Synthèse et caractérisation de gouttelettes de porphyrine multimodales à changement de phase
Summary
Dans ce protocole, les méthodes de synthèse et de caractérisation des gouttelettes de porphyrine multimodales à changement de phase sont décrites.
Abstract
Les gouttelettes à changement de phase sont une classe d’agents de contraste à ultrasons qui peuvent se convertir en microbulles échogéniques in situ avec l’application d’une énergie acoustique suffisante. Les gouttelettes sont plus petites et plus stables que leurs homologues à microbulles. Cependant, les agents de contraste à ultrasons traditionnels ne sont pas traçables au-delà des mesures de rétroaction acoustique, ce qui rend difficile la quantification de la biodiss distribution ou de l’accumulation ex vivo des agents de contraste. Les chercheurs pourraient devoir s’appuyer sur des particules diagnostiques compagnons fluorescentes ou optiquement absorbantes pour déduire la biodisponse. Le but de ce protocole est de détailler les étapes de création de gouttelettes de porphyrine multimodales à changement de phase à l’aide d’une méthode de condensation. Les porphyrines sont des molécules fluorescentes avec des bandes d’absorbance distinctes qui peuvent être conjuguées sur des lipides et incorporées dans des gouttelettes pour étendre la polyvalence des gouttelettes, permettant une bio-distribution plus robuste tout en conservant les propriétés acoustiques. Sept formulations avec des teneurs variables en porphyrine-lipides et en lipides de base ont été faites pour étudier les distributions de taille des microbulles et des gouttelettes. Des caractérisations adaptées aux structures contenant de la porphyrine sont également décrites dans le protocole pour démontrer leur polyvalence analytique en solution. Le dimensionnement a montré que les diamètres moyens post-condensés étaient de 1,72 à 2,38 fois plus petits que les populations de précurseurs. La caractérisation de l’absorbance a montré que les assemblages intacts avaient un pic en bande Q de 700 nm tandis que les échantillons perturbés avaient un pic d’absorbance à 671 nm. La caractérisation de la fluorescence a montré que 30% intacts des assemblages porphyrine-lipides étaient trempés par fluorescence (>97%), avec une récupération de fluorescence obtenue lors de la perturbation. La vaporisation acoustique a montré que les gouttelettes de porphyrine n’étaient pas échogènes à des pressions plus basses et pouvaient être converties en microbulles échogéniques avec des pressions suffisantes. Ces caractérisations montrent le potentiel des gouttelettes de porphyrine à éliminer le besoin de stratégies de diagnostic compagnon basées sur l’absorbance ou la fluorescence pour quantifier la biodisance des agents de contraste par ultrasons pour l’administration ou des applications thérapeutiques in vivo ou ex vivo.
Introduction
L’imagerie par ultrasons est une forme non invasive et non ionisante d’imagerie médicale qui utilise des ondes acoustiques. Alors que les échographes sont plus portables et peuvent fournir des images en temps réel, l’imagerie échographique peut souffrir d’un faible contraste, ce qui rend difficile pour les échographistes de distinguer de manière fiable des caractéristiques pathologiques échogéniques similaires. Pour contrer cette limitation, des microbulles peuvent être injectées dans l’hôte pour améliorer le contraste vasculaire. Les microbulles sont des agents de contraste remplis de gaz de la taille d’un micron qui sont hautement échogéniques aux ondes acoustiques et peuvent fournir un contraste de récipient amélioré1,2. Les coquilles et les noyaux de gaz des microbulles peuvent être adaptés à différentes applications, telles que l’imagerie, la thrombolyse, la perméabilisation de la membrane cellulaire ou l’ouverture vasculaire transitoire2.
Un inconvénient des microbulles est leur courte demi-vie de circulation. Par exemple, les microsphères lipidiques de perflutren cliniquement disponibles n’ont qu’une demi-vie de 1,3 minutes3. Pour les longues séances d’imagerie, plusieurs injections de microbulles sont nécessaires. Un autre inconvénient des microbulles est leur grand diamètre. Alors que les microsphères lipidiques perflutren ont un diamètre d’environ 1 à 3 μm, suffisamment petites pour circuler dans le système vasculaire, elles sont trop grandes pour s’extravaser et s’accumulent passivement dans les tissus d’intérêt, tels que les tumeurs4. Une stratégie pour surmonter ces limitations consiste à condenser les microbulles du noyau gazeux en gouttelettes plus petites à noyau liquide5,6. Bien que les gouttelettes ne soient pas échogènes à l’état liquide, elles peuvent être vaporisées en microbulles lors de l’exposition à des ultrasons avec une pression négative de crête suffisamment élevée, retrouvant ainsi leur capacité à fournir un contraste. Cela permet à la gouttelette de tirer parti de la pharmacocinétique plus favorable d’un petit noyau liquide, tout en conservant la capacité de fournir un contraste lorsqu’elle est insonée et sans modifier la composition chimique4,7.
