciones con diferentes contenidos de lípidos de porfirina y lípidos base para investigar las distribuciones de tamaño de microburbujas y gotas. Las caracterizaciones adecuadas para las estructuras que contienen porfirina también se describen en el protocolo para demostrar su versatilidad analítica en solución. El tamaño mostró que los diámetros medio posteriores a la condensación fueron de 1,72 a 2,38 veces más pequeños que las poblaciones precursoras. La caracterización de la absorbancia mostró que los ensamblajes intactos tenían un pico de banda Q de 700 nm, mientras que las muestras interrumpidas tenían un pico de absorbancia a 671 nm. La caracterización de la fluorescencia mostró que los ensamblajes intactos de porfirina-lípido del 30% se apagaron fluorescentemente (>97%), con una recuperación de fluorescencia lograda tras la interrupción. La vaporización acústica mostró que las gotas de porfirina no eran ecogénicas a presiones más bajas y podían convertirse en microburbujas ecogénicas con suficientes presiones. Estas caracterizaciones muestran el potencial de las gotas de porfirina para eliminar la necesidad de absorbancia o estrategias de diagnóstico complementarias basadas en la fluorescencia para cuantificar la biodis distribución del agente de contraste de ultrasonido para la administración o aplicaciones terapéuticas in vivo o ex vivo.
Introduction
Las imágenes de ultrasonido son una forma no invasiva y no ionizante de imágenes médicas que utiliza ondas acústicas. Mientras que los escáneres de ultrasonido son más portátiles y pueden proporcionar imágenes en tiempo real, las imágenes de ultrasonido pueden sufrir de bajo contraste, lo que dificulta que los ecografistas distingan de manera confiable características patológicas ecogénicas similares. Para contrarrestar esta limitación, se pueden inyectar microburbujas en el huésped para mejorar el contraste vascular. Las microburbujas son agentes de contraste llenos de gas del tamaño de micras que son altamente ecogénicos a las ondas acústicas y pueden proporcionar un contraste de recipiente mejorado1,2. Las carcasas y los núcleos de gas de las microburbujas se pueden adaptar para diferentes aplicaciones, como imágenes, trombólisis, permeabilización de la membrana celular o apertura vascular transitoria2.
Un inconveniente de las microburbujas es su corta circulación de vida media. Por ejemplo, las microesferas lipídicas de perflutrena clínicamente disponibles solo tienen una vida media de 1,3 minutos3. Para sesiones de imágenes largas, se necesitan múltiples inyecciones de microburbujas. Otro inconveniente de las microburbujas son sus grandes diámetros. Mientras que las microesferas lipídicas de perflutrena tienen alrededor de 1 a 3 μm de diámetro, lo suficientemente pequeñas como para circular en la vasculatura, son demasiado grandes para extravasar y acumularse pasivamente en tejidos de interés, como los tumores4. Una estrategia para superar estas limitaciones es condensar las microburbujas de núcleo de gas en gotas de núcleo líquido más pequeñas5,6. Si bien las gotas no son ecogénicas en su estado líquido, pueden vaporizarse en microburbujas al exponerse al ultrasonido con una presión negativa máxima suficientemente alta, recuperando su capacidad de proporcionar contraste. Esto permite que la gota aproveche la farmacocinética más favorable de un pequeño núcleo líquido, al tiempo que conserva la capacidad de proporcionar contraste cuando está insonado y sin cambiar la composición química4,7.
El decafluorobutano es un compuesto de perfluorocarbono ideal para el cambio de fase entre los estados gaseoso y líquido5,6,7. El decafluorobutano permite la condensación de microburbujas en gotas solo con reducción de temperatura, mientras que los perfluorocarbonos menos densos requieren presurización adicional5. Este método suave minimiza la destrucción de burbujas durante la condensación7,8,9. Como sus núcleos son líquidos, las gotas no son ecogénicas e invisibles para el ultrasonido. Sin embargo, con la aplicación de suficiente energía acústica o térmica, los núcleos líquidos pueden vaporizarse de nuevo en un estado gaseoso, generando microburbujas ecogénicas8. Esta vaporización permite controlar cuándo y dónde generar microburbujas.
