Sintesi e caratterizzazione di goccioline di porfirina multimodali a cambiamento di fase
Summary
In questo protocollo vengono delineati i metodi per sintetizzare e caratterizzare le goccioline di porfirina multimodali a cambiamento di fase.
Abstract
Le goccioline a cambiamento di fase sono una classe di agenti di contrasto ad ultrasuoni che possono convertirsi in microbolle ecogeniche in situ con l’applicazione di energia acustica sufficiente. Le goccioline sono più piccole e più stabili delle loro controparti di microbolle. Tuttavia, i tradizionali agenti di contrasto ad ultrasuoni non sono rintracciabili al di là delle misurazioni di feedback acustico, il che rende difficile quantificare la biodistribuendo o l’accumulo di agenti di contrasto ex vivo. I ricercatori potrebbero dover fare affidamento su particelle diagnostiche di accompagnamento fluorescenti o otticamente assorbenti per dedurre la biodisponimo distribuzione. Lo scopo di questo protocollo è quello di dettagliare i passaggi per la creazione di goccioline di porfirina a cambiamento di fase multimodale utilizzando un metodo di condensazione. Le porfirine sono molecole fluorescenti con bande di assorbanza distinte che possono essere coniugate sui lipidi e incorporate in goccioline per estendere la versatilità delle goccioline, consentendo una biodistribuendozione più robusta pur mantenendo le proprietà acustiche. Sono state fatte sette formulazioni con diversi contenuti di porfirina-lipidi e lipidi di base per studiare le distribuzioni di dimensioni di microbolle e goccioline. Caratterizzazioni adatte a strutture contenenti porfirina sono anche descritte nel protocollo per dimostrare la loro versatilità analitica in soluzione. Il dimensionamento ha mostrato che i diametri medie post-condensati erano da 1,72 a 2,38 volte più piccoli delle popolazioni precursori. La caratterizzazione dell’assorbanza ha mostrato che gli assemblaggi intatti avevano un picco in banda Q di 700 nm, mentre i campioni interrotti avevano un picco di assorbanza a 671 nm. La caratterizzazione della fluorescenza ha mostrato che gli assemblaggi intatti del 30% di porfirina-lipidi erano fluorescenti (>97%), con recupero di fluorescenza ottenuto in caso di interruzione. La vaporizzazione acustica ha mostrato che le goccioline di porfirina non erano ecogeniche a pressioni più basse e potevano essere convertite in microbolle ecogeniche con pressioni sufficienti. Queste caratterizzazioni mostrano il potenziale delle goccioline di porfirina per eliminare la necessità di assorbanza o strategie diagnostiche di accompagnamento basate sulla fluorescenza per quantificare la biodisdistribuzioni di agenti di contrasto ad ultrasuoni per la somministrazione o applicazioni terapeutiche in vivo o ex vivo.
Introduction
L’imaging ad ultrasuoni è una forma non invasiva e non ionizzante di imaging medico che utilizza onde acustiche. Mentre gli scanner ad ultrasuoni sono più portatili e possono fornire immagini in tempo reale, l’imaging a ultrasuoni può soffrire di basso contrasto, rendendo difficile per gli ecografisti distinguere in modo affidabile caratteristiche patologiche ecogeniche simili. Per contrastare questa limitazione, le microbolle possono essere iniettate nell’ospite per migliorare il contrasto vascolare. Le microbolle sono agenti di contrasto riempiti di gas di dimensioni micron che sono altamente ecogenici alle onde acustiche e possono fornire un contrasto maggiore del vaso1,2. I gusci e i nuclei di gas delle microbolle possono essere personalizzati per diverse applicazioni, come l’imaging, la trombolisi, la permeabilizzazione della membrana cellulare o l’apertura vascolare transitoria2.