Le décafluorobutane est un composé perfluorocarboné idéal pour le déphasage entre les états gazeux et liquide5,6,7. Le décafluorobutane permet la condensation des microbulles en gouttelettes avec réduction de température seule, tandis que les perfluorocarbures moins denses nécessitent une pressurisation supplémentaire5. Cette méthode douce minimise la destruction des bulles lors de la condensation7,8,9. Comme leurs noyaux sont liquides, les gouttelettes sont non échogéniques et invisibles aux ultrasons. Cependant, avec l’application d’une énergie acoustique ou thermique suffisante, les noyaux liquides peuvent se vaporiser à nouveau dans un état gazeux, générant des microbulles échogéniques8. Cette vaporisation permet de contrôler quand et où générer des microbulles.
Alors que les gouttelettes sont utiles pour l’accumulation passive, la vaporisation in situ ou l’amélioration de la perméabilité cellulaire4,les gouttelettes (et leurs fragments) ne peuvent pas être imagées ou quantifiées ex vivo. Par conséquent, des agents de diagnostic compagnons quantifiables, tels que les fluorescents4,10,11, particules magnétiques12, agents absorbants optiquement13, sont utilisés comme analogue pour évaluer l’administration de gouttelettes aux tissus d’intérêt. Par exemple, Helfield et al. ont utilisé une co-injection de nanobilles fluorescentes pour la quantification d’images histologiques d’organes de souris car les gouttelettes ne pouvaient pas être détectées par fluorescence4. L’inconvénient des agents de diagnostic compagnons est que le composant traçable peut agir indépendamment de la gouttelette en fonction de son profil pharmacocinétique individuel.
Heureusement, la coque des microbulles et des gouttelettes peut être personnalisée. Par exemple, Huynh et al. ont démontré des agents de contraste à ultrasons avec des coquilles porphyrine-lipidique, créant des microbulles multimodales14. Les porphyrines sont une classe de composés organiques à structure macrocylique aromatique14,15. Ils sont optiquement absorbants, fluorescents et peuvent être chélatés en une grande variété de métaux pour la radiothérapie, l’imagerie à base de radionucléides ou la quantification à base de métauxtraces 14. Un exemple de porphyrine est le pyrophéophore (Pyro). En conjuquant Pyro sur des lipides, l’incorporation de pyro-lipides dans des microbulles ou des gouttelettes leur permet d’être imagés et suivis à travers de multiples modalités: acoustiquement, fluorescentement et par absorbance14. Cet agent de contraste multimodal pourrait être utilisé pour suivre et quantifier l’accumulation. Cela pourrait éliminer le besoin d’agents de diagnostic compagnons car le composant quantifiable est maintenant conjugué sur la coque, ce qui permet une quantification plus précise del’administration 16.
Ici, un protocole pour la création de gouttelettes de porphyrine multimodales à changement de phase est décrit. Comme les contrastes échographiques peuvent être utilisés comme plate-forme pour l’administration de médicaments aux tissus d’intérêt, tels que les tumeurs2,4, étendre leur détectabilité au-delà des ultrasons pourrait s’avérer utile pour la quantification de l’efficacité de l’administration. Le but de ces gouttelettes est de fournir des agents de contraste à ultrasons traçables capables d’accumulation passive in vivo,de vaporisation in situ et d’acoustique, et ayant le potentiel de quantifier la biodisance ou l’accumulation à partir d’organes ex vivo sans dépendre de capteurs secondaires. Des méthodes de caractérisation sont également décrites pour mettre en évidence le potentiel des gouttelettes de porphyrine en tant que capteurs de biodiss distribution. Les effets de la charge pyro-lipidique dans la coquille (0% à 50% par rapport molaire) sont également discutés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Après avoir additionné tous les composants lipidiques ensemble (étapes 1.2 et 1.4.5, figure 1A),une solution de chloroforme et de méthanol (et d’eau si des lipides d’acide phosphatidique comme le DSPA sont présents) a été ajoutée pour s’assurer que les composants pyro-lipidiques et non pyro lipidiques étaient complètement homogénéisés (étape 1.5, figure 1B). Pour éviter la formation de vésicules lipidiques à composition lipidique hétérogène, les lipides dissous ont été séchés et enduits à l’intérieur de la paroi du flacon sous forme de film mince (Figure 1C). Le revêtement (étape 1.6) facilite également l’hydratation (étapes 2.1 à 2.4) car il augmente la surface du film séché. Le séchage (étape 1.6, figure 1C)et l’aspiration (étape 1.8, figure 1D)ont été effectués pour s’assurer que le chloroforme et le méthanol étaient complètement évaporés, car ces produits chimiques peuvent perturber la formation de microbulles. Alors que le protocole peut être réduit pour rendre les volumes de solution lipidique aussi bas que 1 mL, des volumes plus importants peuvent réduire la variation de flacon à flacon. Bien que cela puisse entraîner le risque de dégrader le Pyro-SPC lorsqu’il n’est pas utilisé, l’état de stockage de la solution lipidique (étapes 2.9 à 2.10) visait à réduire ce risque. L’étape de dégazage avec l’échangeur de gaz (étape 2.9.2, figure 1F et figure 2)sert à éliminer autant d’oxygène que possible pour éviter l’oxydation. Il n’est pas recommandé de stocker des solutions lipidiques contenant des lipides de porphyrine pendant que les gaz atmosphériques sont encore dissous dans la solution (Figure 1E).