Si bien las gotas son útiles para la acumulación pasiva, la vaporización in situ o la mejora de la permeabilidad celular4,las gotas (y sus fragmentos) no se pueden obtener imágenes ni cuantificar ex vivo. Por lo tanto, el agente de diagnóstico complementario cuantificable, como fluorescente4,10,11,partículas magnéticas12,agentes ópticamente absorbentes13,se utilizan como un análogo para medir la entrega de gotas a los tejidos de interés. Por ejemplo, Helfield et al. utilizaron una coinyección de nanoperlas fluorescentes para la cuantificación de imágenes histológicas de órganos de ratón ya que no se pudieron detectar gotas fluorescentemente4. La desventaja de los agentes de diagnóstico acompañantes es que el componente rastreable puede actuar independientemente de la gota dependiendo de su perfil farmacocinético individual.
Afortunadamente, la cáscara de microburbujas y gotas se puede personalizar. Por ejemplo, Huynh et al. demostraron agentes de contraste ecográfico con conchas de porfirina-lípido, creando microburbujas multimodales14. Las porfirinas son una clase de compuestos orgánicos con una estructura macrocítica aromática14,15. Son ópticamente absorbentes, fluorescentes y pueden quelatarse a una amplia variedad de metales para radioterapia, imágenes basadas en radionúclidos o cuantificación basada en metales traza14. Un ejemplo de porfirina es la pirofeofórbida (Pyro). Al conjugar Pyro sobre lípidos, la incorporación de pirolípidos en microburbujas o gotas permite que sean fotografiados y rastreados a través de múltiples modalidades: acústicamente, fluorescentemente y a través de absorbancia14. Este agente de contraste multimodal podría usarse para rastrear y cuantificar la acumulación. Esto podría eliminar la necesidad de agentes de diagnóstico complementarios, ya que el componente cuantificable ahora se conjuga en la carcasa, lo que permite una cuantificación de la entrega más precisa16.
Aquí, se describe un protocolo para crear gotas de porfirina de cambio de fase multimodal. Como los agentes de contrastes de ultrasonido se pueden utilizar como una plataforma para la administración de fármacos a tejidos de interés, como los tumores2,4,extender su detectabilidad más allá del ultrasonido podría resultar útil para la cuantificación de la eficacia de la administración. El propósito de estas gotas es proporcionar agentes de contraste de ultrasonido rastreables capaces de acumulación pasiva in vivo,vaporización in situ y acústica, y con el potencial de cuantificar la biodisposición o acumulación de órganos ex vivo sin depender de sensores secundarios. Los métodos de caracterización también se describen para mostrar el potencial de las gotas de porfirina como sensores de biodisponsión. También se discuten los efectos de la carga de pirolipídicos en la cáscara (0% a 50% por proporción molar).
Protocol
Representative Results
Discussion
Después de agregar todos los componentes lipídicos juntos (Pasos 1.2 y 1.4.5, Figura 1A),se agregó una solución de cloroformo y metanol (y agua si hay lípidos ácidos fosfatídicos como DSPA) para garantizar que los componentes pirolipídicos y no pirólipos se homogeneizaron completamente (Paso 1.5, Figura 1B). Para prevenir la formación de vesículas lipídicas con composición lipídica heterogénea, los lípidos disueltos se secaron y se recubrieron en el interior de la pared del vial como una película delgada(Figura 1C). El recubrimiento (Paso 1.6) también facilita la hidratación (Paso 2.1 a 2.4) ya que aumenta el área de superficie de la película seca. El secado (Paso 1.6, Figura 1C)y la aspiración (Paso 1.8, Figura 1D)se realizaron para garantizar que el cloroformo y el metanol se evaporaron por completo, ya que estos productos químicos pueden interrumpir la formación de microburbujas. Si bien el protocolo se puede reducir para reducir los volúmenes de solución lipídica tan bajos como 1 ml, los volúmenes más grandes pueden reducir la variación de vial a vial. Si bien esto puede correr el riesgo de degradar el Pyro-SPC mientras no está en uso, la condición de almacenamiento de la solución lipídica (Paso 2.9 a 2.10) estaba destinada a reducir ese riesgo. El paso de desgasificación con el intercambiador de gases (Paso 2.9.2, Figura 1F y Figura 2)sirve para eliminar la mayor cantidad de oxígeno posible para evitar la oxidación. No se recomienda almacenar soluciones lipídicas que contengan lípidos de porfirina mientras los gases atmosféricos todavía están disueltos en la solución (Figura 1E).
