Strategieën voor optimalisatie van cryogene elektronentomografiegegevensverwerving
Summary
De toenemende vraag naar grootschalige gegevensverzameling in cryogene elektronentomografie vereist routines voor beeldverwerving met hoge doorvoer. Hier wordt een protocol beschreven dat de recente ontwikkelingen van geavanceerde acquisitiestrategieën implementeert die gericht zijn op het maximaliseren van de tijdsefficiëntie en doorvoer van tomografische gegevensverzameling.
Abstract
Cryogene elektronentomografie (cryoET) is een krachtige methode om de 3D-structuur van biologische monsters in een bijna-inheemse staat te bestuderen. De huidige state-of-the-art cryoET in combinatie met subtomogram middelingsanalyse maakt de hoge resolutie structurele bepaling van macromoleculaire complexen mogelijk die in meerdere kopieën aanwezig zijn binnen tomografische reconstructies. Tomografische experimenten vereisen meestal een enorme hoeveelheid kantelreeksen die moeten worden verkregen door middel van hoogwaardige transmissie-elektronenmicroscopen met belangrijke operationele bedrijfskosten. Hoewel de doorvoer en betrouwbaarheid van geautomatiseerde gegevensverwervingsroutines de afgelopen jaren voortdurend zijn verbeterd, kan het proces van het selecteren van interessegebieden waarbij een kantelreeks wordt verkregen niet gemakkelijk worden geautomatiseerd en is het nog steeds afhankelijk van de handmatige invoer van de gebruiker. Daarom is het opzetten van een grootschalige dataverzamelingssessie een tijdrovende procedure die de resterende microscooptijd die beschikbaar is voor het verkrijgen van tilt-series aanzienlijk kan verkorten. Hier beschrijft het protocol de recent ontwikkelde implementaties op basis van het SerialEM-pakket en de PyEM-software die de tijdefficiëntie van netscreening en grootschalige gegevensverzameling van tilt-series aanzienlijk verbeteren. Het gepresenteerde protocol illustreert hoe serialem-scriptfunctionaliteiten kunnen worden gebruikt om rastertoewijzing, rastervierkantmapping en het verkrijgen van kantelreeksen volledig te automatiseren. Bovendien beschrijft het protocol hoe PyEM kan worden gebruikt om extra acquisitiedoelen in de offline modus te selecteren nadat geautomatiseerde gegevensverzameling is gestart. Om dit protocol te illustreren, wordt de toepassing ervan in de context van high-end gegevensverzameling van Sars-Cov-2 tilt-serie beschreven. De gepresenteerde pijpleiding is bijzonder geschikt voor het maximaliseren van de tijdsefficiëntie van tomografie-experimenten die een zorgvuldige selectie van acquisitiedoelen vereisen en tegelijkertijd een grote hoeveelheid kantelreeksen die moeten worden verzameld.
Introduction
Cryogene elektronenmicroscopiemethoden (cryoEM) zijn gebaseerd op de beeldvorming van biologische monsters door middel van een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) na hun snelle vitrificatie, een monstervoorbereidingsproces dat de moleculaire en cellulaire structuren van specimens in een dicht bij-inheemse en gehydrateerde toestand behoudt1,2. In cryogene elektronentomografie (cryoET) wordt een 3D-model van het verglaasde monster bereikt door een aantal beelden te verkrijgen van dezelfde interesseregio uit verschillende oriëntaties, de zogenaamde kantelreeks, gevolgd door de computationele reconstructie van het tomografische volume3. Deze geavanceerde beeldvormingstechniek is uitgegroeid tot een krachtige methode voor het structurele onderzoek van biologische processen in de context van hun inheemse cellulaire omgevingen4,5,6.
Naast de ultrastructurele analyse van het verglaasde monster kunnen reconstructies met hoge resolutie van macromoleculaire complexen die in meerdere kopieën binnen het tomografische volume aanwezig zijn, worden verkregen door subtomogrammiddeling5toe te passen. Deze reconstructiebenadering is gebaseerd op de iteratieve uitlijning en middeling van subvolumes die de structuur van belang bevatten en is gericht op het verhogen van de signaal-ruisverhouding en de oplossing van de definitieve reconstructie7,8. Subtomogram middeling is afhankelijk van het verzamelen en verwerken van een grote hoeveelheid gegevens die vaak de aanschaf van honderden tilt-series vereist door middel van high-end TEMs met zware operationele bedrijfskosten.
