Absorption de petites vésicules extracellulaires étiquetées par fluorescence in vitro et dans la moelle épinière

Les petites vésicules extracellulaires (sEV) sont des vésicules nanométriques dérivées de membranes d’une taille comprise entre 50 et 150 nm. Ils proviennent de corps multivésiculaires (M MVB) et sont libérés par les cellules lors de la fusion des M MVB avec la membrane plasmique. Les sEV contiennent des miARN, des ARNm, des protéines et des lipides bioactifs, et ces molécules sont transférées entre les cellules sous forme de communication de cellule à cellule. Les sEV peuvent être internalisés par les cellules réceptrices par une variété de voies endocytaires, et cette capture des sEV par les cellules réceptrices est médiée par la reconnaissance de molécules de surface sur les VE et les cellules cibles¹.

Les sEV ont gagné en intérêt en raison de leur capacité à déclencher des changements moléculaires et phénotypiques dans les cellules acceptrices, de leur utilité en tant qu’agent thérapeutique et de leur potentiel en tant que transporteurs de molécules de cargaison ou d’agents pharmacologiques. En raison de leur petite taille, l’imagerie et le suivi des VES peuvent être difficiles, en particulier pour les études in vivo et les contextes cliniques. Par conséquent, de nombreuses méthodes ont été développées pour étiqueter et imager les sEV afin d’aider leur biodistribution et leur suivi in vitro et in vivo².

La technique la plus courante pour étudier la biodistribution sEV et les interactions cellulaires cibles consiste à les étiqueter avec des molécules de colorant fluorescent^3,4,5,6,7. Les VÉHICULES électriques ont d’abord été marqués avec des colorants à membrane cellulaire couramment utilisés pour imager les cellules. Ces colorants fluorescents colorent généralement la bicouche lipidique ou les protéines d’intérêt sur les sEV. Plusieurs colorants lipophiles présentent un fort signal fluorescent lorsqu’ils sont incorporés dans le cytosol, notamment diR (1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-iodure de tétraméthyindotricarbocyanine), DiL (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′,3′-tétraméthyl indocarbocyanine perchlorate) et DiD (1, 1′-dioctadécyyl-3, 3, 3′-tétraméthyl indocarbocyanine 4-chlorobenzènesulfonate sel)^8,9,10,11.

D’autres colorants lipophiles, tels que PKH67 et PKH26, ont un groupe de tête polaire hautement fluorescent et une longue queue d’hydrocarbure aliphatique qui s’intercale facilement dans n’importe quelle structure lipidique et conduit à une rétention de colorant à long terme et à une fluorescence stable¹². Les colorants PKH peuvent également étiqueter les véhicules électriques, ce qui permet d’étudier les propriétés des véhicules électriques in vivo^13. De nombreux autres colorants ont été utilisés pour observer les exosomes en utilisant la microscopie à fluorescence et la cytométrie en flux, y compris les colorants de marquage des lipides¹⁴ et les colorants perméables aux cellules tels que l’ester de diacétate de carboxyfluorescéine succinimidyle (CFDA-SE)^15,16 et l’ester d’acétoxyméthyl (AM) de calcéine^17.

Des études sur la diaphonie médiée par le SEV entre différentes cellules du SNC ont fourni des informations importantes sur la pathogenèse des maladies neuroinflammatoires et neurodégénératives¹⁸. Par exemple, les sEV des neurones peuvent propager des peptides bêta-amyloïdes et des protéines tau phosphorylées et aider à la pathogenèse de la maladie d’Alzheimer¹⁹. De plus, les VE dérivés des érythrocytes contiennent de grandes quantités d’alpha-synucléine et peuvent traverser la barrière hémato-encéphalique et contribuer à la pathologie de Parkinson²⁰. La capacité des sEV à franchir les barrières physiologiques²¹ et à transférer leurs biomolécules aux cellules cibles en fait des outils pratiques pour délivrer des médicaments thérapeutiques au^{SNC 22.}

La visualisation de l’absorption de sEV par une myriade de cellules du SNC dans la moelle épinière permettra à la fois des études mécanistes et l’évaluation des avantages thérapeutiques des sEV administrés de manière exogène à partir de diverses sources cellulaires. Cet article décrit la méthodologie pour étiqueter les sEV dérivés de macrophages et imager leur absorption in vitro et in vivo dans la moelle épinière lombaire par les neurones, les microglies et les astrocytes afin de confirmer qualitativement l’administration de sEV par visualisation.