Поглощение флуоресцентных меченых малых внеклеточных везикул in vitro и в спинном мозге

Небольшие внеклеточные везикулы (sEV) представляют собой наноразмерные, мембранные везикулы с диапазоном размеров 50-150 нм. Они происходят из многовезикулярных тел (MVB) и высвобождаются из клеток при слиянии MVB с плазматической мембраной. sEV содержат миРНК, мРНК, белки и биологически активные липиды, и эти молекулы переносятся между клетками в форме межклеточной связи. sEV могут быть интернализованы клетками-реципиентами различными эндоцитарными путями, и этот захват sEV клетками-реципиентами опосредован распознаванием поверхностных молекул как на EV, так и на клетках-мишенях^1.

sEV приобрели интерес из-за их способности вызывать молекулярные и фенотипические изменения в акцепторных клетках, их полезности в качестве терапевтического агента и их потенциала в качестве носителей для грузовых молекул или фармакологических агентов. Из-за их небольшого размера визуализация и отслеживание sEV могут быть сложными, особенно для исследований in vivo и клинических условий. Поэтому было разработано много методов для маркировки и изображения sEV, чтобы помочь их биораспределению и отслеживанию in vitro и in vivo^2.

Наиболее распространенный метод изучения биораспределения sEV и взаимодействия клеток-мишеней включает их маркировку флуоресцентными молекулами красителя^3,4,5,6,7. Электромобили были первоначально помечены красителями клеточной мембраны, которые обычно использовались для изображения клеток. Эти флуоресцентные красители обычно окрашивают липидный бислой или белки, представляющие интерес на sEV. Несколько липофильных красителей демонстрируют сильный флуоресцентный сигнал при включении в цитозоль, включая DiR (1,1′-диоктадецил-3,3,3′,3′-тетраметилиндотрикарбоцианин йодид), DiL (1, 1′-диоктадецил-3, 3,3′, 3′-тетраметилиндокарбоцианинперхлорат) и DiD (1, 1′-диоктадецил-3, 3′, 3′-тетраметилиндокарбоцианин 4-хлорбензолсульфонатная соль)^8,9,10,11.

Другие липофильные красители, такие как PKH67 и PKH26, имеют высокофлуоресцентную полярную головную группу и длинный алифатический углеводородный хвост, который легко интеркалируется в любую липидную структуру и приводит к долгосрочному удержанию красителя и стабильной флуоресценции^12. Красители PKH также могут маркировать EV, что позволяет изучать свойства EV in vivo^13. Многие другие красители были использованы для наблюдения экзосом с использованием флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии, включая липидные красители¹⁴ и клеточно-проницаемые красители, такие как карбоксифлуоресцеин диацетат сукцинимидиловый эфир (CFDA-SE)^15,16 и кальцеин ацетоксиметил (AM) эфир^17.

Исследования sEV-опосредованных перекрестных помех между различными клетками в ЦНС дали важную информацию о патогенезе нейровоспалительных и нейродегенеративных заболеваний^18. Например, sEV из нейронов могут распространять бета-амилоидные пептиды и фосфорилированные тау-белки и помогать в патогенезе болезни Альцгеймера^19. Кроме того, EV, полученные из эритроцитов, содержат большое количество альфа-синуклеина и могут пересекать гематоэнцефалический барьер и способствовать патологии Паркинсона^20. Способность sEV пересекать физиологические барьеры²¹ и переносить свои биомолекулы в клетки-мишени делает их удобными инструментами для доставки терапевтических препаратов в ЦНС^22.

Визуализация поглощения сЭВ мириадами клеток ЦНС в спинном мозге позволит как механистические исследования, так и оценить терапевтические преимущества экзогенно вводимых sEV из различных клеточных источников. В данной работе описана методология маркировки sEV, полученных из макрофагов, и изображения их поглощения in vitro и in vivo в поясничном спинном мозге нейронами, микроглией и астроцитами для качественного подтверждения доставки sEV путем визуализации.