Estratégias de Otimização da Aquisição de Dados de Tomografia Eletrônica Criogênica
Summary
A crescente demanda por coleta de dados em larga escala na tomografia criogênica de elétrons requer rotinas de aquisição de imagens de alto rendimento. Descrito aqui é um protocolo que implementa os recentes desenvolvimentos de estratégias avançadas de aquisição que visam maximizar o tempo-eficiência e o throughput da coleta de dados tomográficos.
Abstract
A tomografia eletrônica criogênica (crioET) é um método poderoso para estudar a estrutura 3D de amostras biológicas em um estado próximo ao nativo. O crioET de última geração atual combinado com a análise de média do subtomograma permite a determinação estrutural de alta resolução de complexos macromoleculares presentes em múltiplas cópias dentro de reconstruções tomográficas. Experimentos tomográficos geralmente requerem uma grande quantidade de séries de inclinação para serem adquiridas por meio de microscópios eletrônicos de transmissão high-end com importantes custos operacionais de execução. Embora o throughput e a confiabilidade das rotinas automatizadas de aquisição de dados tenham melhorado constantemente nos últimos anos, o processo de seleção de regiões de interesse nas quais uma série de inclinação será adquirida não pode ser facilmente automatizado e ainda depende da entrada manual do usuário. Portanto, a configuração de uma sessão de coleta de dados em larga escala é um procedimento demorado que pode reduzir consideravelmente o tempo restante do microscópio disponível para aquisição da série tilt. Aqui, o protocolo descreve as implementações recentemente desenvolvidas com base no pacote SerialEM e no software PyEM que melhoram significativamente a eficiência do tempo de triagem da grade e a coleta de dados de séries de inclinação em larga escala. O protocolo apresentado ilustra como usar funcionalidades de scripting serialem para automatizar totalmente o mapeamento da grade, o mapeamento quadrado da grade e a aquisição de séries de inclinação. Além disso, o protocolo descreve como usar o PyEM para selecionar alvos adicionais de aquisição no modo off-line após o início da coleta automatizada de dados. Para ilustrar este protocolo, sua aplicação no contexto da coleta de dados high-end da série de inclinação Sars-Cov-2 é descrita. O pipeline apresentado é particularmente adequado para maximizar a eficiência temporal dos experimentos de tomografia que requerem uma seleção cuidadosa de metas de aquisição e, ao mesmo tempo, uma grande quantidade de séries de inclinação a serem coletadas.
Introduction
Os métodos de microscopia eletrônica criogênica (crioEM) baseiam-se na imagem de amostras biológicas por meio de um microscópio eletrônico de transmissão (TEM) após sua rápida vitrificação, um processo de preparação amostral que preserva as estruturas moleculares e celulares dos espécimes em estado próximo ao nativo e hidratado1,2. Na tomografia eletrônica criogênica (crioET) um modelo 3D da amostra vitrificada é alcançado através da aquisição de uma série de imagens da mesma região de interesse de diferentes orientações, a chamada série inclinação, seguida pela reconstrução computacional do volume tomográfico3. Esta técnica avançada de imagem amadureceu em um poderoso método de investigação estrutural de processos biológicos no contexto de seus ambientes celulares nativos4,5,6.
Além da análise ultraestrutural da amostra vitrificada, reconstruções de alta resolução de complexos macromoleculares presentes em múltiplas cópias dentro do volume tomográfico podem ser obtidas aplicando subtomograma em média5. Esta abordagem de reconstrução baseia-se no alinhamento iterativo e na média de suba volumes contendo a estrutura de interesse e visa aumentar a relação sinal-ruído e a resolução da reconstrução final7,8. A média do subtomograma depende da coleta e processamento de uma grande quantidade de dados que muitas vezes exige a aquisição de centenas de séries de inclinação por meio de TEMs high-end com custos operacionais onerosos.