À l’étape 2.10, la solution lipidique se trouve dans un flacon de sérum avec un espace de tête sous pression, semblable à la façon dont les microsphères lipidiques perflutren de l’agent de contraste à ultrasons cliniquement approuvé sont vendues (similaire à la figure 1F). Des travaux internes ont montré que des microbulles stables ne pouvaient pas être générées par agitation mécanique avec la présence de pyro-lipides si le capuchon était un matériau mou comme le bouchon en caoutchouc. Par conséquent, la solution lipidique a été transférée dans un flacon d’échantillon avec un capuchon phénolique non en caoutchouc (étapes 4.1 à 4.4, figure 3A et 3B). Lorsque le décafluorobutane a été coulé dans le flacon de l’échantillon (étapes 4.1 à 4.4), le décafluorobutane plus dense devrait déplacer l’air atmosphérique dans l’espace de tête du flacon de l’échantillon. Actuellement, on ne sait pas pourquoi les pyro-lipides sont incapables de former des microbulles avec des bouchons en caoutchouc. Sans pyro-lipides, des microbulles stables peuvent être fabriquées directement dans les flacons de sérum avec des bouchons en caoutchouc4,7. Ainsi, il est recommandé d’utiliser l’échangeur de gaz pour dégazer et re-pressuriser le flacon de sérum puis agiter le flacon de sérum lui-même pour des formulations non pyro-lipidiques4,5,6,7 (voir « Autres protocoles et données »). L’avantage de pouvoir agiter mécaniquement dans le flacon de sérum est que l’espace de tête peut être pressurisé et que la sélection de la taille peut être effectuée en inversant le flacon de sérum à l’envers8. Dans ce protocole, la formulation de pyro-lipides à 0 % a été transférée dans un flacon d’échantillon (étapes 4.1 à 4.4) pour être cohérente avec les formulations contenant des pyro-lipides. De plus, des longueurs de chaîne lipidique acyle plus longues entraînent des gouttelettes plus stables en raison de meilleures interactions de van der Waals19. La composition de la coquille lipidique a été choisie en fonction de ce qui était disponible dans le commerce, la longueur de la chaîne 18-acyle pour tous les types de lipides. DSPE-PEG5K a été incorporé dans toute la formulation (Étape 1.1) car la présence des chaînes de polyéthylène glycol empêche la coalescence des structures via des forces stériques répulsives19. Pendant l’hydratation lipidique, le bain sonicator de bain a été réglé à 70 °C (étape 2.1) à une hauteur suffisante pour disperser complètement le film lipidique de longueur de chaîne 18-acyle18. Pour les longueurs de chaîne acyle plus longues, des températures plus élevées seront nécessaires.
Une charge plus élevée en pyro-lipides augmenterait la concentration de composants optiquement absorbants et fluorescents, ce qui peut être souhaité pour certaines applications qui bénéficient d’une charge maximale en porphyrine. Cependant, à mesure que la teneur en pyro-lipides augmentait, la concentration observable de gouttelettes diminuait et les diamètres augmentaient(figure 4 et tableau 1). Cela illustre un compromis entre la fluorescence optique et les propriétés d’absorbance par rapport à la concentration et au diamètre des gouttelettes. Pour les chercheurs qui doivent donner la priorité aux petits diamètres pour l’accumulation in vivo à travers de petits vaisseaux qui fuient ou si une forte concentration de gouttelettes doit être injectée, l’augmentation de la charge en pyro-lipides peut ne pas valoir l’augmentation du dimètre de gouttelettes ou la diminution de la concentration de gouttelettes. Si des concentrations élevées de gouttelettes et/ou de petits diamètres de gouttelettes sont primordiaux, des agents de diagnostic compagnons de taille similaire doivent être envisagés à la place des pyro-lipides. Alors que les gouttelettes pyro-lipidiques à 1 % n’ont pas entraîné de diminution de la concentration ou d’augmentation de la taille, la charge en pyro-lipides à 1 % peut être trop faible pour être raisonnablement détectable à partir du fond tissulaire de manière fluorescente. Cependant, la flexibilité de la fraction porphyrine offre de multiples options de fonctionnalisation qui donneront d’autres moyens de quantification plus adaptés aux applications à faible concentration. Par exemple, les pyro-lipides peuvent être chélatés avec du cuivre-64 pour l’imagerie par tomographie par émission de positons et le comptage gamma20,ou avec du palladium pour la quantification des métaux traces par spectrométrie de masse, ou avec du manganèse pour l’imagerie par résonance magnétique14.