Momenteel is de installatie van dergelijke geautomatiseerde cryoET-sessies een tijdrovend proces dat meestal afhankelijk is van de handmatige invoer van de gebruiker9,10,11. Doelen worden meestal geïdentificeerd door visuele inspectie van het toegewezen raster en vervolgens ingesteld voor geautomatiseerde gegevensverzameling. De efficiëntie van de gebruiker bij het identificeren van acquisitiepunten wordt vaak beïnvloed door de aard van het monster, wat bijzonder uitdagend wordt bij het analyseren van gezuiverde macromoleculen met suboptimale concentratie of in het geval van zeldzame gebeurtenissen in drukke cellulaire omgevingen, wat het gebruik van correlatieve benaderingen impliceert12. Bovendien vereisen de huidige werkstromen de verwerving van afbeeldingen tijdens de installatie bij verschillende vergrotingen die later zullen worden gebruikt voor nauwkeurige lokalisatie en centreren van het doel tijdens geautomatiseerde acquisitie11,13,14. Deze uiterst nauwkeurige stappen voor het opnieuw uitlijnen zijn cruciaal voor toepassingen met een hoge resolutie, die vereisen dat de beeldvorming met een hoge vergroting wordt uitgevoerd en nauwkeurige centreerstappen vereisen om het interessegebied binnen het resulterende kleine gezichtsveld te behouden. In totaal worden enkele uren van elke gegevensverzamelingssessie vastgelegd voor deze tijdrovende procedure waarbij de TEM niet bezig is met de verwerving van tilt-serie. Afhankelijk van de hoeveelheid vereiste kantelreeksen kan de identificatie en opstelling van acquisitiepunten een aanzienlijke impact hebben op de microscooptijd die beschikbaar is voor het verzamelen van gegevens tijdens een cryoET-sessie.
Hier wordt een geoptimaliseerd protocol beschreven op basis van het SerialEM-softwarepakket15 en de nieuwste versie de PyEM-software16 om rasters in kaart te brengen, rastervierkanten in kaart te brengen, doelen te selecteren en geautomatiseerde gegevensverzameling in te stellen voor grootschalige verzameling van kantelreeksen. Het belangrijkste concept van deze aanpak is om SerialEM te voorzien van computationeel gegenereerde afbeeldingen door PyEM voor elk acquisitie-item, virtuele kaarten genoemd, voor de nauwkeurige lokalisatie en centreering van het doel. Om daadwerkelijke acquisitietijd te verkrijgen, worden de selectie van de doelen en het maken van de virtuele kaarten offline uitgevoerd met behulp van een tweede dummy-exemplaar van SerialEM, waarbij het selectieproces van acquisitiedoelen wordt ontkoppeld van TEM-bewerkingen. Hoewel dit protocol niet gaat over het verhogen van de gegevenskwaliteit13,17 of de snelheid van het verkrijgen van tilt-serie18,19, is dit protocol voornamelijk gericht op strategieën om de tijdefficiëntie van grootschalige geautomatiseerde cryoET-sessies te optimaliseren. Daarom is de implementatie van het gepresenteerde protocol bedoeld voor die wetenschappers die cryoET-workflows voor gegevensverzameling opzetten die de opbrengst van geautomatiseerde gegevensverwerving willen maximaliseren door de beschikbare microscooptijd voor het verkrijgen van tilt-series te vergroten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vanuit een nichetechniek is cryoET nu uitgegroeid tot een wijdverspreide methode om structurele studies uit te voeren op cellulair en moleculair niveau met een ongekende bereikbare resolutie21,22. De steeds toenemende vraag naar cryoEM-beeldvorming heeft de beperkte middelen die beschikbaar zijn om toegang te krijgen tot deze technologie onder druk gezet. Ondanks de opening van een aantal nationale cryoEM-faciliteiten en de inspanningen van wetenschappelijke instituten om hun TEM-capaciteit te vergroten om de behoeften van de gemeenschap wereldwijd te ondersteunen, is de toegang tot cryoEM-instrumenten nog steeds beperkt en moet de tijd die beschikbaar is voor het verzamelen van gegevens daarom efficiënt door de gebruikers worden gebruikt om de opbrengst van elke microscopiesessie te maximaliseren. De noodzaak om honderden tilt-series te verwerven in combinatie met de beperkte tijd die beschikbaar is voor het verzamelen van gegevens, vroeg om nieuwe beeldverwervingsroutines om een betere doorvoer te bereiken zonder de gegevenskwaliteit in gevaar te brengen. Recente ontwikkelingen in hardware- en imagingworkflows hebben de snelheid van de acquisitie van tilt-series18,19aanzienlijk verhoogd , wat heeft resulteren in een dramatische verschuiving van de verhouding tussen de tijd die is besteed aan het opzetten van een acquisitiepunt en de tijd die nodig is voor de daadwerkelijke acquisitie van de tilt-serie. Al met al wordt de procedure voor het opzetten van acquisitiepunten een van de belangrijkste knelpunten voor de haalbare doorvoer van cryoET-sessies.