Uno svantaggio delle microbolle è la loro breve emivita di circolazione. Ad esempio, le microsfere lipidiche perflutren clinicamente disponibili hanno solo un’emivita di 1,3 minuti3. Per lunghe sessioni di imaging, sono necessarie iniezioni multiple di microbolle. Un altro inconveniente delle microbolle sono i loro grandi diametri. Mentre le microsfere lipidiche perflutren hanno un diametro compreso tra 1 e 3 μm, abbastanza piccole da circolare in vascolarizzazione, sono troppo grandi per essere stravasate e si accumulano passivamente nei tessuti di interesse, come i tumori4. Una strategia per superare queste limitazioni è quella di condensare le microbolle gas-core in goccioline più piccole, liquid-core5,6. Mentre le goccioline non sono ecogeniche nel loro stato liquido, possono essere vaporizzate in microbolle dopo l’esposizione agli ultrasuoni con una pressione negativa di picco sufficientemente elevata, riacquistando la loro capacità di fornire contrasto. Ciò consente alla goccia di sfruttare la farmacocinetica più favorevole di un piccolo nucleo liquido, pur mantenendo la capacità di fornire contrasto quando insonata e senza modificare la composizione chimica4,7.
Il decafluorobutano è un composto perfluorocarburo ideale per lo sfasare tra gli stati gassoso e liquido5,6,7. Il decafluorobutano consente la condensazione delle microbolle in goccioline con la sola riduzione della temperatura, mentre i perfluorocarburi meno densi richiedono una pressurizzazione aggiuntiva5. Questo metodo delicato riduce al minimo la distruzione delle bolle durante la condensazione7,8,9. Poiché i loro nuclei sono liquidi, le goccioline non sono ecogeniche e invisibili agli ultrasuoni. Tuttavia, con l’applicazione di sufficiente energia acustica o termica, i nuclei liquidi possono vaporizzare di nuovo in uno stato gassoso, generando microbolle ecogeniche8. Questa vaporizzazione consente di controllare quando e dove generare microbolle.
Mentre le goccioline sono utili per l’accumulo passivo, la vaporizzazione in situ o il miglioramento della permeabilità cellulare4, le goccioline (e i loro frammenti) non possono essere immagini o quantificate ex vivo. Pertanto, l’agente diagnostico complementare quantificabile, comefluorescenti 4,10,11, particelle magnetiche12, agenti otticamente assorbenti13, sono utilizzati come analogo per misurare la consegna di goccioline ai tessuti di interesse. Ad esempio, Helfield et al. hanno utilizzato una co-iniezione di nano-perline fluorescenti per la quantificazione delle immagini istologiche degli organi di topo poiché le goccioline non potevano essere rilevate fluorescentemente4. Lo svantaggio degli agenti diagnostici di accompagnamento è che il componente tracciabile può agire indipendentemente dalla goccia a seconda del suo profilo farmacocinetico individuale.
Fortunatamente, il guscio di microbolle e goccioline può essere personalizzato. Ad esempio, Huynh et al. hanno dimostrato agenti di contrasto ad ultrasuoni con gusci di porfirina-lipidi, creando microbolle multimodali14. Le porfirine sono una classe di composti organici a struttura macrocilica aromatica14,15. Sono otticamente assorbenti, fluorescenti e possono essere chelati a un’ampia varietà di metalli per la radioterapia, l’imaging a base di radionuclidi o la quantificazione a base di metalli in traccia14. Un esempio di porfirina è il pirofeoforbide (Pyro). Coniugando Pyro sui lipidi, incorporando Piro-lipidi in microbolle o goccioline consente loro di essere ripresi e tracciati attraverso molteplici modalità: acusticamente, fluorescentemente e attraverso l’assorbanza14. Questo agente di contrasto multimodale potrebbe essere utilizzato per tracciare e quantificare l’accumulo. Ciò potrebbe eliminare la necessità di agenti diagnostici complementari poiché il componente quantificabile è ora coniugato sul guscio, consentendo una quantificazione di consegna più accurata16.
Qui viene delineato un protocollo per la creazione di goccioline di porfirina a cambiamento di fase multimodale. Poiché gli agenti di contrasto ad ultrasuoni possono essere utilizzati come piattaforma per la somministrazione di farmaci ai tessuti di interesse, come i tumori2,4, estendere la loro rilevabilità oltre gli ultrasuoni potrebbe rivelarsi utile per la quantificazione dell’efficacia della consegna. Lo scopo di queste goccioline è quello di fornire agenti di contrasto ad ultrasuoni tracciabili in grado di accumulo passivo in vivo,vaporizzazione in situ e acustica, e con il potenziale di quantificare la biodispertura o l’accumulo da organi ex vivo senza la dipendenza da sensori secondari. I metodi di caratterizzazione sono anche delineati per mostrare il potenziale delle goccioline di porfirina come sensori di biodispressione. Vengono anche discussi gli effetti del carico piro-lipidico nel guscio (da 0% a 50% dal rapporto molare).