Bien que certaines expériences ne nécessitent qu’un petit volume de la solution de gouttelettes, 1 mL de la solution lipidique est nécessaire pour remplir le flacon d’échantillon de 1,85 mL. Goertz et al. ont démontré que les changements dans la manipulation, la pression de l’espace de tête, le rapport liquide-gaz et même la forme du flacon peuvent tous affecter les populations de microbulles17. La température du flacon pendant l’agitation et le choix de la taille peuvent également influencer la distribution de la taille. Par conséquent, pour les méthodes optimisées par l’utilisateur final, il est essentiel d’être aussi cohérent que possible lors de la fabrication de gouttelettes. Les gouttelettes non ouvertes peuvent être congelées (-20 °C) et décongelées plus tard pour une utilisation future, mais cela affectera les populations de taille.
La procédure d’agitation qui active une solution lipidique en microbulles ne produit pas une population morphologiquement homogène (étape 4.6); l’échantillon est plutôt rempli de microbulles, de vésicules multilamellaires, de liposomes et de micelles18,21,22. Alors que les tailles de microbulles couvrent la gamme du micron et du nanomètre, les autres structures sont largement inférieures à 800 nm 23. Les techniques de dimensionnement utilisées ne font pas de distinction entre ces différentes structures, de sorte que les échantillons de microbulles post-agitées (étape 4.6, figure 3C)et les échantillons de gouttelettes post-condensées (étape 4.14, figure 3F)doivent être considérés comme des mélanges. Les assemblages insensibles aux ultrasons (vésicules multilamellaires, liposomes et micelles) sont probablement conservés après la condensation et ne changeront pas de taille car ils n’ont pas de noyaux à changement de phase. Étant donné que le compteur de Coulter ne peut pas distinguer ces différents assemblages supramoléculaires, le changement de taille de la population à la suite de la condensation doit être interprété en supposant qu’une certaine proportion des structures à l’échelle nanométrique sont inconvertibles et contribuent à la population observée dans cette région de taille. De plus, ces structures contribuent aux signatures spectroscopiques et fluorescentes de ces échantillons14. Les signatures de fluorescence et d’absorbance des micelles, des liposomes/vésicules et des gouttelettes sont toutes similaires, y compris leur degré de trempe de fluorescence14. Ainsi, il est important de considérer qu’il existe un mélange d’assemblages dans les figures 3C à 3F, la figure 4,l’échantillon dilué PBS dans la figure 5et l’échantillon dilué PBS dans la figure 6.
Après sélection de la taille et avant la condensation (étape 4.9), il est possible d’éliminer les assemblages sans bulles en centrifugant l’échantillon de microbulles pour séparer les bulles flottantes des assemblages non flottants tels que décrits par Feshitan et al.21 Le degré de séparation peut être contrôlé en ajustant la force de spin et la durée. Cependant, des expériences de condensation de microbulles de tels échantillons isolés de taille ont révélé que l’utilisation des plus grandes populations de microbulles précurseurs sélectionnées à l’aide de procédures d’isolement de taille donnait des gouttelettes plus grosses (voir l’étape S5 des « Autres protocoles et données » pour le dimensionnement des bulles et des gouttelettes post-filées). Étant donné qu’une application prévue de gouttelettes produites avec ce protocole est une plate-forme d’extravasation passive et d’accumulation en raison de leur petite taille par rapport aux microbulles4,8, des populations de gouttelettes aussi petites que possible ont été souhaitées. Ainsi, ce protocole utilisait des échantillons de microbulles post-agités qui n’étaient pas isolés par centrifugation, même si cela signifiait que des micelles, des liposomes et des vésicules insensibles aux ultrasons étaient présents dans la solution finale. Cela implique que les procédures de quantification pour la biodiss distribution dériveront un signal pour toutes les structures injectées et ne se limitent pas aux gouttelettes. Cependant, étant donné que ces structures de taille similaire s’accumulent très probablement via un mécanisme passif qui est principalement dicté par la taille, il n’est pas soupçonné que cela devrait changer les principales inférences qui peuvent être faites si cette plate-forme doit être utilisée in vivo, bien que tous ces aspects doivent être considérés individuellement en fonction du contexte dans lequel la plate-forme peut être utilisée. Des tests utilisant des bras expérimentaux avec et sans ultrasons peuvent être effectués pour s’assurer que ce sont les gouttelettes sensibles aux ultrasons qui sont responsables de tout changement dans la biodisso distribution, car seuls les assemblages de noyaux de perfluorocarbone dans la solution répondront aux ultrasons.
