Captación de pequeñas vesículas extracelulares con marca fluorescente in vitro y en la médula espinal
Summary
Describimos un protocolo para etiquetar pequeñas vesículas extracelulares derivadas de macrófagos con colorantes PKH y observar su captación in vitro y en la médula espinal después del parto intratecal.
Abstract
Las vesículas extracelulares pequeñas (sEV) son vesículas de 50-150 nm secretadas por todas las células y presentes en los fluidos corporales. Los sEV transfieren biomoléculas como ARN, proteínas y lípidos del donante a las células aceptoras, lo que las convierte en mediadores clave de señalización entre las células. En el sistema nervioso central (SNC), los sEV pueden mediar la señalización intercelular, incluidas las interacciones neuroinmunes. Las funciones de sEV se pueden estudiar mediante el seguimiento de la absorción de sEV etiquetados en células receptoras tanto in vitro como in vivo. Este artículo describe el etiquetado de los sEV de los medios acondicionados de las células macrófagos RAW 264.7 utilizando un tinte de membrana PKH. Muestra la captación de diferentes concentraciones de sEVs etiquetados en múltiples puntos de tiempo por células Neuro-2a y astrocitos primarios in vitro. También se muestra la captación de sEV administrados intratecalmente en neuronas de la médula espinal de ratón, astrocitos y microglía visualizados por microscopía confocal. Los resultados representativos demuestran una variación dependiente del tiempo en la absorción de sEV por diferentes células, lo que puede ayudar a confirmar la entrega exitosa de sEV en la médula espinal.
Introduction
Las vesículas extracelulares pequeñas (sEV) son vesículas de tamaño nanométrico derivadas de membranas con un rango de tamaño de 50-150 nm. Se originan a partir de cuerpos multi-vesiculares (MVB) y se liberan de las células tras la fusión de los MVB con la membrana plasmática. Los sEV contienen miRNAs, mRNAs, proteínas y lípidos bioactivos, y estas moléculas se transfieren entre las células en forma de comunicación de célula a célula. Los sEV pueden ser internalizados por las células receptoras por una variedad de vías endocíticas, y esta captura de sEV por las células receptoras está mediada por el reconocimiento de moléculas de superficie tanto en los VE como en las células diana1.
Los sEV han ganado interés debido a su capacidad para desencadenar cambios moleculares y fenotípicos en las células aceptoras, su utilidad como agente terapéutico y su potencial como portadores de moléculas de carga o agentes farmacológicos. Debido a su pequeño tamaño, las imágenes y el seguimiento de los sEV pueden ser un desafío, especialmente para estudios in vivo y entornos clínicos. Por lo tanto, se han desarrollado muchos métodos para etiquetar e imagenar los sEV para ayudar a su biodistribución y seguimiento in vitro e in vivo2.
La técnica más común para estudiar la biodistribución de sEV y las interacciones de las células diana consiste en etiquetarlas con moléculas de colorante fluorescente3,4,5,6,7. Los vehículos eléctricos se etiquetaron inicialmente con tintes de membrana celular que se usaban comúnmente para obtener imágenes de las células. Estos colorantes fluorescentes generalmente tiñen la bicapa lipídica o las proteínas de interés en los sEV. Varios colorantes lipofílicos muestran una fuerte señal fluorescente cuando se incorporan al citosol, incluyendo DiR (1,1′-dioctadecil-3,3,3′,3′-yoduro de tetrametilindotricarbocianina), DiL (1, 1′-dioctadecil-3, 3, 3′, 3′-tetrametil indocarbocianina perclorato) y DiD (1, 1′-dioctadecil-3, 3, 3′, 3′-tetrametil indocarbocianina 4-clorobencenosulfonato de sal)8,9,10,11.
Otros colorantes lipofílicos, como PKH67 y PKH26, tienen un grupo de cabeza polar altamente fluorescente y una larga cola de hidrocarburos alifáticos que se intercala fácilmente en cualquier estructura lipídica y conduce a la retención de colorantes a largo plazo y a una fluorescencia estable12. Los colorantes PKH también pueden etiquetar EV, lo que permite el estudio de las propiedades EV in vivo13. Se han utilizado muchos otros colorantes para observar exosomas utilizando microscopía de fluorescencia y citometría de flujo, incluidos los colorantes de marcación lipídica14 y los colorantes permeables a las células, como el éster de acetato de carboxifluoresceína succinimidil (CFDA-SE)15,16 y el éster de calceína acetoximetil (AM)17.
