ספיגת של שלל פלואורסצנטי שכותרתו שלשלות חוץ תאיות קטנות במבחנה ובחוט השדרה
Summary
אנו מתארים פרוטוקול לתיוג שלטי מקרופאג’ קטנים חוץ-תאיים עם צבעי PKH ומתבוננים בקליטתם במבחנה ובחוט השדרה לאחר הלידה התוך-תאית.
Abstract
שלל חוץ-תאי קטן (sEVs) הם שלל 50-150 ננומטר המופרש על ידי כל התאים ונוכח בנוזלי גוף. sEVs מעבירים ביומולקולים כגון RNA, חלבונים ושומנים מתורם לתאים מקבלים, מה שהופך אותם למתווכים מרכזיים בין תאים. במערכת העצבים המרכזית (מערכת העצבים המרכזית), sEVs יכול לתווך איתות בין תאי, כולל אינטראקציות נוירואימוניות. פונקציות sEV ניתן ללמוד על ידי מעקב אחר ספיגת sEVs מסומן בתאי הנמען הן במבחנה והן ב- vivo. מאמר זה מתאר את התיוג של sEVs מהמדיה המותנית של תאי מקרופאגים RAW 264.7 באמצעות צבע קרום PKH. זה מראה את ספיגת ריכוזים שונים של sEVs מסומן בנקודות זמן מרובות על ידי תאי Neuro-2a אסטרוציטים ראשוניים במבחנה. כמו כן מוצגת ספיגת SEVs המועברת באופן תוך-רחמי בנוירונים של חוט השדרה של העכבר, אסטרוציטים ומיקרוגליה המודגמים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. התוצאות הייצוגיות מדגימות שונות תלוית זמן בספיגת ה- SEVs על ידי תאים שונים, אשר יכול לעזור לאשר מסירת SEVs מוצלחת לחוט השדרה.
Introduction
שלל חוץ-תאי קטן (sEVs) הם שלטי ננו-ממברנה שמקורם בממברנה עם טווח גודל של 50-150 ננומטר. מקורם בגופים רב-דרכים (MVBs) ומשוחררים מתאים עם היתוך ה-MVBs עם קרום הפלזמה. sEVs מכילים miRNAs, mRNAs, חלבונים, שומנים ביואקטיביים, ומולקולות אלה מועברות בין תאים בצורה של תקשורת בין תא לתא. sEVs יכול להיות מופנמ על ידי תאי הנמען על ידי מגוון של מסלולים אנדוציטיים, ו לכידה זו של sEVs על ידי תאי הנמען מתווכת על ידי זיהוי של מולקולות פני השטח הן על כלי עבודה והן על תאי היעד1.
sEVs צברו עניין בשל יכולתם לעורר שינויים מולקולריים ופנוטיפיים בתאים המקובלים, התועלת שלהם כסוכן טיפולי, ואת הפוטנציאל שלהם כמו נשאים עבור מולקולות מטען או סוכנים פרמקולוגיים. בשל גודלם הקטן, ההדמיה והמעקב אחר SEVs יכולים להיות מאתגרים, במיוחד עבור מחקרי vivo והגדרות קליניות. לכן, פותחו שיטות רבות לתיוג ותמונה sEVs כדי לסייע biodistribution ומעקב במבחנה ו in vivo2.
הטכניקה הנפוצה ביותר לחקר ייחוס ביולוגי של sEV ואינטראקציות בין תאי יעד כוללת תיוג אותם עם מולקולות צבע פלואורסצנטי3,4,5,6,7. EVs סומנו בתחילה עם צבעי קרום התא ששימשו בדרך כלל לתאי תמונה. צבעים פלואורסצנטיים אלה מכתימים בדרך כלל את דו-שכבתי השומנים או חלבונים מעניינים על SEVs. מספר צבעים ליפופיליים מציגים אות פלואורסצנטי חזק כאשר הם משולבים בציטוסול, כולל DiR (1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyanine יוד), DiL (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetramethyl indocarbocyanine perchlorate), ו- DiD (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetramethyl indocarbocyanine 4-כלורובצנסולפונט מלח)8,9,10,11.