En el paso 2.10, la solución lipídica se encuentra en un vial sérico con un espacio de cabeza presurizado, similar a cómo se venden las microesferas lipídicas perflutrena del agente de contraste de ultrasonido clínicamente aprobadas (similar a la Figura 1F). El trabajo interno ha demostrado que las microburbujas estables no se pueden generar a través de la agitación mecánica con la presencia de pirolipídicos si la tapa fuera un material blando como el tapón de goma. Por lo tanto, la solución lipídica se transfirió a un vial de muestra con una tapa fenólica sin goma (Pasos 4.1 a 4.4, Figura 3A y 3B). Cuando el gas decafluorobutano fluyó hacia el vial de muestra (pasos 4.1 a 4.4), el decafluorobutano más denso debe desplazar el aire atmosférico en el espacio de cabeza del vial de muestra. Actualmente, se desconoce por qué los pirolipídicos no pueden formar microburbujas con tapones de goma. Sin pirolipídicos, se pueden hacer microburbujas estables directamente en los viales de suero con tapones de goma4,7. Por lo tanto, se recomienda utilizar el intercambiador de gases para desgasificación y volver a presurizar el vial de suero y luego agitar el vial de suero para formulaciones no pirolipídicas4,5,6,7 (ver “Otros protocolos y datos”). La ventaja de poder agitar mecánicamente en el vial de suero es que el espacio de cabeza se puede presurizar y la selección del tamaño se puede hacer invirtiendo el vial de suero al revés8. En este protocolo, la formulación de pirolipídicos al 0% se transfirió a un vial de muestra (pasos 4.1 a 4.4) para ser consistente con las formulaciones que contenían pirolipídicos. Además, las longitudes más largas de la cadena lipídica de acilo dan como resultado gotas más estables debido a mejores interacciones de van der Waals19. La composición de la cubierta lipídica se eligió en función de lo que estaba disponible comercialmente, la longitud de la cadena de 18 acil para todos los tipos de lípidos. DSPE-PEG5K se incorporó en toda la formulación (Paso 1.1) ya que la presencia de las cadenas de polietilenglicol impide la coalescencia de las estructuras a través de fuerzas estéricas repulsivas19. Durante la hidratación lipídica, el baño sonicador de baño se estableció a 70 °C (Paso 2.1) lo suficientemente alto como para dispersar completamente la película lipídica de longitud de cadena de 18 acil18. Para longitudes de cadena de acilo más largas, se requerirán temperaturas más altas.
