Absorção de Vesículos Extracelulares Fluorescentes Em Vitro e na Medula Espinhal
Summary
Descrevemos um protocolo para rotular pequenas vesículas extracelulares derivadas do macrófago com corantes PKH e observar sua absorção in vitro e na medula espinhal após a entrega intratecal.
Abstract
Pequenas vesículas extracelulares (sEVs) são vesículas de 50-150 nm secretadas por todas as células e presentes em fluidos corporais. os sEVs transferem biomoléculas como RNA, proteínas e lipídios de doadores para células aceitadoras, tornando-os os principais mediadores de sinalização entre as células. No sistema nervoso central (SNC), os SEVs podem mediar a sinalização intercelular, incluindo interações neuroimunes. As funções sEV podem ser estudadas rastreando a absorção de sEVs rotulados em células receptoras tanto in vitro quanto in vivo. Este artigo descreve a rotulagem de sEVs da mídia condicionada de células macrófagos RAW 264.7 usando um corante de membrana PKH. Mostra a absorção de diferentes concentrações de SEVs rotulados em vários pontos de tempo por células Neuro-2a e astrócitos primários in vitro. Também é mostrada a absorção de sEVs entregues intrathecally em neurônios da medula espinhal do camundongo, astrócitos e microglia visualizados por microscopia confocal. Os resultados representativos demonstram variação dependente do tempo na absorção de SEVs por diferentes células, o que pode ajudar a confirmar a entrega bem-sucedida de SEVs na medula espinhal.
Introduction
Pequenas vesículas extracelulares (sEVs) são vesículas nanosized, derivadas de membrana com uma faixa de tamanho de 50-150 nm. Eles se originam de corpos multi-vesiculares (MVBs) e são liberados das células após a fusão dos MVBs com a membrana plasmática. os sEVs contêm miRNAs, mRNAs, proteínas e lipídios bioativos, e essas moléculas são transferidas entre células na forma de comunicação célula-celular. os sEVs podem ser internalizados por células receptoras por uma variedade de vias endocíticas, e esta captura de sEVs por células receptoras é mediada pelo reconhecimento de moléculas superficiais em EVs e nas células-alvo1.
os sEVs ganharam interesse devido à sua capacidade de desencadear mudanças moleculares e fenotípicas nas células aceitadoras, sua utilidade como agente terapêutico e seu potencial como portadores de moléculas de carga ou agentes farmacológicos. Devido ao seu pequeno tamanho, a imagem e o rastreamento de SEVs podem ser desafiadores, especialmente para estudos in vivo e configurações clínicas. Portanto, muitos métodos foram desenvolvidos para rotular e imagem sEVs para auxiliar sua biodistribução e rastreamento in vitro e in vivo2.
A técnica mais comum para estudar a biodistribução sEV e as interações celulares-alvo envolve rotulá-las com moléculas de corante fluorescente3,4,5,6,7. Os EVs foram inicialmente rotulados com corantes de membrana celular que eram comumente usados para células de imagem. Esses corantes fluorescentes geralmente mancham a bicamadas lipídica ou proteínas de interesse em sEVs. Vários corantes lipofílicos apresentam um forte sinal fluorescente quando incorporados ao citosol, incluindo DiR (1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyanine iodide), DiL (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetramethyl indocarbocyanine perclorato), e DiD (1, 1′-dioctadecyl-3, 3,3′, 3′-tetrametiletotototo 4-clorobenzenesulfonato sal)8,9,10,11.
Outros corantes lipofílicos, como PKH67 e PKH26, têm um grupo de cabeça polar altamente fluorescente e uma longa cauda de hidrocarboneto alifático que facilmente se intercala em qualquer estrutura lipídica e leva à retenção de corantes a longo prazo e fluorescência estável12. Os corantes PKH também podem rotular EVs, o que permite o estudo de propriedades EV in vivo13. Muitos outros corantes têm sido usados para observar exosomos usando microscopia de fluorescência e citometria de fluxo, incluindo corantes de rotulagem lipídica14 e corantes permeáveis de células, como carboxyfluorescein diacetate éster succinimidyl (CFDA-SE)15,16 e acetoximilo de calceina (AM) ester17.