Het hier gepresenteerde geoptimaliseerde protocol stelde ons in staat om in off-line modus 171 posities in te stellen voor geautomatiseerde tomografische acquisitie binnen de eerste dag van een cryoET-sessie, terwijl de microscoop actief bezig was met andere bewerkingen (bijv. square mapping, tuning en geautomatiseerde tilt-serie acquisitie), dus zonder de microscooptijd te beïnvloeden die beschikbaar is voor het verzamelen van gegevens. Naast het maximaliseren van de doorvoer van een cryoET-sessie, vermindert deze pijplijn de hoeveelheid tijd die de gebruiker investeert in de voorbereidende fase van een geautomatiseerde sessie voor het verzamelen van gegevens drastisch. In het beschreven protocol wordt de gebruiker gevraagd door de toegewezen rastervierkanten te bladeren om geschikte gebieden van belang te identificeren en deze toe te voegen aan de Serial EM Navigator als acquisitiepunten. Alle doelen worden vervolgens automatisch in batch verwerkt binnen SerialEM door de PyEM-tool voor de productie van de virtuele kaarten16. De gepresenteerde computationele benadering is daarom aanzienlijk sneller dan het verkrijgen van echte verankeringskaarten door de wachttijden te elimineren die verband houden met fasebeweging, beeldverwerving, verandering van beeldomstandigheden tussen Weergave en Voorbeeld, en door de uiteindelijke herhaling van deze stappen terwijl ze zich centreren bij een hoge vergroting. Bovendien, aangezien elk verworven beeld leidt tot accumulatie van elektronendosis op het object van belang23, vermindert het gebruik van virtuele kaarten voor de precieze herschikking van de doelen de stralingsschade die is geïntroduceerd in de voorbereidende fase van een cryoET-sessie vóór de daadwerkelijke verwerving van de kantelreeks. Het hier beschreven protocol maakt gebruik van zowel virtuele projecties met een gemiddelde als een hoge vergroting (respectievelijk Preview en View) voor het opnieuw uitlijnen van het doel vóór de verwerving van de tilt-serie. Deze procedure kan eenvoudig worden gewijzigd om alleen de tussenliggende vergroting te gebruiken Beeldweergave wanneer de uitlijningsnauwkeurigheid van minder belang is, bijvoorbeeld in het geval van grote constructies waar de uiteindelijke doelnauwkeurigheid minder zorgwekkend is10 of voor monsters met één deeltjesanalyse die slecht zijn verspreid op het cryo-raster en waarvoor de gebruiker handmatige selectie van elk acquisitiepunt24vereist, 25. Ten slotte vergemakkelijkt een aanpak op basis van het off-line gebruik van een dummy SerialEM-exemplaar ook de installatie van acquisitiepunten via externe verbinding door de behoefte aan de fysieke aanwezigheid van de gebruiker onder de microscoop te minimaliseren, waardoor meer flexibiliteit mogelijk is in termen van operationele organisatie van de faciliteit.