Après agitation, le flacon a été reposé pendant 15 minutes et une partition a été observée dans le flacon(Figure 3C versus 3D). La sélection de la taille via la flottabilité est une méthode simple d’élimination des structures / bulles plus grandes d’une solution de microbullesactivées 8,17. Dans ce cas, les particules d’un diamètre supérieur à 5 μm ont été pour la plupart éliminées après sélection de la taille(figure 4). L’étendue de la sélection de la taille peut être réglée en contrôlant la durée de la sélection de la taille17. Sheeran et al. ont montré que le fait de ne pas sélectionner la taille peut entraîner des microbulles générées qui obstruent le système vasculaire8.
Les perfluorocarbures ont l’avantage d’être biologiquementinertes 7. Alors que le point d’ébullition du décafluorobutane est de -1,7 °C, au-dessus de la température corporelle, les gouttelettes ne se vaporisent pas immédiatement lorsqu’elles sont exposées à 37 °C(figure 7B). Comme les gouttelettes sont méta-stables à 37 °C, une énergie acoustique supplémentaire est nécessaire pour vaporiser les gouttelettes en microbulles7,9. Poprosky et al. ont démontré des gouttelettes de porphyrine condensées par pressurisation22. C’est une méthode viable et même essentielle lors de l’utilisation de perfluorocarbures moins denses, mais des pressions élevées peuvent détruire certaines bulles dans le processus. L’octafluoropropane(C3F8)a un point d’ébullition de -36,7 °C, de sorte que le refroidissement et la pressurisation sont nécessaires pour la condensation des gouttelettes. Cependant, le perfluorocarbure plus léger conduit à des gouttelettes moins stables. Le dodécafluoropentane(C5F12)peut conduire à des gouttelettes plus stables avec un point d’ébullition de 28 °C. Cependant, il s’agit d’un liquide à température ambiante et aura besoin d’énergies acoustiques plus fortes pour se vaporiser. Ainsi, le choix du gaz contenant l’agent de contraste à ultrasons doit tenir compte des conditions de son application biologique prévue en plus des paramètres de sa fabrication. Dans ce protocole, le bain d’isopropanol pour la condensation a été réglé à -15 à -17 °C (étape 4.7.1 et étape 4.13) tandis que d’autres protocoles utilisaient -10 °C 5,6. Même avec un noyau de décafluorobutane commun, la température de condensation peut varier en fonction de la composition de l’excipient, de la concentration totale de lipides et de la composition de la coquille lipidique. Si vous utilisez d’autres formulations, une optimisation peut être nécessaire pour assurer une condensation adéquate des gouttelettes sans provoquer le gel de la solution.
Comme les gouttelettes sont plus petites et plus stables que leur précurseur de microbulles7,elles peuvent mieux tirer parti des mécanismes d’accumulation passive pour extravaser dans certains tissus d’intérêt, tels que la perméabilité accrue et l’effet de rétention de certains types de tumeurs4,24. Avec les méthodes de détection fluorescentes, optiquement absorbantes etacoustiques 14, il est possible d’utiliser une seule formulation pour quantifier l’absorption. En outre, cette plate-forme peut être utilisée pour étudier si la vaporisation acoustique des gouttelettes peut améliorer la fraction d’agent délivrée au-delà des niveaux passifs16. Pour quantifier la biodisponsabilité de l’agent dans les tissus et les organes d’intérêt après l’injection, une quantité connue de gouttelettes pyro-lipidiques doit être injectée dans l’animal, des ultrasons peuvent ou non être appliqués en fonction de l’ensemble de contrôle, l’animal doit être sacrifié à un moment prédéterminé et les organes doivent être prélevés et pesés. Les organes doivent être homogénéisés, filtrés, dilués dans un tensioactif (détergent) pour décellulariser le tissu, et quantifiés par fluorescence ou spectroscopie UV-Vis pour obtenir des pourcentages de dose injectée par masse d’organe basés sur les signaux Pyro. Pour l’étape 5.4.5 (Figure 5) et l’Étape 5.5.5 (Figure 6), le tensioactif Triton X-100 (détergent) a été utilisé pour perturber les échantillons car il n’est pas fluorescent à 410 nm et ses longueurs d’onde d’absorbance ne se chevauchent pas avec pyro.s.
