Assorbimento di piccole vescicole extracellulari etichettate fluorescenti in vitro e nel midollo spinale
Summary
Descriviamo un protocollo per etichettare piccole vescicole extracellulari derivate da macrofagi con coloranti PKH e osservarne l’assorbimento in vitro e nel midollo spinale dopo il parto intratecale.
Abstract
Le piccole vescicole extracellulari (sEV) sono vescicole da 50-150 nm secrete da tutte le cellule e presenti nei fluidi corporei. Gli sEV trasferiscono biomolecole come RNA, proteine e lipidi dalle cellule donatrici alle cellule accettori, rendendole mediatori chiave di segnalazione tra le cellule. Nel sistema nervoso centrale (SNC), i sEV possono mediare la segnalazione intercellulare, comprese le interazioni neuroimmune. Le funzioni di sEV possono essere studiate monitorando l’assorbimento di sEV etichettati nelle cellule riceventi sia in vitro che in vivo. Questo documento descrive l’etichettatura dei sEV dai mezzi condizionati delle cellule macrofagiCHE RAW 264.7 utilizzando un colorante a membrana PKH. Mostra l’assorbimento di diverse concentrazioni di sEV etichettati in più punti temporali da parte delle cellule Neuro-2a e degli astrociti primari in vitro. Viene anche mostrato l’assorbimento di sEV somministrati per via intratecale nei neuroni del midollo spinale del topo, negli astrociti e nelle microglia visualizzate mediante microscopia confocale. I risultati rappresentativi dimostrano una variazione dipendente dal tempo nell’assorbimento di sEV da parte di cellule diverse, che può aiutare a confermare il successo della consegna di sEV nel midollo spinale.
Introduction
Le piccole vescicole extracellulari (sEV) sono vescicole nanodimensionate derivate dalla membrana con un intervallo di dimensioni di 50-150 nm. Hanno origine da corpi multi-vescicolari (MVB) e vengono rilasciati dalle cellule dopo la fusione degli MVB con la membrana plasmatica. Gli sEV contengono miRNA, mRNA, proteine e lipidi bioattivi e queste molecole vengono trasferite tra le cellule sotto forma di comunicazione cellula-cellula. Le sEV possono essere internalizzate dalle cellule riceventi attraverso una varietà di vie endocitiche e questa cattura di sEV da parte delle cellule riceventi è mediata dal riconoscimento delle molecole di superficie sia sugli EV che sulle cellule bersaglio1.
I sEV hanno guadagnato interesse grazie alla loro capacità di innescare cambiamenti molecolari e fenotipici nelle cellule accettori, alla loro utilità come agente terapeutico e al loro potenziale come vettori di molecole di carico o agenti farmacologici. A causa delle loro piccole dimensioni, l’imaging e il tracciamento dei sEV possono essere impegnativi, specialmente per gli studi in vivo e le impostazioni cliniche. Pertanto, sono stati sviluppati molti metodi per etichettare e immaginare i sEV per aiutare la loro biodistribuzione e tracciamento in vitro e in vivo2.
La tecnica più comune per studiare la biodistribuzione sEV e le interazioni delle cellule bersaglio prevede l’etichettatura con molecole di colorante fluorescente3,4,5,6,7. I veicoli elettrici sono stati inizialmente etichettati con coloranti a membrana cellulare che erano comunemente usati per l’immagine delle cellule. Questi coloranti fluorescenti generalmente macchiano il doppio strato lipidico o le proteine di interesse sui sEV. Diversi coloranti lipofili mostrano un forte segnale fluorescente quando incorporati nel citosol, tra cui DiR (1,1′-diottadecile-3,3,3′,3′-tetrametilinditricarbocianina ioduro), DiL (1, 1′-diottadecile-3, 3, 3′, 3′-tetrametil indocarbocianina perclorato) e DiD (1, 1′-diottadecile-3, 3, 3′,3′-tetrametil indocarbocianine 4-clorobenzensolfonato sale)8,9,10,11.
Altri coloranti lipofili, come PKH67 e PKH26, hanno un gruppo di testa polare altamente fluorescente e una lunga coda di idrocarburi alifatici che si intercala facilmente in qualsiasi struttura lipidica e porta alla ritenzione del colorante a lungo termine e alla fluorescenza stabile12. I coloranti PKH possono anche etichettare i veicoli elettrici, il che consente lo studio delle proprietà EV in vivo13. Molti altri coloranti sono stati utilizzati per osservare gli esosomi utilizzando la microscopia a fluorescenza e la citometria a flusso, compresi i coloranti per l’etichettatura lipidica14 e coloranti permeabili alle cellule come l’estere succinimidile carbossifluoresceina diacetato (CFDA-SE)15,16 e l’estere acetoximetile (AM) di calceina17.