Una mayor carga de pirolipídicos aumentaría la concentración de componentes ópticamente absorbentes y fluorescentes, lo que puede ser deseado para ciertas aplicaciones que se benefician de la carga maximizada de porfirina. Sin embargo, a medida que aumentaba el contenido de pirolipídicos, la concentración de gotas observable disminuía y los diámetros aumentaba(Figura 4 y Tabla 1). Esto ilustra una compensación entre la fluorescencia óptica y las propiedades de absorbancia frente a la concentración y el diámetro de las gotas. Para los investigadores que deben priorizar los diámetros pequeños para la acumulación in vivo a través de pequeños vasos con fugas o si se necesita inyectar una alta concentración de gotas, el aumento de la carga de pirolipídicos puede no valer la pena el aumento en el dímetro de gotas o la disminución de la concentración de gotas. Si las altas concentraciones de gotas y / o los diámetros de gotas pequeñas son primordiales, se deben considerar agentes de diagnóstico complementarios de tamaño similar en lugar de pirolipídicos. Mientras que el 1% de gotitas de pirolipídicos no resultó en una disminución en la concentración o aumento en el tamaño, el 1% de la carga de pirolipídicos puede ser demasiado baja para ser razonablemente detectable desde el fondo del tejido fluorescentemente. Sin embargo, la flexibilidad de la fracción de porfirina proporciona múltiples opciones para la funcionalización que impartirán medios alternativos de cuantificación más adecuados para aplicaciones de baja concentración. Por ejemplo, los pirolipídicos pueden ser quelados con cobre-64 para imágenes de tomografía por emisión de positon y conteo gamma20,o con paladio para cuantificación de metales traza mediante espectrometría de masas, o con manganeso para imágenes por resonancia magnética14.
Si bien algunos experimentos solo requieren un pequeño volumen de la solución de gotas, se necesita 1 ml de la solución lipídica para llenar el vial de muestra de 1,85 ml. Goertz et al. demostraron que los cambios en el manejo, la presión del espacio de cabeza, la relación líquido-gas e incluso la forma del vial pueden afectar a las poblaciones de microburbujeos17. La temperatura del vial durante la agitación y la selección del tamaño también pueden influir en la distribución del tamaño. Por lo tanto, para los métodos optimizados por el usuario final, es fundamental ser lo más consistente posible al hacer gotas. Las gotas sin abrir pueden congelarse (-20 ° C) y descongelarse más tarde para su uso futuro, pero esto afectará a las poblaciones de tamaño.
El procedimiento de agitación que activa una solución lipídica en microburbujas no produce una población morfológicamente homogénea (Paso 4.6); más bien, la muestra está llena de microburbujas, vesículas multilamelares, liposomas y micelas18,21,22. Mientras que los tamaños de microburbujeos abarcan el rango de micras y nanómetros, las otras estructuras están en gran medida por debajo de 800 nm 23. Las técnicas de dimensionamiento utilizadas no distinguen entre estas diversas estructuras y, por lo tanto, las muestras de microburbujas post-agitadas (Paso 4.6, Figura 3C) y las muestras de gotas post-condensadas (Paso 4.14, Figura 3F) deben asumirse como mezclas. Los ensamblajes insensibles al ultrasonido (vesículas multilameláres, liposomas y micelas) probablemente se conservan después de la condensación y no cambiarán de tamaño, ya que no tienen núcleos cambiables de fase. Dado que el Contador de Coulter no puede distinguir entre estos diferentes ensamblajes supramoleculares, el cambio en el tamaño de la población después de la condensación debe interpretarse con la suposición de que una cierta proporción de las estructuras a nanoescala son inconvertibles y contribuyen a la población observada en esa región de tamaño. Adicionalmente, estas estructuras contribuyen a las firmas espectroscópicas y fluorescentes de estas muestras14. Las firmas de fluorescencia y absorbancia de micelas, liposomas/vesículas y gotitas son todas similares, incluyendo su grado de enfriamiento de fluorescencia14. Por lo tanto, es importante considerar que hay una mezcla de ensamblajes en las Figuras 3C a 3F, la Figura 4,la muestra diluida de PBS en la Figura 5y la muestra diluida de PBS en la Figura 6.