Les microbulles n’ont pas été caractérisées par une absorbance UV-Vis. Comme la source laser du spectroscope UV-Vis est parallèle au détecteur, toute grande bulle pourrait disperser la lumière loin du détecteur, ce qui les rendrait plus absorbantes optiquement14. Contrairement au spectrophotomètre UV-Vis, le détecteur du spectrophotomètre à fluorescence est/doit être perpendiculaire à la source laser pour éviter que la source n’interfère avec le détecteur. UV-Vis a été utilisé pour quantifier l’absorbance des échantillons de gouttelettes intactes et perturbées (étape 5.4, figure 5). 300 à 800 nm ont été choisis comme longueurs d’onde d’absorbance car les deux principales bandes d’absorbance du pyro-lipide, la bande de Soret (340 à 500 nm) et la bande Q (640 à 730 nm), se situent dans cette plage14. Lorsqu’il est assemblé en une gouttelette (ou d’autres structures supramoléculaires), le pic en bande Q du pyro-lipide est décalé vers le rouge de 671 nm à 700 nm(Figure 5). Lorsque cette structure supramoléculaire est perturbée par un tensioactif comme Triton, le pic revient à 671 nm14,15. Sur la base de ce changement, il est possible de dire si les pyro-lipides sont dans un état assemblé ou dans un état perturbé. Le rapport des deux pics peut être utilisé pour estimer la désintégration des assemblages au fil du temps.
Pour les mesures de fluorescence (étape 5.5, figure 6),une longueur d’onde d’excitation de 410 nm a été choisie car elle correspond au pic de bande de Soret pour le pyro-lipide14non assemblé. Une gamme de longueurs d’onde d’émission de 600 à 800 nm a été sélectionnée car les pics des assemblages intacts dans PBS et les pyro-lipides perturbés dans Triton sont contenus dans cette plage. Le déplacement et l’augmentation de la fluorescence(figure 6)entre les échantillons intacts (704 nm dans PBS) et perturbés (674 nm dans Triton) se sont produits en raison de la trempe induite par la structure. Sous forme assemblée, les molécules pyro-lipidiques ont été étroitement emballées ensemble, de sorte que les photons générés ont été absorbés par les molécules pyro-lipidiques voisines. Cela est évident dans l’efficacité de trempe intacte par rapport à l’efficacité de trempe perturbée. Ainsi, il est nécessaire de diluer les échantillons dans un tensioactif (détergent) comme 1% de Triton X-100 pour soulager la trempe et maximiser le signal pour la quantification de la bio-distribution14.
Par souci de simplicité, le même transducteur à ultrasons linéaire a été utilisé à la fois pour vaporiser et imager (étapes 6.5 et 6.7, figure 7). Ce transducteur à ultrasons (Table des matériaux) était capable d’atteindre les pressions négatives maximales nécessaires pour vaporiser les gouttelettes8. Le remplissage d’un réservoir avec de l’eau désionisée provenant d’un robinet génère des gaz qui se dissolvent dans l’eau (étape 6.1). Pour minimiser les interférences des gaz dissous dans l’eau avec la vaporisation et l’imagerie, l’eau a été reposée pendant 24 h dans le réservoir pour permettre aux gaz dans l’eau de s’équilibrer avec l’atmosphère (étape 6.1). Alternativement, l’eau désionisée peut être dégazée avec un récipient suffisamment dimensionné et scellable relié à un vide suffisamment puissant. Les images échographiques ont démontré que les microbulles étaient condensées avec succès car les gouttelettes étaient inobservables/non échogéniques à basse pression (Figure 7B). Ce n’est qu’à des pressions de sortie plus élevées que les gouttelettes se sont vaporisées en microbulles échogènes observables(Figure 7D,7F, 7H). Bien que l’échantillon de gouttelettes post-condensées contienne des micelles et des liposomes/vésicules, ces assemblages ne sont pas échogéniques et seules les gouttelettes peuvent se vaporiser en microbulles échogéniques. Un contrôle PBS a été transmis à travers le fantôme pour établir des images de base(figures 7A, 7C, 7E, 7G). Comme la pression augmentait dans le PBS, aucun contraste n’a été généré. Cela indiquait que les pressions élevées du transducteur ne pouvaient pas produire de cavitation spontanée dans un milieu à base d’eau seul, et donc tous les autres contrastes générés pouvaient être attribués à l’agent de contraste à ultrasons utilisé. Si la pression de sortie est trop élevée, les microbulles générées peuvent être détruites. En augmentant progressivement la pression et en observant le contraste généré, la pression optimale peut être trouvée8. La demi-vie de circulation des gouttelettes peut être déterminée de la même manière en vaporisant les gouttelettes sont certains intervalles de temps et en observant le contraste généré au fil du temps7.