Los estudios de diafonía mediada por sEV entre diferentes células del SNC han proporcionado información importante sobre la patogénesis de las enfermedades neuroinflamatorias y neurodegenerativas18. Por ejemplo, los sEV de las neuronas pueden propagar péptidos beta-amiloides y proteínas tau fosforilados y ayudar en la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer19. Además, los vehículos eléctricos derivados de los eritrocitos contienen grandes cantidades de alfa-sinucleína y pueden cruzar la barrera hematoencefálica y contribuir a la patología del Parkinson20. La capacidad de los sEV para cruzar barreras fisiológicas21 y transferir sus biomoléculas a las células diana los convierte en herramientas convenientes para administrar fármacos terapéuticos al SNC22.
La visualización de la absorción de sEV por una miríada de células del SNC en la médula espinal permitirá tanto estudios mecanicistas como la evaluación de los beneficios terapéuticos de los sEV administrados exógenamente de diversas fuentes celulares. Este artículo describe la metodología para etiquetar los sEV derivados de macrófagos e imagen de su absorción in vitro e in vivo en la médula espinal lumbar por neuronas, microglía y astrocitos para confirmar cualitativamente la entrega de sEV mediante visualización.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo, mostramos el etiquetado de los sEV con colorantes PKH y la visualización de su captación en la médula espinal. Los colorantes fluorescentes lipofílicos PKH son ampliamente utilizados para el etiquetado de células por citometría de flujo y microscopía fluorescente3,5,6,12,24,25. Debido a su vida media…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por subvenciones de NIH NINDS R01NS102836 y el Departamento de Salud de Pensilvania Commonwealth Universal Research Enhancement (CURE) otorgado a Seena K. Ajit. Agradecemos al Dr. Bradley Nash por la lectura crítica del manuscrito.
Materials
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | MilliporeSigma | Z677094 | |
| Anti-Alix Antibody | Abcam | ab186429 | 1:1000 |
| Anti-Calnexin Antibody | Abcam | Ab10286 | 1:1000 |
| Anti-CD81 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | 1:1000 |
| Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10) | Cell Signaling Technology | 2118 | 1:1000 |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Sigma-Aldrich | MAB360 | 1:500 for IF; 1:1000 for IHC |
| Anti-Iba1 Antibody | Wako | 019-19741 | 1:2000 |
| Anti-MAP2A Antibody | Sigma-Aldrich | MAB378 | 1:500 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332 | |
| Cell Strainer, 40 μm | VWR | 15-1040-1 | |
| Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3118-0050 | 12,000 x g |
| Coverslip, 12-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| Coverslip, 18-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72222-01 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | 1 µg/mL |
| DC Protein Assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse I) | MilliporeSigma | D4513-1VL | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab16284 | 1:10000 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | 1:500 |
| Double Frosted Microscope Slides, #1 | Thermo Scientific | 12-552-5 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum | Gibco | A27208-01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| FluorChem M imaging system | ProteinSimple | ||
| FV3000 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6789 | 1:10000 |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | 1:500 |
| Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-21125 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | VWR | 02-0121 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HRP Substrate | Thermo Scientific | 34094 | |
| Intercept blocking buffer, TBS | LI-COR Biosciences | 927-60001 | |
| Laemmli SDS Sample Buffer | Alfa Aesar | AAJ61337AC | |
| Micro Cover Glass, #1 | VWR | 48404-454 | |
| Microm HM550 | Thermo Scientific | ||
| NanoSight NS300 system | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight NTA 3.2 software | Malvern Panalytical | ||
| Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | NC9597281 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PKH26 | Sigma-Aldrich | MINI26-1KT | |
| PKH67 | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1862209 | |
| PVDF Transfer Membrane | MDI | SVFX8302XXXX101 | |
| RAW 267.4 Cell Line | ATCC | TIB-71 | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Sodium Chloride | AMRESCO | 0241-2.5KG | |
| Superfrost Plus Gold Slides | Thermo Scientific | 15-188-48 | adhesive slides |
| T-75 Flasks | Corning | 431464U | |
| Tecnai 12 Digital Transmission Electron Microscope | FEI Company | ||
| TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FSF300-cu | |
| Tris-Glycine Protein Gel, 12% | Invitrogen | XP00120BOX | |
| Tris-Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC26755 | |
| Tris-Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| TrypLE Express | cell dissociation enzyme | ||
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Trypsin, 0.25% | Corning | 25-053-CL | |
| Tween 20 | |||
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman | 344058 | 110,000 x g |
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