Después de seleccionar el tamaño y antes de la condensación (Paso 4.9), es posible eliminar los conjuntos sin burbujas centrifugando la muestra de microburbujas para separar las burbujas flotantes de los conjuntos no flotantes como lo describen Feshitan et al.21 El grado de separación se puede controlar ajustando la fuerza de espín y la duración. Sin embargo, los experimentos de condensación de microburbujas de tales muestras aisladas de tamaño revelaron que el uso de las poblaciones de microburbujas precursoras más grandes que se seleccionan utilizando procedimientos de aislamiento de tamaño produjo gotas más grandes (consulte el paso S5 “Otros protocolos y datos” para el tamaño posterior a la burbuja y las gotas). Dado que una aplicación prevista de gotas producidas con este protocolo es una plataforma para la extravasación pasiva y la acumulación debido a su pequeño tamaño en comparación con las microburbujas4,8,se deseaban poblaciones de gotas que fueran lo más pequeñas posible. Por lo tanto, este protocolo utilizó muestras de microburbujes post-agitadas que no fueron aisladas de tamaño a través de centrifugación, incluso si eso significaba que las micelas, liposomas y vesículas insensibles al ultrasonido estaban presentes en la solución final. Esto implica que los procedimientos de cuantificación para la biodisponsión derivarán señal para todas las estructuras inyectadas y no se limitan solo a las gotas. Sin embargo, dado que estas estructuras de tamaño similar probablemente se acumulan a través de un mecanismo pasivo que está dictado principalmente por el tamaño, no se sospecha que esto deba cambiar las principales inferencias que se pueden hacer si esta plataforma se va a utilizar in vivo,aunque todos estos aspectos deben considerarse individualmente dependiendo del contexto en el que se pueda utilizar la plataforma. Se pueden realizar pruebas con brazos experimentales con y sin ultrasonido para garantizar que sean las gotas sensibles al ultrasonido las responsables de cualquier cambio en la biodisponsión, ya que solo los ensamblajes de núcleos de perfluorocarbono en la solución responderán al ultrasonido.
Después de la agitación, el vial se descansó durante 15 minutos y se observó una partición en el vial(Figura 3C versus 3D). La selección de tamaño a través de la flotabilidad es un método simple para eliminar las estructuras / burbujas más grandes de una solución de microburbuja activada8,17. En este caso, las partículas con diámetros superiores a 5 μm se eliminaron principalmente después de la selección del tamaño(Figura 4). El alcance de la selección de tamaño se puede ajustar controlando la duración de la selección de tamaño17. Sheeran et al. han demostrado que no seleccionar el tamaño puede resultar en microburbujas generadas que ocluyen la vasculatura8.
Los perfluorocarbonos tienen la ventaja de ser biológicamente inertes7. Mientras que el punto de ebullición del decafluorobutano es de -1,7 °C, por encima de la temperatura corporal, las gotas no se vaporizan inmediatamente cuando se exponen a 37 °C(Figura 7B). Como las gotas son metaestables a 37 °C, se necesita energía acústica adicional para vaporizar las gotas a microburbujas7,9. Poprosky et al. han demostrado gotas de porfirina condensadas mediante presurización22. Este es un método viable e incluso esencial cuando se usan perfluorocarbonos menos densos, pero las altas presiones pueden destruir algunas burbujas en el proceso. El octafluoropropano (C3F8) tiene un punto de ebullición de -36.7 ° C, por lo que se necesita tanto el enfriamiento como la presurización para la condensación de gotas. Sin embargo, el perfluorocarbono más ligero conduce a gotas menos estables. El dodecafluoropentano (C5F12) puede dar lugar a gotas más estables con un punto de ebullición de 28 °C. Sin embargo, es un líquido a temperatura ambiente y necesitará energías acústicas más fuertes para vaporizarse. Por lo tanto, la elección del gas que contiene el agente de contraste de ultrasonido debe considerar las condiciones de su aplicación biológica prevista, además de los parámetros de su fabricación. En este protocolo, el baño de isopropanol para condensación se estableció en -15 a -17 °C (Paso 4.7.1 y Paso 4.13) mientras que otros protocolos utilizaron -10 °C 5,6. Incluso con un núcleo de decafluorobutano común, la temperatura de condensación puede variar según la composición del excipiente, la concentración total de lípidos y la composición de la cubierta lipídica. Si se utilizan otras formulaciones, es posible que se requiera una optimización para garantizar una condensación adecuada de las gotas sin hacer que la solución se congele.