Protocol
Representative Results
Discussion
Dopo aver sommato tutti i componenti lipidici insieme (Fasi 1.2 e 1.4.5, Figura 1A),è stata aggiunta una soluzione di cloroformio e metanolo (e acqua se sono presenti lipidi dell’acido fosfatidico come DSPA) per garantire che i componenti piro-lipidici e non piro lipidici fossero completamente omogeneizzati (Fase 1.5, Figura 1B). Per prevenire la formazione di vescicole lipidiche con composizione lipidica eterogenea, i lipidi disciolti sono stati essiccati e rivestiti all’interno della parete della fiala come un film sottile (Figura 1C). Il rivestimento (Step 1.6) facilita anche l’idratazione (Step da 2.1 a 2.4) in quanto aumenta la superficie del film essiccato. L’essiccazione (Fase 1.6, Figura 1C)e l’aspirazione (Fase 1.8, Figura 1D)sono state fatte per garantire che il cloroformio e il metanolo fossero completamente evaporati poiché queste sostanze chimiche possono interrompere la formazione di microbolle. Mentre il protocollo può essere ridimensionato per rendere i volumi della soluzione lipidica fino a 1 mL, volumi maggiori possono ridurre la variazione da flaconcino a flaconcino. Mentre questo può correre il rischio di degradare il Pyro-SPC mentre non è in uso, la condizione di conservazione della soluzione lipidica (fase da 2.9 a 2.10) aveva lo scopo di ridurre tale rischio. La fase di degasaggio con lo scambiatore di gas (Step 2.9.2, Figura 1F e Figura 2)serve ad eliminare più ossigeno possibile per prevenire l’ossidazione. Non è consigliabile conservare soluzioni lipidiche contenenti porfirina-lipidi mentre i gas atmosferici sono ancora disciolti nella soluzione (Figura 1E).
Nella fase 2.10, la soluzione lipidica si trova in una fiala sierica con uno spazio di testa pressurizzato, simile a come vengono vendute le microsfere lipidiche perflutren dell’agente di contrasto ad ultrasuoni clinicamente approvato (simile alla Figura 1F). Il lavoro interno ha dimostrato che le microbolle stabili non potrebbero essere generate tramite agitazione meccanica con la presenza di pirolipidi se il cappuccio fosse un materiale morbido come il tappo di gomma. Pertanto, la soluzione lipidica è stata trasferita in un flaconcino campione con un cappuccio fenolico non in gomma (Fasi da 4.1 a 4.4, Figura 3A e 3B). Quando il gas decafluorobutano è stato fatto fluire nel flaconcino del campione (passaggi da 4.1 a 4.4), il decafluorobutano più denso deve spostare l’aria atmosferica nello spazio di testa del flaconcino del campione. Attualmente, non è noto il motivo per cui i pirolipidi non sono in grado di formare microbolle con tappi di gomma. Senza pirolipidi, le microbolle stabili possono essere prodotte direttamente nelle fiale di siero con tappi di gomma4,7. Pertanto, si consiglia di utilizzare lo scambiatore di gas per degasare e ri-pressurizzare il flaconcino di siero, quindi agitare il flaconcino di siero stesso per formulazioni non piro-lipidiche4,5,6,7 (vedere “Altri protocolli e dati”). Il vantaggio di poter agitare meccanicamente nella fiala di siero è che lo spazio di testa può essere pressurizzato e la selezione delle dimensioni può essere effettuata invertendo la fiala del siero capovolta8. In questo protocollo, la formulazione pirolipidici allo 0% è stata trasferita in una fiala campione (passi da 4.1 a 4.4) per essere coerente con le formulazioni che contenevano pirolipidi. Inoltre, lunghezze più lunghe della catena lipidica acilico si traducono in goccioline più stabili a causa di migliori interazioni di van der Waals19. La composizione del guscio lipidico è stata scelta in base a ciò che era disponibile in commercio, lunghezza della catena a 18 acilici per tutti i tipi di lipidi. DSPE-PEG5K è stato incorporato in tutta la formulazione (Step 1.1) in quanto la presenza delle catene di polietilenglicole impedisce la coalescenza delle strutture tramite forze steriche repulsive19. Durante l’idratazione lipidica, il bagno sonicatore del bagno è stato impostato a 70 °C (Step 2.1) come abbastanza alto da disperdere completamente il film lipidico di lunghezza della catena 18-acilica18. Per le lunghezze della catena acilico più lunghe, saranno necessarie temperature più elevate.
