Aufnahme fluoreszierender markierter kleiner extrazellulärer Vesikel in vitro und im Rückenmark

Kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs) sind nanogroße, membranbasierte Vesikel mit einem Größenbereich von 50-150 nm. Sie stammen aus multi-vesikulären Körpern (MVBs) und werden bei der Fusion der MVBs mit der Plasmamembran aus Zellen freigesetzt. sEVs enthalten miRNAs, mRNAs, Proteine und bioaktive Lipide, und diese Moleküle werden in Form von Zell-zu-Zell-Kommunikation zwischen Zellen übertragen. sEVs können von Empfängerzellen durch eine Vielzahl von endozytischen Wegen internalisiert werden, und diese Erfassung von sEVs durch Empfängerzellen wird durch die Erkennung von Oberflächenmolekülen sowohl auf EVs als auch auf den Zielzellen^{vermittelt 1}.

sEVs haben aufgrund ihrer Fähigkeit, molekulare und phänotypische Veränderungen in Akzeptorzellen auszulösen, ihres Nutzens als therapeutisches Mittel und ihres Potenzials als Träger für Frachtmoleküle oder pharmakologische Wirkstoffe an Interesse gewonnen. Aufgrund ihrer geringen Größe kann die Bildgebung und Verfolgung von sEVs eine Herausforderung darstellen, insbesondere für In-vivo-Studien und klinische Umgebungen. Daher wurden viele Methoden entwickelt, um sEVs zu kennzeichnen und abbilden, um ihre Bioverteilung und Verfolgung in vitro und in vivo²zu unterstützen.

Die gebräuchlichste Technik zur Untersuchung der sEV-Bioverteilung und der Wechselwirkungen mit Zielzellen besteht^darin,sie mit fluoreszierenden Farbstoffmolekülen^3,4,^5,6,^7zukennzeichnen. EVs wurden zunächst mit Zellmembranfarbstoffen markiert, die üblicherweise zur Abbildung von Zellen verwendet wurden. Diese fluoreszierenden Farbstoffe färben im Allgemeinen die Lipiddoppelschicht oder Proteine von Interesse auf sEVs. Mehrere lipophile Farbstoffe zeigen ein starkes fluoreszierendes Signal, wenn sie in das Zytosol eingebaut werden, darunter DiR (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyaniniodid), DiL (1 ,1′-Dioctadecyl-3, 3,3′, 3′-Tetramethylindocarbocyaninperchlorat) und DiD (1 ,1′-Dioctadecyl-3, 3,3′,3′-Tetramethylindocarbocyanin-4-Chlorbenzolsulfonatsalz)^8,9,10,11.

Andere lipophile Farbstoffe, wie PKH67 und PKH26, haben eine hoch fluoreszierende polare Kopfgruppe und einen langen aliphatischen Kohlenwasserstoffschwanz, der sich leicht in jede Lipidstruktur einfüg und zu einer langfristigen Farbstoffretention und stabilen Fluoreszenz führt¹². PKH-Farbstoffe können auch EVs kennzeichnen, was die Untersuchung der EV-Eigenschaften in vivo¹³ermöglicht. Viele andere Farbstoffe wurden verwendet, um Exosomen mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie zu beobachten, einschließlich Lipidmarkierungsfarbstoffe¹⁴ und zelldurchlässige Farbstoffe wie Carboxyfluoresceindiacetat-Succinimidylester (CFDA-SE)^15,16 und Calceinacetoxymethyl (AM)-Ester^17.

Untersuchungen des sEV-vermittelten Crosstalks zwischen verschiedenen Zellen im ZNS haben wichtige Erkenntnisse über die Pathogenese neuroinflammatoratorischer und neurodegenerativer Erkrankungen geliefert¹⁸. Zum Beispiel können sEVs aus Neuronen Beta-Amyloid-Peptide und phosphorylierte Tau-Proteine verbreiten und bei der Pathogenese der Alzheimer-Krankheit^{helfen 19}. Darüber hinaus enthalten EVs, die aus Erythrozyten gewonnen werden, große Mengen an Alpha-Synuclein und können die Blut-Hirn-Schranke überwinden und zur Parkinson-Pathologie beitragen²⁰. Die Fähigkeit von sEVs, physiologische Barrieren²¹ zu überwinden und ihre Biomoleküle auf Zielzellen zu übertragen, macht sie zu bequemen Werkzeugen, um therapeutische Medikamente an das ZNS²²zu liefern.

Die Visualisierung der sEV-Aufnahme durch unzählige ZNS-Zellen im Rückenmark ermöglicht sowohl mechanistische Studien als auch die Bewertung des therapeutischen Nutzens exogen verabreichter sEVs aus verschiedenen zellulären Quellen. Dieser Artikel beschreibt die Methodik zur Markierung von sEVs, die von Makrophagen abgeleitet sind, und zur Abbildung ihrer Aufnahme in vitro und in vivo im Lendenwirbelmark durch Neuronen, Mikroglia und Astrozyten, um die sEV-Abgabe durch Visualisierung qualitativ zu bestätigen.