Opname van fluorescerende gelabelde kleine extracellulaire blaasjes in vitro en in het ruggenmerg

Kleine extracellulaire blaasjes (sEV’s) zijn nanosized, van membraan afgeleide blaasjes met een groottebereik van 50-150 nm. Ze zijn afkomstig van multi-vesiculaire lichamen (MVP’s) en komen vrij uit cellen bij fusie van de MVP’s met het plasmamembraan. sEV’s bevatten miRNA’s, mRNA’s, eiwitten en bioactieve lipiden, en deze moleculen worden overgedragen tussen cellen in de vorm van cel-naar-cel communicatie. sEV’s kunnen worden geïnternaliseerd door ontvangende cellen door een verscheidenheid aan endocytische routes, en deze vangst van sEV’s door ontvangende cellen wordt gemedieerd door de herkenning van oppervlaktemoleculen op zowel EV’s als de doelcellen¹.

sEV’s hebben belangstelling gekregen vanwege hun vermogen om moleculaire en fenotypische veranderingen in acceptorcellen te veroorzaken, hun nut als therapeutisch middel en hun potentieel als dragers voor vrachtmoleculen of farmacologische agentia. Vanwege hun kleine formaat kan het afbeelden en volgen van sEV’s een uitdaging zijn, vooral voor in vivo studies en klinische omgevingen. Daarom zijn er veel methoden ontwikkeld om sEV’s te labelen en inbeeld te brengen om hun biodistributie en tracking in vitro en in vivo te ondersteunen².

De meest voorkomende techniek om sEV-biodistributie en doelcelinteracties te bestuderen, omvat het labelen ervan met fluorescerende kleurstofmoleculen^3,4,5,6,7. EV’s werden aanvankelijk gelabeld met celmembraankleurstoffen die vaak werden gebruikt om cellen in beeld te brengen. Deze fluorescerende kleurstoffen kleuren over het algemeen de lipide dubbellaag of eiwitten van belang op sEV’s. Verschillende lipofiele kleurstoffen vertonen een sterk fluorescerend signaal wanneer ze in het cytosol worden opgenomen, waaronder DiR (1,1′-dioctadecyl-3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyaninejodide), DiL (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetramethyl indocarbocyanineperchloraat) en DiD (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetramethylindocarbocyanine 4-chloorbenzenesulfonaatzout)^8,9,10,11.

Andere lipofiele kleurstoffen, zoals PKH67 en PKH26, hebben een zeer fluorescerende polaire kopgroep en een lange alifatische koolwaterstofstaart die gemakkelijk intercaleert in elke lipidestructuur en leidt tot langdurige kleurstofretentie en stabiele fluorescentie¹². PKH-kleurstoffen kunnen ook EV’s labelen, waardoor ev-eigenschappen in vivo kunnen wordenbestudeerd¹³. Veel andere kleurstoffen zijn gebruikt om exosomen te observeren met behulp van fluorescentiemicroscopie en flowcytometrie, waaronder lipide-labelende kleurstoffen¹⁴ en celdoorlatende kleurstoffen zoals carboxyfluoresceïnediacetaat succinimidylester (CFDA-SE)^15,16 en calceïne acetoxymethyl (AM) ester¹⁷.

Studies van sEV-gemedieerde kruisverwijzing tussen verschillende cellen in het CZS hebben belangrijke inzichten opgeleverd over de pathogenese van neuro-inflammatoire en neurodegeneratieve ziekten¹⁸. SEV’s van neuronen kunnen bijvoorbeeld bèta-amyloïde peptiden en gefosforyleerde tau-eiwitten verspreiden en helpen bij de pathogenese van de ziekte van Alzheimer¹⁹. Bovendien bevatten EV’s afgeleid van erytrocyten grote hoeveelheden alfa-synucleïne en kunnen ze de bloed-hersenbarrière passeren en bijdragen aan de pathologie van Parkinson²⁰. Het vermogen van sEV’s om fysiologische barrières²¹ te overschrijden en hun biomoleculen over te brengen naar doelcellen maakt ze handige hulpmiddelen om therapeutische geneesmiddelen aan het CZS te leveren²².

Het visualiseren van sEV-opname door talloze CZS-cellen in het ruggenmerg zal zowel mechanistische studies als de evaluatie van de therapeutische voordelen van exogene toegediende sEV’s uit verschillende cellulaire bronnen mogelijk maken. Dit artikel beschrijft de methodologie om sEV’s afgeleid van macrofagen te labelen en hun opname in vitro en in vivo in het lumbale ruggenmerg door neuronen, microglia en astrocyten in beeld te brengen om de sEV-levering door visualisatie kwalitatief te bevestigen.