Un carico piro-lipidico più elevato aumenterebbe la concentrazione di componenti che assorbono otticamente e fluorescenti, che possono essere desiderati per alcune applicazioni che beneficiano del carico massimizzato della porfirina. Tuttavia, con l’aumentare del contenuto di pirolipidi, la concentrazione di goccioline osservabili è diminuita e i diametri sono aumentati (Figura 4 e Tabella 1). Ciò illustra un compromesso tra fluorescenza ottica e proprietà di assorbanza rispetto alla concentrazione e al diametro delle goccioline. Per i ricercatori che devono dare la priorità a piccoli diametri per l’accumulo in vivo attraverso piccoli vasi che perdono o se è necessario iniettare un’alta concentrazione di goccioline, aumentare il carico piro-lipidico potrebbe non valere l’aumento del dimetro delle goccioline o la diminuzione della concentrazione di goccioline. Se alte concentrazioni di goccioline e/o piccoli diametri di goccioline sono fondamentali, devono essere considerati agenti diagnostici di accompagnamento di dimensioni simili al posto dei pirolipidi. Mentre l’1% di goccioline piro-lipidiche non ha provocato una diminuzione della concentrazione o un aumento delle dimensioni, il carico piro-lipidico dell’1% può essere troppo basso per essere ragionevolmente rilevabile dal fondo del tessuto fluorescente. Tuttavia, la flessibilità della porzione di porfirina offre molteplici opzioni per la funzionalizzazione che impartiranno mezzi alternativi di quantificazione più adatti per applicazioni a bassa concentrazione. Ad esempio, i piro-lipidi possono essere chelati con rame-64 per l’imaging tomografico ad emissione di positoni e il conteggio gamma20, o con palladio per la quantificazione di tracce di metalli usando la spettrometria di massa, o con manganese per la risonanza magnetica14.
Mentre alcuni esperimenti possono richiedere solo un piccolo volume della soluzione di goccioline, è necessario 1 mL della soluzione lipidica per riempire il flaconcino del campione da 1,85 mL. Goertz et al. hanno dimostrato che i cambiamenti nella manipolazione, nella pressione dello spazio di testa, nel rapporto liquido-gas e persino nella forma della fiala possono influenzare le popolazioni di microbolle17. La temperatura del flaconcino durante l’agitazione e la selezione delle dimensioni possono anche influenzare la distribuzione delle dimensioni. Pertanto, per i metodi ottimizzati dall’utente finale, è fondamentale essere il più coerenti possibile quando si effettuano goccioline. Le goccioline non spese possono essere congelate (-20 °C) e scongelate in seguito per un uso futuro, ma ciò influenzerà le popolazioni di dimensioni.
La procedura di agitazione che attiva una soluzione lipidica in microbolle non produce una popolazione morfologicamente omogenea (Step 4.6); piuttosto, il campione è pieno di microbolle, vescicole multilamellari, liposomi e micelle18,21,22. Mentre le dimensioni delle microbolle coprono la gamma di micron e nanometri, le altre strutture sono in gran parte inferiori a 800 nm 23. Le tecniche di dimensionamento utilizzate non distinguono tra queste varie strutture, e quindi i campioni di microbolle post-agitate (Fase 4.6, Figura 3C) e i campioni di goccioline post-condensate (Fase 4.14, Figura 3F) devono essere assunti come miscele. Gli assemblaggi insensibili agli ultrasuoni (vescicole multilamellari, liposomi e micelle) sono probabilmente conservati dopo la condensazione e non cambieranno dimensione in quanto non hanno nuclei a cambiamento di fase. Poiché il contatore di Coulter non è in grado di distinguere tra questi diversi assemblaggi supramolecolari, lo spostamento delle dimensioni della popolazione dopo la condensazione dovrebbe essere interpretato con l’ipotesi che una parte delle strutture su scala nanometrica siano inconvertibili e contribuiscano alla popolazione osservata in quella regione dimensionale. Inoltre, queste strutture contribuiscono alle firme spettroscopiche e fluorescenti di questi campioni14. Le firme di fluorescenza e assorbanza di micelle, liposomi / vescicole e goccioline sono tutte simili, incluso il loro grado di tempra di fluorescenza14. Pertanto, è importante considerare che esiste una miscela di assiemi nelle figure da 3C a 3F, figura 4, il campione diluito PBS in figura 5e il campione diluito PBS in figura 6.