Atualmente, a configuração dessas sessões crioET automatizadas é um processo demorado que geralmente depende da entrada manual do usuário9,10,11. Normalmente, os alvos são identificados por inspeção visual da grade mapeada e, posteriormente, configurados para coleta automatizada de dados. A eficiência do usuário na identificação de pontos de aquisição é frequentemente afetada pela natureza da amostra, tornando-se particularmente desafiadora ao analisar macromoléculas purificadas com concentração subótima ou no caso de eventos raros em ambientes celulares lotados, implicando o uso de abordagens correlativas12. Além disso, os fluxos de trabalho atuais exigem a aquisição de imagens durante a configuração em várias ampliações que serão posteriormente utilizadas para localização precisa e centralização da meta durante a aquisição automatizada11,13,14. Essas etapas de re-alinhamento de alta precisão são cruciais para aplicações de alta resolução, que exigem que a imagem seja realizada em alta ampliação e requerem etapas precisas de centralização para manter a região de interesse dentro do pequeno campo de visão resultante. Ao todo, várias horas de cada sessão de coleta de dados são comprometidas para este procedimento demorado durante o qual o TEM não está envolvido na aquisição da série tilt. Portanto, dependendo da quantidade de séries de inclinação necessárias, a identificação e configuração dos pontos de aquisição pode ter um impacto considerável no tempo de microscópio disponível para coleta de dados durante uma sessão crioet.
Descrito aqui é um protocolo otimizado baseado no pacote de software SerialEM15 e na versão mais recente do software PyEM16 para mapear grades, quadrados de grade de mapa, selecionar alvos e configurar aquisição automatizada de dados para coleta de séries de inclinação em larga escala. O conceito-chave dessa abordagem é fornecer ao SerialEM imagens geradas computacionalmente pela PyEM para cada item de aquisição, denominados mapas virtuais, para a localização precisa e o centro do alvo. Para ganhar tempo real de aquisição, a seleção dos alvos, bem como a criação dos mapas virtuais são realizadas off-line usando uma segunda instância fictícia do SerialEM, desacoscando o processo de seleção de metas de aquisição de operações TEM. Embora não abordando como aumentar a qualidade dos dados13,17 ou a velocidade de aquisição da série tilt18,19, este protocolo é focado principalmente em estratégias para otimizar a eficiência de tempo da configuração de sessões crioET automatizadas em larga escala. Portanto, a implementação do protocolo apresentado destina-se àqueles cientistas que estabelecem fluxos de trabalho de coleta de dados crioET que desejam maximizar o rendimento da aquisição automatizada de dados, aumentando o tempo de microscópio disponível para aquisição da série tilt.
Protocol
Representative Results
Discussion
A partir de uma técnica de nicho, a crioET amadureceu agora em um método generalizado para realizar estudos estruturais em nível celular e molecular com resolução alcançável sem precedentes21,22. A crescente demanda por imagens crioEM tem pressionado os recursos limitados disponíveis para acessar essa tecnologia. Apesar da abertura de uma série de instalações nacionais de crioEM e dos esforços dos institutos científicos para aumentar sua capacidade tem para apoiar as necessidades da comunidade em todo o mundo, o acesso aos instrumentos crioem ainda é limitado e o tempo disponível para coleta de dados deve, portanto, ser utilizado eficientemente pelos usuários para maximizar o rendimento de cada sessão de microscopia. A necessidade de adquirir centenas de séries de inclinação combinadas com o tempo limitado disponível para coleta de dados exigiu novas rotinas de aquisição de imagens para obter melhor throughput sem comprometer a qualidade dos dados. Os recentes desenvolvimentos nos fluxos de trabalho de hardware e imagem aumentaram consideravelmente a velocidade de aquisição da série tilt18,19, resultando em uma mudança dramática da relação entre o tempo gasto para configurar um ponto de aquisição e o tempo necessário para a aquisição da série tilt real. Ao todo, o procedimento para a criação de pontos de aquisição está se tornando um dos principais gargalos para o rendimento alcançável das sessões de crioET.