צבעים ליפופיליים אחרים, כגון PKH67 ו- PKH26, יש קבוצת ראש קוטב פלואורסצנטית מאוד וזנב פחמימנים אליפטי ארוך כי בקלות intercalate לתוך כל מבנה שומנים ומוביל שימור צבע לטווח ארוך פלואורסצנטיותיציבה 12. צבעי PKH יכולים גם לתייג EVs, המאפשר את המחקר של תכונות EV ב vivo13. צבעים רבים אחרים שימשו לצפייה אקסוזומים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וציטומטריית זרימה, כולל צבעי תיוג שומנים14 וצבעים חדירים לתא כגון carboxyfluorescein diacetate succinimidyl אסתר (CFDA-SE)15,16 ו קלצ’ין אצטטוקסימתיל (AM) אסתר17.
מחקרים של sEV בתיווך צולב בין תאים שונים במערכת ן סיפקו תובנות חשובות על הפתוגנזה של מחלות נוירו-דליקות ונוירודגנרטיביות18. לדוגמה, SEVs מתאי עצב יכולים להפיץ פפטידים בטא עמילואיד וחלבוני טאו זרחן ולסייע בפתוגנזה של מחלתאלצהיימר 19. בנוסף, כלי עבודה אלקטרוניים הנגזרים אריתרוציטים מכילים כמויות גדולות של אלפא-סינוקלין ויכולים לחצות את מחסום הדם – מוח ולתרום לפתולוגיה של פרקינסון20. היכולת של SEVs לחצות מחסומים פיזיולוגיים21 ולהעביר biomolecules שלהם לתאי היעד עושה להם כלים נוחים כדי לספק תרופות טיפוליות ל- CNS22.
הדמיית ספיגת SEV על ידי תאי CNS רבים בחוט השדרה תאפשר הן מחקרים מכניים והן הערכת היתרונות הטיפוליים של SEV מנוהל אקסוגני ממקורות תאיים שונים. מאמר זה מתאר את המתודולוגיה לתייג SEVs הנגזר מקרופאגים ולדמיין את ספיגתם במבחנה וב- vivo בחוט השדרה המותני על ידי נוירונים, מיקרוגליה ואסטרוציטים כדי לאשר באופן איכותי את מסירת SEV על ידי הדמיה.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול זה, הראינו את התיוג של SEVs עם צבעי PKH ואת ההדמיה של ספיגתם בחוט השדרה. PKH צבעי פלואורסצנטית ליפופילית נמצאים בשימוש נרחב לתיוג תאים על ידי ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית3,5,6,12,24,<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מ NIH NINDS R01NS102836 ואת מחלקת הבריאות של חבר העמים הבריטי אוניברסלי שיפור מחקר (CURE) הוענק Seena ק אג’יט. אנו מודים לד”ר בראדלי נאש על הקריאה הביקורתית של כתב היד.
Materials
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | MilliporeSigma | Z677094 | |
| Anti-Alix Antibody | Abcam | ab186429 | 1:1000 |
| Anti-Calnexin Antibody | Abcam | Ab10286 | 1:1000 |
| Anti-CD81 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | 1:1000 |
| Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10) | Cell Signaling Technology | 2118 | 1:1000 |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Sigma-Aldrich | MAB360 | 1:500 for IF; 1:1000 for IHC |
| Anti-Iba1 Antibody | Wako | 019-19741 | 1:2000 |
| Anti-MAP2A Antibody | Sigma-Aldrich | MAB378 | 1:500 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332 | |
| Cell Strainer, 40 μm | VWR | 15-1040-1 | |
| Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3118-0050 | 12,000 x g |
| Coverslip, 12-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| Coverslip, 18-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72222-01 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | 1 µg/mL |
| DC Protein Assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse I) | MilliporeSigma | D4513-1VL | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab16284 | 1:10000 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | 1:500 |
| Double Frosted Microscope Slides, #1 | Thermo Scientific | 12-552-5 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum | Gibco | A27208-01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| FluorChem M imaging system | ProteinSimple | ||
| FV3000 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6789 | 1:10000 |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | 1:500 |
| Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-21125 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | VWR | 02-0121 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HRP Substrate | Thermo Scientific | 34094 | |
| Intercept blocking buffer, TBS | LI-COR Biosciences | 927-60001 | |
| Laemmli SDS Sample Buffer | Alfa Aesar | AAJ61337AC | |
| Micro Cover Glass, #1 | VWR | 48404-454 | |
| Microm HM550 | Thermo Scientific | ||
| NanoSight NS300 system | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight NTA 3.2 software | Malvern Panalytical | ||
| Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | NC9597281 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PKH26 | Sigma-Aldrich | MINI26-1KT | |
| PKH67 | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1862209 | |
| PVDF Transfer Membrane | MDI | SVFX8302XXXX101 | |
| RAW 267.4 Cell Line | ATCC | TIB-71 | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Sodium Chloride | AMRESCO | 0241-2.5KG | |
| Superfrost Plus Gold Slides | Thermo Scientific | 15-188-48 | adhesive slides |
| T-75 Flasks | Corning | 431464U | |
| Tecnai 12 Digital Transmission Electron Microscope | FEI Company | ||
| TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FSF300-cu | |
| Tris-Glycine Protein Gel, 12% | Invitrogen | XP00120BOX | |
| Tris-Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC26755 | |
| Tris-Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| TrypLE Express | cell dissociation enzyme | ||
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Trypsin, 0.25% | Corning | 25-053-CL | |
| Tween 20 | |||
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman | 344058 | 110,000 x g |
References
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).