Dopo la selezione delle dimensioni e prima della condensazione (Fase 4.9), è possibile eliminare gli assemblaggi non a bolle centrifugando il campione di microbolle per separare le bolle galleggianti dagli assemblaggi non galleggianti come descritto da Feshitan et al.21 Il grado di separazione può essere controllato regolando la forza di rotazione e la durata. Tuttavia, esperimenti di condensazione di microbolle di tali campioni isolati in dimensioni hanno rivelato che l’utilizzo delle popolazioni di microbolle precursori più grandi selezionate utilizzando procedure di isolamento delle dimensioni ha prodotto goccioline più grandi (vedere “Altri protocolli e dati” Fase S5 per il dimensionamento post-filato di bolle e goccioline). Poiché un’applicazione prevista di goccioline prodotte con questo protocollo è una piattaforma per lo stravaso passivo e l’accumulo a causa delle loro piccole dimensioni rispetto alle microbolle4,8, sono state desiderate popolazioni di goccioline che sono il più piccole possibile. Pertanto, questo protocollo utilizzava campioni di microbolle post-agitati che non erano isolati per dimensioni tramite centrifugazione, anche se ciò significava che micelle insensibili agli ultrasuoni, liposomi e vescicole erano presenti nella soluzione finale. Ciò implica che le procedure di quantificazione per la biodispressione deriveranno il segnale per tutte le strutture iniettate e non sono limitate alle sole goccioline. Tuttavia, poiché queste strutture di dimensioni simili molto probabilmente si accumulano tramite un meccanismo passivo che è principalmente dettato dalle dimensioni, non si sospetta che ciò dovrebbe cambiare le principali inferenze che possono essere fatte se questa piattaforma deve essere utilizzata in vivo, anche se tutti questi aspetti dovrebbero essere considerati individualmente a seconda del contesto in cui la piattaforma può essere utilizzata. I test che utilizzano bracci sperimentali con e senza ultrasuoni possono essere eseguiti per garantire che siano le goccioline sensibili agli ultrasuoni a essere responsabili di eventuali cambiamenti nella biodis distribuzione, poiché solo gli assemblaggi del nucleo di perfluorocarburi nella soluzione risponderanno agli ultrasuoni.
Dopo l’agitazione, la fiala è stata riposata per 15 minuti ed è stata osservata una partizione nella fiala (Figura 3C contro 3D). La selezione delle dimensioni tramite galleggiabilità è un metodo semplice per eliminare le strutture/bolle più grandi da unasoluzionedi microbolle attivata 8,17. In questo caso, le particelle con diametri superiori a 5 μm sono state per lo più rimosse dopo la selezione delle dimensioni (Figura 4). L’estensione della selezione delle dimensioni può essere regolata controllando la durata della selezione delle dimensioni17. Sheeran et al. hanno dimostrato che la non selezione delle dimensioni può provocare microbolle generate che occludonola vascolarizzazione 8.
I perfluorocarburi hanno il vantaggio di essere biologicamente inerti7. Mentre il punto di ebollizione del decafluorobutano è -1,7 °C, al di sopra della temperatura corporea, le goccioline non vaporizzano immediatamente se esposte a 37 °C (Figura 7B). Poiché le goccioline sono meta-stabili a 37 °C, è necessaria ulteriore energia acustica per vaporizzare le goccioline in microbolle7,9. Poprosky et al. hanno dimostrato goccioline di porfirina condensate tramite pressurizzazione22. Questo è un metodo praticabile e persino essenziale quando si utilizzano perfluorocarburi meno densi, ma le alte pressioni possono distruggere alcune bolle nel processo. L’ottafluoropropano (C3F8) ha un punto di ebollizione di -36,7 ° C, quindi è necessario sia il raffreddamento che la pressurizzazione per la condensazione delle goccioline. Tuttavia, il perfluorocarburo più leggero porta a goccioline meno stabili. Il dodecafluoropentano (C5F12) può portare a goccioline più stabili con un punto di ebollizione di 28 °C. Tuttavia, è un liquido a temperatura ambiente e avrà bisogno di energie acustiche più forti per vaporizzare. Pertanto, la scelta del gas contenente l’agente di contrasto ad ultrasuoni dovrebbe considerare le condizioni della sua applicazione biologica prevista oltre ai parametri della sua fabbricazione. In questo protocollo, il bagno di isopropanolo per condensazione è stato impostato a -15 a -17 °C (Step 4.7.1 e Step 4.13) mentre altri protocolli hanno utilizzato -10 °C 5,6. Anche con un nucleo di decafluorobutano comune, la temperatura di condensazione può variare a seconda della composizione dell’eccipiente, della concentrazione lipidica totale e della composizione del guscio lipidico. Se si utilizzano altre formulazioni, potrebbe essere necessaria un’ottimizzazione per garantire una corretta condensa delle goccioline senza causare il congelamento della soluzione.