Como las gotas son más pequeñas y más estables que su precursor de microburbujas7,pueden aprovechar mejor los mecanismos de acumulación pasiva para extravasar en ciertos tejidos de interés, como la permeabilidad mejorada y el efecto de retención de ciertos tipos de tumores4,24. Con métodos de detección fluorescentes, ópticamente absorbentes y acústicos14,es posible utilizar una sola formulación para cuantificar la absorción. Además, esta plataforma se puede utilizar para investigar si la vaporización acústica de las gotas puede mejorar la fracción del agente entregado más allá de los niveles pasivos16. Para cuantificar la biodisponsión del agente en tejidos y órganos de interés después de la inyección, se debe inyectar una cantidad conocida de gotas de pirolipídicos en el animal, se puede o no aplicar ultrasonido dependiendo del conjunto de control, se debe sacrificar al animal un punto de tiempo prees especificado y los órganos deben extraerse y pesarse. Los órganos deben ser homogeneizados, filtrados, diluidos en surfactante (detergente) para descelularizar el tejido, y cuantificados con fluorescencia o espectroscopia UV-Vis para obtener porcentajes de dosis inyectados por masa de órgano en función de las señales de Pyro. Para el Paso 5.4.5(Figura 5)y el Paso 5.5.5(Figura 6),se utilizó el surfactante Triton X-100 (detergente) para interrumpir las muestras, ya que no es fluorescente a 410 nm y sus longitudes de onda de absorbancia no se superponen con las de Pyro.
Las microburbujas no se caracterizaron con absorbancia UV-Vis. Como la fuente láser del espectroscopio UV-Vis es paralela al detector, cualquier burbuja grande podría dispersar la luz lejos del detector, haciéndolas parecer más absorbentes ópticamente14. A diferencia del espectrofotómetro UV-Vis, el detector del espectrofotómetro de fluorescencia es / debe ser perpendicular a la fuente láser para evitar que la fuente interfiera con el detector. Se utilizó UV-Vis para cuantificar la absorbancia de las muestras de gotas intactas e interrumpidas (Paso 5.4, Figura 5). Se eligieron de 300 a 800 nm como longitudes de onda de absorbancia ya que las dos bandas principales de absorbancia de pirolipídico, la banda de Soret (340 a 500 nm) y la banda Q (640 a 730 nm), se encuentran dentro de este rango14. Cuando se ensambla en una gota (u otras estructuras supramoleculares), el pico de la banda Q de pyro-lipid se desplaza al rojo de 671 nm a 700 nm(Figura 5). Cuando esta estructura supramolecular es interrumpida por un surfactante como Tritón, el pico vuelve a 671 nm14,15. Sobre la base de este cambio, es posible saber si los pirolipídicos están en un estado ensamblado o en un estado interrumpido. La relación de los dos picos se puede utilizar para estimar la descomposición de los ensamblajes a lo largo del tiempo.
Para las mediciones de fluorescencia (Paso 5.5, Figura 6),se eligió una longitud de onda de excitación de 410 nm ya que corresponde al pico de la banda de Soret para pirolipídico no ensamblado14. Se seleccionó un rango de longitud de onda de emisión de 600 a 800 nm, ya que los picos de los conjuntos intactos en PBS y los pirolipídicos interrumpidos en Tritón están contenidos dentro de este rango. El desplazamiento y aumento de la fluorescencia(Figura 6)entre las muestras intactas (704 nm en PBS) e interrumpidas (674 nm en Tritón) se produjo debido al enfriamiento inducido por la estructura. En la forma ensamblada, las moléculas de pirolípidos se empaquetaron muy juntas, por lo que los fotones generados fueron absorbidos por las moléculas de pirolípidos cercanas. Esto es evidente en la eficiencia de enfriamiento intacta versus interrumpida. Por lo tanto, es necesario diluir muestras en surfactante (detergente) como Triton X-100 al 1% para aliviar el enfriamiento y maximizar la señal para la cuantificación de la biodistribuición14.