- Betzer, O., et al. Advances in imaging strategies for in vivo tracking of exosomes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 12 (2), 1594 (2020).
- Dehghani, M., Gaborski, T. R. Fluorescent labeling of extracellular vesicles. Methods in Enzymology. 645, 15-42 (2020).
- González, M. I., et al. Covalently labeled fluorescent exosomes for in vitro and in vivo applications. Biomedicines. 9 (1), 81 (2021).
- Chuo, S. T. -. Y., Chien, J. C. -. Y., Lai, C. P. -. K. Imaging extracellular vesicles: current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 91 (2018).
- vander Vlist, E. J., Nolte-‘tHoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Heinrich, L., et al. Confocal laser scanning microscopy using dialkylcarbocyanine dyes for cell tracing in hard and soft biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 81 (1), 153-161 (2007).
- Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson’s disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
- Grange, C., et al. Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a model of acute kidney injury monitored by optical imaging. International Journal of Molecular Medicine. 33 (5), 1055-1063 (2014).
- Wiklander, O. P., et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26316 (2015).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6 (1), 7029 (2015).
- Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Escrevente, C., Keller, S., Altevogt, P., Costa, J. Interaction and uptake of exosomes by ovarian cancer cells. BMC Cancer. 11, 108 (2011).
- Cho, E., et al. Comparison of exosomes and ferritin protein nanocages for the delivery of membrane protein therapeutics. Journal of Controlled Release. 279, 326-335 (2018).
- Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host & Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
- Porro, C., Trotta, T., Panaro, M. A. Microvesicles in the brain: Biomarker, messenger or mediator. Journal of Neuroimmunology. 288, 70-78 (2015).
- De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications. Frontiers in Immunology. 6, 203 (2015).
- Matsumoto, J., et al. Transmission of alpha-synuclein-containing erythrocyte-derived extracellular vesicles across the blood-brain barrier via adsorptive mediated transcytosis: another mechanism for initiation and progression of Parkinson’s disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 71 (2017).
- Matsumoto, J., Stewart, T., Banks, W. A., Zhang, J. The transport mechanism of extracellular vesicles at the blood-brain barrier. Current Pharmaceutical Design. 23 (40), 6206-6214 (2017).
- Shaimardanova, A., et al. Extracellular vesicles in the diagnosis and treatment of central nervous system diseases. Neural Regeneration Research. 15 (4), 586-596 (2020).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Hoen, E. N. M. N. -. t., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Gangadaran, P., Hong, C. M., Ahn, B. -. C. An update on in vivo imaging of extracellular vesicles as drug delivery vehicles. Frontiers in Pharmacology. 9, 169 (2018).
- Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: the migration of PKH-labeled lymphocytes. Cellular Immunology. 134 (1), 157-170 (1991).
- Kuffler, D. P. Long-term survival and sprouting in culture by motoneurons isolated from the spinal cord of adult frogs. Journal of Comparative Neurology. 302 (4), 729-738 (1990).
- Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
- Pužar Dominkuš, P., et al. PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1860 (6), 1350-1361 (2018).
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).
- Shimomura, T., et al. New lipophilic fluorescent dyes for labeling extracellular vesicles: characterization and monitoring of cellular uptake. Bioconjugate Chemistry. 32 (4), 680-684 (2021).
- Yuan, D., et al. Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain. Biomaterials. 142, 1-12 (2017).
- Polanco, J. C., Li, C., Durisic, N., Sullivan, R., Götz, J. Exosomes taken up by neurons hijack the endosomal pathway to spread to interconnected neurons. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 10 (2018).
- Jurgielewicz, B. J., Yao, Y., Stice, S. L. Kinetics and specificity of HEK293T extracellular vesicle uptake using imaging flow cytometry. Nanoscale Research Letters. 15 (1), 170 (2020).