Poiché le goccioline sono più piccole e più stabili del loro precursore di microbolle7,possono sfruttare meglio i meccanismi di accumulo passivo per stravasare in alcuni tessuti di interesse, come l’aumento della permeabilità e dell’effetto di ritenzione di alcuni tipi di tumore4,24. Con metodi di rilevamento fluorescenti, otticamente assorbenti e acustici14, è possibile utilizzare una singola formulazione per quantificare l’assorbimento. Inoltre, questa piattaforma può essere utilizzata per indagare se la vaporizzazione acustica delle goccioline può migliorare la frazione dell’agente erogato oltre i livelli passivi16. Per quantificare la biodisponima dell’agente nei tessuti e negli organi di interesse dopo l’iniezione, una quantità nota di goccioline pirolipidiche deve essere iniettata nell’animale, gli ultrasuoni possono o non possono essere applicati a seconda del set di controllo, l’animale deve essere sacrificato un punto temporale pre-specificato e gli organi devono essere rimossi e pesati. Gli organi devono essere omogeneizzati, filtrati, diluiti in tensioattivo (detergente) per decellularizzare il tessuto e quantificati con spettroscopia a fluorescenza o UV-Vis per ottenere percentuali di dose iniettate per massa d’organo in base ai segnali Pyro. Per il passo 5.4.5 (Figura 5) e il passo 5.5.5 (Figura 6), è stato utilizzato il tensioattivo Triton X-100 (detergente) per interrompere i campioni in quanto non è fluorescente a 410 nm e le sue lunghezze d’onda di assorbanza non si sovrappongono a pyro.
Le microbolle non erano caratterizzate da assorbanza UV-Vis. Poiché la sorgente laser dello spettroscopio UV-Vis è parallela al rivelatore, qualsiasi bolla di grandi dimensioni potrebbe disperdere la luce dal rivelatore, facendole apparire più otticamente assorbenti14. A differenza dello spettrofotometro UV-Vis, il rivelatore dello spettrofotometro a fluorescenza è/dovrebbe essere perpendicolare alla sorgente laser per evitare che la sorgente interferisca con il rivelatore. UV-Vis è stato utilizzato per quantificare l’assorbanza dei campioni di goccioline intatti e interrotti (Fase 5.4, Figura 5). Da 300 a 800 nm sono state scelte come lunghezze d’onda di assorbanza in quanto le due principali bande di assorbanza dei piroi lipidi, la banda di Soret (da 340 a 500 nm) e la banda Q (da 640 a 730 nm), rientrano in questo intervallo14. Quando assemblato in una goccia (o in altre strutture supramolecolari), il picco in banda Q del pirolipidio viene spostato verso il rosso da 671 nm a 700 nm (Figura 5). Quando questa struttura supramolecolare viene interrotta da un tensioattivo come Tritone, il picco torna a 671 nm14,15. Sulla base di questo spostamento, è possibile dire se i piro-lipidi sono in uno stato assemblato o in uno stato interrotto. Il rapporto tra i due picchi può essere utilizzato per stimare il decadimento degli assiemi nel tempo.