Estudos de crosstalk mediado pelo SEV entre diferentes células do CNS forneceram insights importantes sobre a patogênese das doenças neuroinflamatórias e neurodegenerativas18. Por exemplo, sEVs de neurônios podem espalhar peptídeos beta-amilóides e proteínas tau fosforiladas e ajudar na patogênese da doença de Alzheimer19. Além disso, os EVs derivados de eritrócitos contêm grandes quantidades de alfa-sinucleína e podem atravessar a barreira hemenceroencefálica e contribuir para a patologia de Parkinson20. A capacidade dos SEVs de atravessar barreiras fisiológicas21 e transferir suas biomoléculas para células-alvo torna-as ferramentas convenientes para fornecer medicamentos terapêuticos ao CNS22.
O visualização da absorção do SEV por inúmeras células CNS na medula espinhal permitirá tanto estudos mecanicistas quanto a avaliação dos benefícios terapêuticos de SEVs exogenoumente administrados de várias fontes celulares. Este artigo descreve a metodologia de rotular sEVs derivados de macrófagos e imaginar sua absorção in vitro e in vivo na medula espinhal lombar por neurônios, microglia e astrócitos para confirmar qualitativamente a entrega do SEV por visualização.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, mostramos a rotulagem de sEVs com corantes PKH e a visualização de sua absorção na medula espinhal. Os corantes fluorescentes lipofílicos PKH são amplamente utilizados para rotulagem de células por citometria de fluxo e microscopia fluorescente3,5,6,12,24,25. Devido à sua meia-vida relativamente longa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado por subsídios do NIH NINDS R01NS102836 e do Departamento de Saúde da Pensilvânia Universal Research Enhancement (CURE) concedidos a Seena K. Ajit. Agradecemos ao Dr. Bradley Nash pela leitura crítica do manuscrito.
Materials
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | MilliporeSigma | Z677094 | |
| Anti-Alix Antibody | Abcam | ab186429 | 1:1000 |
| Anti-Calnexin Antibody | Abcam | Ab10286 | 1:1000 |
| Anti-CD81 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | 1:1000 |
| Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10) | Cell Signaling Technology | 2118 | 1:1000 |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Sigma-Aldrich | MAB360 | 1:500 for IF; 1:1000 for IHC |
| Anti-Iba1 Antibody | Wako | 019-19741 | 1:2000 |
| Anti-MAP2A Antibody | Sigma-Aldrich | MAB378 | 1:500 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332 | |
| Cell Strainer, 40 μm | VWR | 15-1040-1 | |
| Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3118-0050 | 12,000 x g |
| Coverslip, 12-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| Coverslip, 18-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72222-01 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | 1 µg/mL |
| DC Protein Assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse I) | MilliporeSigma | D4513-1VL | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab16284 | 1:10000 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | 1:500 |
| Double Frosted Microscope Slides, #1 | Thermo Scientific | 12-552-5 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum | Gibco | A27208-01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| FluorChem M imaging system | ProteinSimple | ||
| FV3000 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6789 | 1:10000 |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | 1:500 |
| Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-21125 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | VWR | 02-0121 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HRP Substrate | Thermo Scientific | 34094 | |
| Intercept blocking buffer, TBS | LI-COR Biosciences | 927-60001 | |
| Laemmli SDS Sample Buffer | Alfa Aesar | AAJ61337AC | |
| Micro Cover Glass, #1 | VWR | 48404-454 | |
| Microm HM550 | Thermo Scientific | ||
| NanoSight NS300 system | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight NTA 3.2 software | Malvern Panalytical | ||
| Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | NC9597281 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PKH26 | Sigma-Aldrich | MINI26-1KT | |
| PKH67 | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1862209 | |
| PVDF Transfer Membrane | MDI | SVFX8302XXXX101 | |
| RAW 267.4 Cell Line | ATCC | TIB-71 | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Sodium Chloride | AMRESCO | 0241-2.5KG | |
| Superfrost Plus Gold Slides | Thermo Scientific | 15-188-48 | adhesive slides |
| T-75 Flasks | Corning | 431464U | |
| Tecnai 12 Digital Transmission Electron Microscope | FEI Company | ||
| TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FSF300-cu | |
| Tris-Glycine Protein Gel, 12% | Invitrogen | XP00120BOX | |
| Tris-Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC26755 | |
| Tris-Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| TrypLE Express | cell dissociation enzyme | ||
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Trypsin, 0.25% | Corning | 25-053-CL | |
| Tween 20 | |||
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman | 344058 | 110,000 x g |
References
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).