Para simplificar, se utilizó el mismo transductor de ultrasonido de matriz lineal tanto para vaporizar como para obtener imágenes (Pasos 6.5 y 6.7, Figura 7). Este transductor de ultrasonido (Tabla de Materiales) fue capaz de alcanzar las presiones negativas máximas necesarias para vaporizar las gotas8. Llenar un tanque con agua desionizada de un grifo genera gases que se disuelven en el agua (Paso 6.1). Para minimizar la interferencia de los gases disueltos en el agua con vaporización e imágenes, el agua se descansó durante 24 horas en el tanque para permitir que los gases en el agua se equilibraran con la atmósfera (Paso 6.1). Alternativamente, el agua desionizada se puede desgasificación con un recipiente de tamaño suficiente y sellable conectado a un vacío suficientemente potente. Las imágenes de ultrasonido demostraron que las microburbujas se condensaron con éxito ya que las gotas no eran observables / no ecogénicas a bajas presiones (Figura 7B). Fue solo a presiones de salida más altas que las gotas se vaporizaron en microburbujas ecogénicas observables(Figura 7D,7F, 7H). Si bien la muestra de gotas post-condensada contiene micelas y liposomas / vesículas, estos ensamblajes no son ecogénicos y solo las gotas pueden vaporizarse en microburbujas ecogénicas. Se fluyó un control de PBS a través del fantasma para establecer imágenes de referencia(Figuras 7A, 7C, 7E, 7G). A medida que la presión aumentaba en el PBS, no se generó contraste. Esto indicó que las altas presiones del transductor no podían producir cavitación espontánea solo en un medio a base de agua, y por lo tanto todo el resto del contraste generado podría atribuirse al agente de contraste de ultrasonido empleado. Si la presión de salida es demasiado alta, las microburbujas generadas pueden ser destruidas. Al aumentar gradualmente la presión y observar el contraste generado, se puede encontrar la presión óptima8. La vida media de circulación de las gotas se puede determinar de manera similar vaporizando las gotas son ciertos intervalos de tiempo y observando el contraste generado a lo largo del tiempo7.
En resumen, se crearon gotas de cambio de fase multimodal con contenido variable de pirolipídicos con el método de condensación. El dimensionamiento mostró que había una compensación entre la carga de pirolipídicos y la concentración de microburbujas/gotas. Las caracterizaciones mostraron que había diferencias en las formas intactas e interrumpidas tanto en la absorbancia como en la fluorescencia. Las imágenes de ultrasonido mostraron que las gotas no eran ecogénicas a 37 ° C y se vaporizaban en microburbujas ecogénicas a presiones suficientes. Las caracterizaciones también mostraron el potencial de las gotas de pirolipídicos para reemplazar los agentes de diagnóstico acompañantes para las pruebas de biodis distribución o acumulación de gotas. El trabajo futuro investigará los umbrales de vaporización en solución, la estabilidad en solución y las duraciones de circulación in vivo en ratones desnudos.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al Dr. Brandon Helfield por ayudar a construir el intercambiador de gas y al Dr. Miffy Hok Yan Cheng por las discusiones técnicas. Los autores desean agradecer a las siguientes fuentes de financiamiento: Ontario Graduate Scholarship, Canadian Institutes of Health Research, Terry Fox Research Institute y Princess Margaret Cancer Foundation.