Per le misure di fluorescenza (Step 5.5, Figura 6), è stata scelta una lunghezza d’onda di eccitazione di 410 nm in quanto corrisponde al picco della banda di Soret per il piro-lipide14non assemblato. È stato selezionato un intervallo di lunghezze d’onda di emissione da 600 a 800 nm poiché i picchi degli assemblaggi intatti in PBS e i pirolipidi interrotti in Triton sono contenuti in questo intervallo. Lo spostamento e l’aumento della fluorescenza (Figura 6) tra i campioni intatti (704 nm in PBS) e interrotti (674 nm in Triton) si sono verificati a causa della tempra indotta dalla struttura. Nella forma assemblata, le molecole piro-lipidiche erano impacchettate strettamente insieme in modo che i fotoni generati fossero assorbiti dalle molecole piro-lipidiche vicine. Ciò è evidente nell’efficienza di spegnimento intatta rispetto a quella interrotta. Pertanto, è necessario diluire i campioni in tensioattivi (detergenti) come 1% Triton X-100 per alleviare la tempra e massimizzare il segnale per la quantificazione della biodistribuendozione14.
Per semplicità, lo stesso trasduttore ad ultrasuoni ad array lineare è stato utilizzato sia per vaporizzare che per l’immagine (Passi 6.5 e 6.7, Figura 7). Questo trasduttore ad ultrasuoni (Table of Materials) era in grado di raggiungere le pressioni negative di picco necessarie per vaporizzare le goccioline8. Riempire un serbatoio con acqua deionizzata da un rubinetto genera gas che si dissolvono nell’acqua (Passo 6.1). Per ridurre al minimo l’interferenza dei gas disciolti nell’acqua con la vaporizzazione e l’imaging, l’acqua è stata riposata per 24 ore nel serbatoio per consentire ai gas nell’acqua di equilibrarsi con l’atmosfera (fase 6.1). In alternativa, l’acqua deionizzata può essere degassata con un contenitore sigillabile di dimensioni sufficientemente dimensionato collegato a un vuoto sufficientemente potente. Le immagini ad ultrasuoni hanno dimostrato che le microbolle sono state condensate con successo poiché le goccioline erano inosservabili / non ecogeniche a basse pressioni (Figura 7B). Fu solo a pressioni di uscita più elevate che le goccioline vaporizzarono in microbolle ecogeniche osservabili (Figura 7D, 7F, 7H). Mentre il campione di goccioline post-condensato contiene micelle e liposomi / vescicole, questi assemblaggi non sono ecogenici e solo le goccioline possono vaporizzare in microbolle ecogeniche. Un controllo PBS è stato fatto scorrere attraverso il fantasma per stabilire immagini di base (Figure 7A, 7C, 7E, 7G). Con l’aumentare della pressione nel PBS, non è stato generato alcun contrasto. Ciò indicava che le alte pressioni del trasduttore non potevano produrre cavitazione spontanea in un mezzo a base d’acqua da solo, e quindi tutti gli altri contrasti generati potevano essere attribuiti all’agente di contrasto ad ultrasuoni impiegato. Se la pressione di uscita è troppo alta, le microbolle generate possono essere distrutte. Aumentando in modo incrementale la pressione e osservando il contrasto generato, la pressione ottimale può essere trovata8. L’emivita di circolazione delle goccioline può essere determinata in modo simile vaporizzando le goccioline sono determinati intervalli di tempo e osservando il contrasto generato nel tempo7.
In sintesi, con il metodo di condensazione sono state create goccioline multimodali a cambiamento di fase con contenuto piro-lipidico variabile. Il dimensionamento ha mostrato che c’era un compromesso tra il carico piro-lipidico e la concentrazione di microbolle / goccioline. Le caratterizzazioni hanno mostrato che c’erano differenze nelle forme intatte e interrotte sia nell’assorbanza che nella fluorescenza. L’imaging ad ultrasuoni ha mostrato che le goccioline non erano ecogeniche a 37 °C ed erano vaporizzabili in microbolle ecogeniche a pressioni sufficienti. Le caratterizzazioni hanno anche mostrato il potenziale delle goccioline piro-lipidiche per sostituire gli agenti diagnostici di accompagnamento per la biodispressione delle goccioline o i test di accumulo. Il lavoro futuro studierà le soglie di vaporizzazione in soluzione, la stabilità in soluzione e le durate di circolazione in vivo nei topi nudi.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Brandon Helfield per aver contribuito a costruire lo scambiatore di gas e il Dr. Miffy Hok Yan Cheng per le discussioni tecniche. Gli autori desiderano ringraziare le seguenti fonti di finanziamento: Ontario Graduate Scholarship, Canadian Institutes of Health Research, Terry Fox Research Institute e Princess Margaret Cancer Foundation.