En résumé, des gouttelettes multimodales à changement de phase avec une teneur variable en pyro-lipides ont été créées avec la méthode de condensation. Le dimensionnement a montré qu’il y avait un compromis entre la charge en pyro-lipides et la concentration de microbulles/gouttelettes. Les caractérisations ont montré qu’il y avait des différences dans les formes intactes et perturbées à la fois dans l’absorbance et la fluorescence. L’imagerie échographique a montré que les gouttelettes n’étaient pas échogènes à 37 °C et étaient vaporisables en microbulles échogéniques à des pressions suffisantes. Les caractérisations ont également montré le potentiel des gouttelettes pyro-lipidiques pour remplacer les agents diagnostiques compagnons pour les tests de biodiss distribution ou d’accumulation des gouttelettes. Les travaux futurs étudieront les seuils de vaporisation en solution, la stabilité en solution et les durées de circulation in vivo chez des souris nues.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs aimeraient remercier le Dr Brandon Helfield pour avoir aidé à construire l’échangeur de gaz et le Dr Miffy Hok Yan Cheng pour les discussions techniques. Les auteurs tiennent à remercier les sources de financement suivantes : Bourse d’études supérieures de l’Ontario, Instituts de recherche en santé du Canada, Institut de recherche Terry Fox et Fondation du cancer Princess Margaret.
Materials
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-5000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880220 | Also known as "DSPE-PEG5K" |
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 855775 | Also known as "DSPC" |
| Aluminum Foil | Any brand | ||
| Aluminum Seals, Tear-Off | VWR | 16171-840 | Standard Aluminum, 13 mm outer diameter |
| Bath Sonicator | Any brand | Capable of sonicating and heating up to 70 °C, | |
| Bio-Stor Screw Cap Vials | National Scientific | BS20NABP | Plastic, 2 mL Skirted, with O-ring |
| Borosilicate glass clear serum vials | VWR | 16171-285 | 3 mL, 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter |
| Borosilicate Glass Sample Vial with Phenolic Screw Cap | VWR | 66011-020 | 1.85 mL, Short Form Style, 12 mm outer diameter, 35 mm height, 8-425 cap size |
| Borosilicate Glass Vial with Screw-On cap | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Chloroform | Any brand | ||
| Coulter Counter Elctrolyte Diluent | Any brand | Compatible with Coulter Counter | |
| Decafluorobutane (C4F10) | FluoroMed | 355-25-9 | |
| Deionized Water | Any brand | ||
| Dry Ice (Carbon Dioxide) | Any brand | ||
| Dynamic Light Scattering (DLS) Particle Analyzer | Any brand | Capable of temperature control | |
| E-Z Crimper, 13 mm | Wheaton | W225302 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| E-Z Decapper, 13 mm | Wheaton | W225352 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| Fluorescent Spectrophotometer | Any brand | Capable of 400 to 600 excitation and 300 to 800 nm emission detection, detector perpendicular to laser source | |
| Fluorescent Spectrophotometer Compatible Cuvette | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm, all four sides are optical windows | |
| Gas Exchanger | Made in-house | Refer to Supplementary Information – "Other Protocols and Data" for assembly instructions. | |
| Glass syringes | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| GLWR Custom Aperture Tube 10 um | Beckman Coulter | B42812 | 10 µm aperture, compatible with Beckman Coulter MultiSizer 4e |
| Glycerol | Any brand | ||
| Insulated Styrofaom containers with lids | Any brand | ||
| Isopropanol | Any brand | ||
| Lyophilization-Style Rubber Stoppers | VWR | 71000-060 | 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter, 2-leg, Chlorobutyl |
| Membrane Diaphram Vacuum Pump | Sartorius Stedim | 16694-1-60-06 | Adjustable pressure |
| Metal Tongs | Any brand | ||
| Methanol | Any brand | ||
| MS250 21 MHz Linear Array Ultrasound Transducer | VisualSonics | 21 MHz, Capable of B-mode and non-linear imaging. | |
| MultiSizer 4e | Beckman Coulter | Capable of sizing from 0.2µm to 6 µm | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 567-0010 | Polyethersulfone (PES) membrane, 0.1μm pore size, 1000 mL volume. As Isoton II is non-sterile, can use Filter units multiple times |
| Needles, Conventional | BD | 305176 | 20 gauge, 1.5 inch length |
| Nitrogen Gas | Any brand | Make sure there are regulator valves and tubes to direct the flow. Setup will be dependend on brand and source. | |
| Parafilm | Any brand | Called "wax film" in the protocol. | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Any brand | 1X, 7.4 pH | |
| Pipette | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Pipette Tips | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Plastic Syringes | Any brand | 1 mL, 3 mL, and 30 mL. With Luer Lock connections | |
| Polyethersulfone (PES) Membrane Filter | Any brand | 0.2 µm pore size | |
| Propylene Glycol | Any brand | ||
| Pyropheophorbide conjugated 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Made in-house | Also known as "Pyro-SPC". Refer to "Supplementary Information – Other Protocols and Data" for synthesis. | |
| Thermometer | Any brand | (-20 to 100 °C) | |
| Triton X-100 | Any brand | Also known as "2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol" | |
| Ultrapure Water | Any brand | Type 1 Purity | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer | Any brand | Capable of absorbance from 300 to 800 nm, at least 0.5 nm resolution | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer Compatible Cuvette, 1 cm Path Length | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm | |
| Vacuum Desiccator | Any brand | ||
| Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform | VisualSonics | Pre-clinical ultrasound imaging system | |
| Vialmix | Bristol-Myers-Squibb | Called "mechanical agitator" in the protocol. Agitates for 45 s. | |
| Vortex Mixer | Any brand |
References
- Gramiak, R., Shah, P. M. Echocardiography of the aortic root. Investigative Radiology. 3 (5), 356-366 (1968).