O protocolo otimizado aqui apresentado nos permitiu configurar, no modo off-line, 171 posições para aquisição tomográfica automatizada no primeiro dia de uma sessão crioteco enquanto o microscópio estava ativamente envolvido em outras operações (por exemplo, mapeamento quadrado, ajuste e aquisição automatizada de séries de inclinação), sem afetar o tempo de microscópio disponível para coleta de dados. Além de maximizar o throughput de uma sessão crioET, esse pipeline reduz drasticamente o tempo investido pelo usuário na fase preparatória de uma sessão automatizada de coleta de dados. No protocolo descrito, o usuário é solicitado a navegar nos quadrados de grade mapeadas para identificar regiões de interesse adequadas e adicioná-las ao Serial EM Navigator como pontos de aquisição. Todos os alvos serão processados automaticamente em lote dentro do SerialEM pela ferramenta PyEM para a produção dos mapas virtuais16. A abordagem computacional apresentada é, portanto, consideravelmente mais rápida do que a aquisição de mapas de ancoragem reais, eliminando os períodos de espera associados ao movimento do palco, aquisição de imagens, mudança das condições de imagem entre View e Preview, e pela eventual reiteração dessas etapas enquanto centralização em alta ampliação. Além disso, como cada imagem adquirida leva ao acúmulo de dose de elétrons no objeto de interesse23, o uso de mapas virtuais para o realinhamento dos alvos reduz o dano de radiação introduzido na fase preparatória de uma sessão crioequito antes da aquisição da série de inclinação real. O protocolo descrito aqui faz uso de mapas virtuais intermediários e de alta ampliação (Preview e View, respectivamente) para realinhamento do alvo antes da aquisição da série tilt. Este procedimento pode ser facilmente modificado para usar apenas a imagem de ampliação intermediária quando a precisão do alinhamento é de menor importância, por exemplo, no caso de grandes estruturas onde a precisão final do alvo é menos preocupante10 ou para amostras de análise de partículas únicas que são mal espalhadas na crio-grade que requerem a seleção manual do usuário de cada ponto de aquisição24, 25. Finalmente, uma abordagem baseada no uso off-line de uma instância serialem falsa também facilita a configuração de pontos de aquisição por meio de conexão remota, minimizando a necessidade da presença física do usuário no microscópio, permitindo assim mais flexibilidade em termos de organização operacional da instalação.
Os recentes avanços tecnológicos e métodos para crioET melhoraram drasticamente a velocidade e a confiabilidade das sessões automatizadas de coleta de dados. No entanto, outros desenvolvimentos são necessários para abordar as etapas de limitação de taxas restantes deste método. Mais notavelmente, a etapa inicial do mapeamento da grade e do quadrado está se tornando um dos principais gargalos da configuração da sessão, gerando assim a necessidade de melhorias de hardware visando aumentar a velocidade dos movimentos do estágio do microscópio e da aquisição de imagens pelos detectores de elétrons diretos. Além disso, o desenvolvimento de abordagens de machine learning para automatizar totalmente o processo de identificação de destino será crucial para eliminar a necessidade de inspeção visual dos usuários para a seleção das regiões de interesse, um procedimento demorado que conta com a expertise dos usuários.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconhecemos o apoio da Unidade de Biologia Estrutural e Computacional e da Instalação do Núcleo de Microscopia eletrônica no Laboratório Europeu de Biologia Molecular em Heidelberg, Alemanha e do iNEXT-Discovery (número do projeto 871037). Somos extremamente gratos pelo excelente apoio do autor do pacote de software SerialEM, professor David Mastronarde. Agradecemos também a Herman Fung pela leitura crítica do manuscrito.
Materials
| Transmission Electron Microscope | Our protocol is only based on computational workflows. The user will only need acess to a TEM of any kind |
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