Materials
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-5000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880220 | Also known as "DSPE-PEG5K" |
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 855775 | Also known as "DSPC" |
| Aluminum Foil | Any brand | ||
| Aluminum Seals, Tear-Off | VWR | 16171-840 | Standard Aluminum, 13 mm outer diameter |
| Bath Sonicator | Any brand | Capable of sonicating and heating up to 70 °C, | |
| Bio-Stor Screw Cap Vials | National Scientific | BS20NABP | Plastic, 2 mL Skirted, with O-ring |
| Borosilicate glass clear serum vials | VWR | 16171-285 | 3 mL, 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter |
| Borosilicate Glass Sample Vial with Phenolic Screw Cap | VWR | 66011-020 | 1.85 mL, Short Form Style, 12 mm outer diameter, 35 mm height, 8-425 cap size |
| Borosilicate Glass Vial with Screw-On cap | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Chloroform | Any brand | ||
| Coulter Counter Elctrolyte Diluent | Any brand | Compatible with Coulter Counter | |
| Decafluorobutane (C4F10) | FluoroMed | 355-25-9 | |
| Deionized Water | Any brand | ||
| Dry Ice (Carbon Dioxide) | Any brand | ||
| Dynamic Light Scattering (DLS) Particle Analyzer | Any brand | Capable of temperature control | |
| E-Z Crimper, 13 mm | Wheaton | W225302 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| E-Z Decapper, 13 mm | Wheaton | W225352 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| Fluorescent Spectrophotometer | Any brand | Capable of 400 to 600 excitation and 300 to 800 nm emission detection, detector perpendicular to laser source | |
| Fluorescent Spectrophotometer Compatible Cuvette | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm, all four sides are optical windows | |
| Gas Exchanger | Made in-house | Refer to Supplementary Information – "Other Protocols and Data" for assembly instructions. | |
| Glass syringes | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| GLWR Custom Aperture Tube 10 um | Beckman Coulter | B42812 | 10 µm aperture, compatible with Beckman Coulter MultiSizer 4e |
| Glycerol | Any brand | ||
| Insulated Styrofaom containers with lids | Any brand | ||
| Isopropanol | Any brand | ||
| Lyophilization-Style Rubber Stoppers | VWR | 71000-060 | 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter, 2-leg, Chlorobutyl |
| Membrane Diaphram Vacuum Pump | Sartorius Stedim | 16694-1-60-06 | Adjustable pressure |
| Metal Tongs | Any brand | ||
| Methanol | Any brand | ||
| MS250 21 MHz Linear Array Ultrasound Transducer | VisualSonics | 21 MHz, Capable of B-mode and non-linear imaging. | |
| MultiSizer 4e | Beckman Coulter | Capable of sizing from 0.2µm to 6 µm | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 567-0010 | Polyethersulfone (PES) membrane, 0.1μm pore size, 1000 mL volume. As Isoton II is non-sterile, can use Filter units multiple times |
| Needles, Conventional | BD | 305176 | 20 gauge, 1.5 inch length |
| Nitrogen Gas | Any brand | Make sure there are regulator valves and tubes to direct the flow. Setup will be dependend on brand and source. | |
| Parafilm | Any brand | Called "wax film" in the protocol. | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Any brand | 1X, 7.4 pH | |
| Pipette | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Pipette Tips | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Plastic Syringes | Any brand | 1 mL, 3 mL, and 30 mL. With Luer Lock connections | |
| Polyethersulfone (PES) Membrane Filter | Any brand | 0.2 µm pore size | |
| Propylene Glycol | Any brand | ||
| Pyropheophorbide conjugated 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Made in-house | Also known as "Pyro-SPC". Refer to "Supplementary Information – Other Protocols and Data" for synthesis. | |
| Thermometer | Any brand | (-20 to 100 °C) | |
| Triton X-100 | Any brand | Also known as "2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol" | |
| Ultrapure Water | Any brand | Type 1 Purity | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer | Any brand | Capable of absorbance from 300 to 800 nm, at least 0.5 nm resolution | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer Compatible Cuvette, 1 cm Path Length | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm | |
| Vacuum Desiccator | Any brand | ||
| Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform | VisualSonics | Pre-clinical ultrasound imaging system | |
| Vialmix | Bristol-Myers-Squibb | Called "mechanical agitator" in the protocol. Agitates for 45 s. | |
| Vortex Mixer | Any brand |
References
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