- Betzer, O., et al. Advances in imaging strategies for in vivo tracking of exosomes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 12 (2), 1594 (2020).
- Dehghani, M., Gaborski, T. R. Fluorescent labeling of extracellular vesicles. Methods in Enzymology. 645, 15-42 (2020).
- González, M. I., et al. Covalently labeled fluorescent exosomes for in vitro and in vivo applications. Biomedicines. 9 (1), 81 (2021).
- Chuo, S. T. -. Y., Chien, J. C. -. Y., Lai, C. P. -. K. Imaging extracellular vesicles: current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 91 (2018).
- vander Vlist, E. J., Nolte-‘tHoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Heinrich, L., et al. Confocal laser scanning microscopy using dialkylcarbocyanine dyes for cell tracing in hard and soft biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 81 (1), 153-161 (2007).
- Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson’s disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
- Grange, C., et al. Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a model of acute kidney injury monitored by optical imaging. International Journal of Molecular Medicine. 33 (5), 1055-1063 (2014).
- Wiklander, O. P., et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26316 (2015).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6 (1), 7029 (2015).
- Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Escrevente, C., Keller, S., Altevogt, P., Costa, J. Interaction and uptake of exosomes by ovarian cancer cells. BMC Cancer. 11, 108 (2011).
- Cho, E., et al. Comparison of exosomes and ferritin protein nanocages for the delivery of membrane protein therapeutics. Journal of Controlled Release. 279, 326-335 (2018).
- Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host & Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
- Porro, C., Trotta, T., Panaro, M. A. Microvesicles in the brain: Biomarker, messenger or mediator. Journal of Neuroimmunology. 288, 70-78 (2015).
- De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications. Frontiers in Immunology. 6, 203 (2015).
- Matsumoto, J., et al. Transmission of alpha-synuclein-containing erythrocyte-derived extracellular vesicles across the blood-brain barrier via adsorptive mediated transcytosis: another mechanism for initiation and progression of Parkinson’s disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 71 (2017).
- Matsumoto, J., Stewart, T., Banks, W. A., Zhang, J. The transport mechanism of extracellular vesicles at the blood-brain barrier. Current Pharmaceutical Design. 23 (40), 6206-6214 (2017).
- Shaimardanova, A., et al. Extracellular vesicles in the diagnosis and treatment of central nervous system diseases. Neural Regeneration Research. 15 (4), 586-596 (2020).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Hoen, E. N. M. N. -. t., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Gangadaran, P., Hong, C. M., Ahn, B. -. C. An update on in vivo imaging of extracellular vesicles as drug delivery vehicles. Frontiers in Pharmacology. 9, 169 (2018).
- Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: the migration of PKH-labeled lymphocytes. Cellular Immunology. 134 (1), 157-170 (1991).
- Kuffler, D. P. Long-term survival and sprouting in culture by motoneurons isolated from the spinal cord of adult frogs. Journal of Comparative Neurology. 302 (4), 729-738 (1990).
- Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
- Pužar Dominkuš, P., et al. PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1860 (6), 1350-1361 (2018).
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).
- Shimomura, T., et al. New lipophilic fluorescent dyes for labeling extracellular vesicles: characterization and monitoring of cellular uptake. Bioconjugate Chemistry. 32 (4), 680-684 (2021).
- Yuan, D., et al. Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain. Biomaterials. 142, 1-12 (2017).
- Polanco, J. C., Li, C., Durisic, N., Sullivan, R., Götz, J. Exosomes taken up by neurons hijack the endosomal pathway to spread to interconnected neurons. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 10 (2018).
- Jurgielewicz, B. J., Yao, Y., Stice, S. L. Kinetics and specificity of HEK293T extracellular vesicle uptake using imaging flow cytometry. Nanoscale Research Letters. 15 (1), 170 (2020).