- Ferrara, K., Pollard, R., Borden, M. Ultrasound microbubble contrast agents: fundamentals and application to gene and drug delivery. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 415-447 (2007).
- Bing, K. F., Howles, G. P., Qi, Y., Palmeri, M. L., Nightingale, K. R. Blood-brain barrier (BBB) disruption using a diagnostic ultrasound scanner and Definity in mice. Ultrasound in Medicine and Biology. 35 (8), 1298-1308 (2009).
- Helfield, B. L., et al. Investigating the accumulation of submicron phase-change droplets in tumors. Ultrasound in Medicine and Biology. 49 (10), 2891 (2020).
- Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons. Biomaterials. 33 (11), 3262-3296 (2012).
- Sheeran, P. S., et al. Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2016).
- Yoo, K., et al. Impact of encapsulation on in vitro and in vivo performance of volatile nanoscale phase-shift perfluorocarbon droplets. Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (8), 1836-1852 (2018).
- Sheeran, P. S., et al. Image-guided ultrasound characterization of volatile sub-micron phase-shift droplets in the 20-40 MHz frequency range. Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (3), 795-807 (2016).
- Sheeran, P. S., et al. More than bubbles: creating phase-shift droplets from commercially available ultrasound contrast agents. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (2), 531-540 (2017).
- Chen, C. C., et al. Targeted drug delivery with focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening using acoustically-activated nanodroplets. Journal of Controlled Release. 172 (3), 795-804 (2013).
- Wu, S. Y., et al. Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets. Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002 (2018).
- Lee, J. Y., et al. Ultrasound-enhanced siRNA delivery using magnetic nanoparticle-loaded chitosan-deoxycholic acid nanodroplets. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), 1601246 (2017).
- Cao, Y., et al. Drug release from phase-changeable nanodroplets triggered by low-intensity focused ultrasound. Theranostics. 8 (5), 1327-1339 (2018).
- Huynh, E., Jin, C. S., Wilson, B. C., Zheng, G. Aggregate enhanced trimodal porphyrin shell microbubbles for ultrasound, photoacoustic, and fluorescence imaging. Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 796-801 (2014).
- Zheng, G., et al. Low-density lipoprotein reconstituted by pyropheophorbide cholesteryl oleate as target-specific photosensitizer. Bioconjugate Chemistry. 13 (3), 392-396 (2002).
- Dhaliwal, A., Zheng, G. Improving accessibility of EPR-insensitive tumor phenotypes using EPR-adaptive strategies: Designing a new perspective in nanomedicine delivery. Theranostics. 9 (26), 8091-8108 (2019).
- Goertz, D. E., de Jong, N., vander Steen, A. F. Attenuation and size distribution measurements of Definity and manipulated Definity populations. Ultrasound in Medicine and Biology. 33 (9), 1376 (2007).
- Pellow, C., Acconcia, C., Zheng, G., Goertz, D. E. Threshold-dependent nonlinear scattering from porphyrin nanobubbles for vascular and extravascular applications. Physics in Medicine and Biology. 63 (21), 215001 (2018).
- Kwan, J. J., Borden, M. A. Lipid monolayer collapse and microbubble stability. Advances in Colloid and Interface Science. 183, 82-99 (2012).
- Overchuk, M., et al. Subtherapeutic Photodynamic Treatment Facilitates Tumor Nanomedicine Delivery and Overcomes Desmoplasia. Nano Letters. 21 (1), 344-352 (2021).
- Feshitan, J., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. Microbubble size isolation by differential centrifugation. Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).
- Paproski, R. J., et al. Porphyrin nanodroplets: Sub-micrometer ultrasound and photoacoustic contrast imaging agents. Small. 12 (3), 371-380 (2016).
- Periyasamy, P. C., Leijten, J. C. H., Dijkstra, P. J., Karperien, M., Post, J. N. Nanomaterials for the local and targeted delivery of osteoarthritis drugs. Journal of Nanomaterials. 2021, 1-13 (2012).
- Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Research. 46 (12), 6387-6392 (1986).