Materials
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-5000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880220 | Also known as "DSPE-PEG5K" |
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 855775 | Also known as "DSPC" |
| Aluminum Foil | Any brand | ||
| Aluminum Seals, Tear-Off | VWR | 16171-840 | Standard Aluminum, 13 mm outer diameter |
| Bath Sonicator | Any brand | Capable of sonicating and heating up to 70 °C, | |
| Bio-Stor Screw Cap Vials | National Scientific | BS20NABP | Plastic, 2 mL Skirted, with O-ring |
| Borosilicate glass clear serum vials | VWR | 16171-285 | 3 mL, 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter |
| Borosilicate Glass Sample Vial with Phenolic Screw Cap | VWR | 66011-020 | 1.85 mL, Short Form Style, 12 mm outer diameter, 35 mm height, 8-425 cap size |
| Borosilicate Glass Vial with Screw-On cap | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Chloroform | Any brand | ||
| Coulter Counter Elctrolyte Diluent | Any brand | Compatible with Coulter Counter | |
| Decafluorobutane (C4F10) | FluoroMed | 355-25-9 | |
| Deionized Water | Any brand | ||
| Dry Ice (Carbon Dioxide) | Any brand | ||
| Dynamic Light Scattering (DLS) Particle Analyzer | Any brand | Capable of temperature control | |
| E-Z Crimper, 13 mm | Wheaton | W225302 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| E-Z Decapper, 13 mm | Wheaton | W225352 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| Fluorescent Spectrophotometer | Any brand | Capable of 400 to 600 excitation and 300 to 800 nm emission detection, detector perpendicular to laser source | |
| Fluorescent Spectrophotometer Compatible Cuvette | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm, all four sides are optical windows | |
| Gas Exchanger | Made in-house | Refer to Supplementary Information – "Other Protocols and Data" for assembly instructions. | |
| Glass syringes | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| GLWR Custom Aperture Tube 10 um | Beckman Coulter | B42812 | 10 µm aperture, compatible with Beckman Coulter MultiSizer 4e |
| Glycerol | Any brand | ||
| Insulated Styrofaom containers with lids | Any brand | ||
| Isopropanol | Any brand | ||
| Lyophilization-Style Rubber Stoppers | VWR | 71000-060 | 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter, 2-leg, Chlorobutyl |
| Membrane Diaphram Vacuum Pump | Sartorius Stedim | 16694-1-60-06 | Adjustable pressure |
| Metal Tongs | Any brand | ||
| Methanol | Any brand | ||
| MS250 21 MHz Linear Array Ultrasound Transducer | VisualSonics | 21 MHz, Capable of B-mode and non-linear imaging. | |
| MultiSizer 4e | Beckman Coulter | Capable of sizing from 0.2µm to 6 µm | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 567-0010 | Polyethersulfone (PES) membrane, 0.1μm pore size, 1000 mL volume. As Isoton II is non-sterile, can use Filter units multiple times |
| Needles, Conventional | BD | 305176 | 20 gauge, 1.5 inch length |
| Nitrogen Gas | Any brand | Make sure there are regulator valves and tubes to direct the flow. Setup will be dependend on brand and source. | |
| Parafilm | Any brand | Called "wax film" in the protocol. | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Any brand | 1X, 7.4 pH | |
| Pipette | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Pipette Tips | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Plastic Syringes | Any brand | 1 mL, 3 mL, and 30 mL. With Luer Lock connections | |
| Polyethersulfone (PES) Membrane Filter | Any brand | 0.2 µm pore size | |
| Propylene Glycol | Any brand | ||
| Pyropheophorbide conjugated 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Made in-house | Also known as "Pyro-SPC". Refer to "Supplementary Information – Other Protocols and Data" for synthesis. | |
| Thermometer | Any brand | (-20 to 100 °C) | |
| Triton X-100 | Any brand | Also known as "2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol" | |
| Ultrapure Water | Any brand | Type 1 Purity | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer | Any brand | Capable of absorbance from 300 to 800 nm, at least 0.5 nm resolution | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer Compatible Cuvette, 1 cm Path Length | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm | |
| Vacuum Desiccator | Any brand | ||
| Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform | VisualSonics | Pre-clinical ultrasound imaging system | |
| Vialmix | Bristol-Myers-Squibb | Called "mechanical agitator" in the protocol. Agitates for 45 s. | |
| Vortex Mixer | Any brand |
References
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