Studi di crosstalk mediata da sEV tra diverse cellule del SNC hanno fornito importanti approfondimenti sulla patogenesi delle malattie neuroinfiammatorie e neurodegenerative18. Ad esempio, gli sEV dei neuroni possono diffondere peptidi beta-amiloidi e proteine tau fosforilate e aiutare nella patogenesi della malattia di Alzheimer19. Inoltre, gli EV derivati dagli eritrociti contengono grandi quantità di alfa-sinucleina e possono attraversare la barriera emato-encefalica e contribuire alla patologia del Parkinson20. La capacità dei sEV di attraversare le barriere fisiologiche21 e trasferire le loro biomolecole alle cellule bersaglio li rende strumenti convenienti per fornire farmaci terapeutici al SNC22.
La visualizzazione dell’assorbimento di sEV da parte di una miriade di cellule del SNC nel midollo spinale consentirà sia studi meccanicistici che la valutazione dei benefici terapeutici dei sEV somministrati esogenamente da varie fonti cellulari. Questo documento descrive la metodologia per etichettare i sEV derivati dai macrofagi e immaginare il loro assorbimento in vitro e in vivo nel midollo spinale lombare da parte di neuroni, microglia e astrociti per confermare qualitativamente la consegna di sEV mediante visualizzazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, abbiamo mostrato l’etichettatura dei sEV con coloranti PKH e la visualizzazione del loro assorbimento nel midollo spinale. I coloranti fluorescenti lipofili PKH sono ampiamente utilizzati per l’etichettatura delle cellule mediante citometria a flusso e microscopia fluorescente3,5,6,12,24,25. A causa dell…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato supportato da sovvenzioni del NIH NINDS R01NS102836 e del Pennsylvania Department of Health Commonwealth Universal Research Enhancement (CURE) assegnato a Seena K. Ajit. Ringraziamo il Dr. Bradley Nash per la lettura critica del manoscritto.
Materials
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | MilliporeSigma | Z677094 | |
| Anti-Alix Antibody | Abcam | ab186429 | 1:1000 |
| Anti-Calnexin Antibody | Abcam | Ab10286 | 1:1000 |
| Anti-CD81 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | 1:1000 |
| Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10) | Cell Signaling Technology | 2118 | 1:1000 |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Sigma-Aldrich | MAB360 | 1:500 for IF; 1:1000 for IHC |
| Anti-Iba1 Antibody | Wako | 019-19741 | 1:2000 |
| Anti-MAP2A Antibody | Sigma-Aldrich | MAB378 | 1:500 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332 | |
| Cell Strainer, 40 μm | VWR | 15-1040-1 | |
| Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3118-0050 | 12,000 x g |
| Coverslip, 12-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| Coverslip, 18-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72222-01 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | 1 µg/mL |
| DC Protein Assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse I) | MilliporeSigma | D4513-1VL | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab16284 | 1:10000 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | 1:500 |
| Double Frosted Microscope Slides, #1 | Thermo Scientific | 12-552-5 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum | Gibco | A27208-01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| FluorChem M imaging system | ProteinSimple | ||
| FV3000 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6789 | 1:10000 |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | 1:500 |
| Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-21125 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | VWR | 02-0121 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HRP Substrate | Thermo Scientific | 34094 | |
| Intercept blocking buffer, TBS | LI-COR Biosciences | 927-60001 | |
| Laemmli SDS Sample Buffer | Alfa Aesar | AAJ61337AC | |
| Micro Cover Glass, #1 | VWR | 48404-454 | |
| Microm HM550 | Thermo Scientific | ||
| NanoSight NS300 system | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight NTA 3.2 software | Malvern Panalytical | ||
| Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | NC9597281 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PKH26 | Sigma-Aldrich | MINI26-1KT | |
| PKH67 | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1862209 | |
| PVDF Transfer Membrane | MDI | SVFX8302XXXX101 | |
| RAW 267.4 Cell Line | ATCC | TIB-71 | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Sodium Chloride | AMRESCO | 0241-2.5KG | |
| Superfrost Plus Gold Slides | Thermo Scientific | 15-188-48 | adhesive slides |
| T-75 Flasks | Corning | 431464U | |
| Tecnai 12 Digital Transmission Electron Microscope | FEI Company | ||
| TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FSF300-cu | |
| Tris-Glycine Protein Gel, 12% | Invitrogen | XP00120BOX | |
| Tris-Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC26755 | |
| Tris-Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| TrypLE Express | cell dissociation enzyme | ||
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Trypsin, 0.25% | Corning | 25-053-CL | |
| Tween 20 | |||
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman | 344058 | 110,000 x g |
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