蛍光標識小細胞小胞の取り込み と 脊髄における

小細胞外小胞(sEV)は、50〜150nmのサイズ範囲を有するナノサイズの膜由来小胞である。それらはマルチ・シツル体(MVB)に由来し、MVBと原形質膜の融合時に細胞から放出される。sEVは、miRNA、mRNA、タンパク質、および生理活性脂質を含み、これらの分子は細胞間で細胞間通信の形で伝達される。sEVは、さまざまなエンドサイトー経路によってレシピエント細胞によって内部化することができ、そしてこのレシピエント細胞によるsEVの捕捉は、EVと^{標的細胞の}両方の表面分子の認識によって媒介される1。

sEVは、アクセプター細胞の分子および表現型の変化を引き起こす能力、治療剤としての有用性、および貨物分子または薬理学的薬剤のキャリアとしての可能性のために関心を集めています。そのサイズが小さいため、sEvのイメージングとトラッキングは、特に 生体内 研究や臨床現場では困難です。したがって 、vitro および in vivo²でのバイオディストリビューションと追跡を支援するために、多くの方法が開発され、sEVを画像化しています。

sEV生体分布と標的細胞相互作用を研究する最も一般的な技術は、蛍光色素分子^{3、4、5、6、7}でそれらを標識することを含^む。EVは、最初は細胞を画像化するために一般的に使用された細胞膜色素で標識されました。これらの蛍光色素は、一般に、sEv上の目的とする脂質二重層またはタンパク質を染色する。いくつかの親油性染料は、DiR(1,1′-dioctadecyl-3,3,3′、3’テトラメチル酸トリカルボシアニンヨウ化物)、DiL(1、 1′-ジオクタデシル-3,3,3′,3′,3’テトラメチル中カルボシアニン過塩素酸塩)およびDiD(1,1′ジオクタデシル-3,3,3,3-テトラメチルインドカルボシアニン4-クロロベンゼンスルホナテン酸塩^)8,9,10,11.

PKH67やPKH26などの他の親油性染料は、蛍光性の高い極性ヘッド基と、任意の脂質構造に容易に補間し、長期の色素保持および安定な蛍光¹²をもたらす長い脂肪族炭化水素尾を有する。PKH色素はまた、VIVO¹³でEV特性の研究を可能にするEVにラベルを付けることができます。他の多くの色素は、脂質標識染料¹⁴およびカルボキシフルオレセインジアセテートスクシニミジルエステル(CFDA-SE)15、16およびカルセインアセトキシメチル(AM)エステル¹⁷のような細胞透過性染料を含む、蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーを用いてエキソソームを観察するために使用されてきた。

CNSにおける異なる細胞間のsEV媒介性クロストークの研究は、神経炎症性および神経変性疾患の病因に関する重要な洞察を提供した^。例えば、ニューロンからのsEVは、β-アミロイドペプチドおよびリン酸化タウタンパク質を広め、アルツハイマー病¹⁹の病因を助けることができる。さらに、赤血球由来のEVは、大量のα-シヌクレインを含み、血液脳関門を越え、パーキンソン病変²⁰に寄与する。sEVが生理学的障壁²¹ を横断し、生体分子を標的細胞に移す能力は、治療薬をCNS²²に送達するための便利なツールとなる。

脊髄内の無数のCNS細胞によるsEV取り込みの視覚化は、様々な細胞源からの外因的に投与されたSEvの治療上の利点の評価と共に、機械学的研究を可能にする。本論文では、マクロファージ由来のsEvにラベルを付け、ニューロン、ミクログリア、アストロサイトによる腰椎脊髄における インビトロ および インビボで の取り込みを画像化し、可視化によるsEV送達を定性的に確認する方法論を説明する。