De recente vooruitgang in technologie en methoden voor cryoET heeft de snelheid en betrouwbaarheid van geautomatiseerde dataverzamelingssessies drastisch verbeterd. Er zijn echter verdere ontwikkelingen nodig om de resterende tariefbeperkende stappen van deze methode aan te pakken. Het meest in het bijzonder wordt de eerste stap van raster- en vierkantsmapping nu een van de belangrijkste knelpunten van de sessie-instelling, waardoor de behoefte aan hardwareverbeteringen wordt gegenereerd die gericht zijn op het verhogen van de snelheid van microscooptrapbewegingen en van beeldverwerving door de directe elektronendetectoren. Bovendien zal de ontwikkeling van machine learning-benaderingen om het proces van doelidentificatie volledig te automatiseren van cruciaal belang zijn om de visuele inspectie van de gebruikers voor het selecteren van de betrokken regio’s te elimineren, een tijdrovende procedure die afhankelijk is van de expertise van de gebruikers.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We erkennen de steun van de structural and computational biology unit en de Electron Microscopy Core Facility van het European Molecular Biology Laboratory in Heidelberg, Duitsland en van iNEXT-Discovery (projectnummer 871037). We zijn zeer dankbaar voor de uitstekende steun van de auteur van het SerialEM-softwarepakket, professor David Mastronarde. We danken ook Herman Fung voor de kritische lezing van het manuscript.
Materials
| Transmission Electron Microscope | Our protocol is only based on computational workflows. The user will only need acess to a TEM of any kind |
References
- Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryo-electron microscopy of viruses. Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).
- Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
- Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. Structural studies by electron tomography: From Cells to Molecules. Annual Review of Biochemistry. 74 (1), 833-865 (2005).
- Pfeffer, S., Mahamid, J. Unravelling molecular complexity in structural cell biology. Current Opinion in Structural Biology. 52, 111-118 (2018).
- Schur, F. K. M. Toward high-resolution in situ structural biology with cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Current Opinion in Structural Biology. 58, 1-9 (2019).
- Bohning, J., Bharat, T. A. M. Towards high-throughput in situ structural biology using electron cryotomography. Progress in Biophysics and Molecular Biology. , (2020).
- Briggs, J. A. Structural biology in situ–the potential of subtomogram averaging. Current Opinion in Structural Biology. 23 (2), 261-267 (2013).
- Wan, W., Briggs, J. A. G. . Methods in Enzymology. 579, 329-367 (2016).
- Tan, Y. Z., Cheng, A., Potter, C. S., Carragher, B. Automated data collection in single particle electron microscopy. Microscopy. 65 (1), 43-56 (2016).
- Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. Using Tomoauto: A protocol for high-throughput automated cryo-electron tomography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (107), e53608 (2016).
- Resch, G. P. . Methods in Cell Biology. 152, 135-178 (2019).
- Bharat, T. A., Kukulski, W. . Correlative Imaging: Focusing on the Future. , 137-153 (2019).
- Hagen, W. J. H., Wan, W., Briggs, J. A. G. Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging. Journal of Structural Biology. 197 (2), 191-198 (2017).
- O’Toole, E., vander Heide, P., McIntosh, R. J., Mastronarde, D. . Cellular Imaging: Electron Tomography and Related Techniques. , 95-116 (2018).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16, 471-477 (2019).
- Turonova, B., et al. Benchmarking tomographic acquisition schemes for high-resolution structural biology. Nature Communications. 11 (1), 876 (2020).
- Chreifi, G., Chen, S., Metskas, L. A., Kaplan, M., Jensen, G. J. Rapid tilt-series acquisition for electron cryotomography. Journal of Structural Biology. 205 (2), 163-169 (2019).
- Eisenstein, F., Danev, R., Pilhofer, M. Improved applicability and robustness of fast cryo-electron tomography data acquisition. Journal of Structural Biology. 208 (2), 107-114 (2019).
- Turonova, B., et al. In situ structural analysis of SARS-CoV-2 spike reveals flexibility mediated by three hinges. Science. 370 (6513), 203-208 (2020).
- O’Reilly, F. J., et al. In-cell architecture of an actively transcribing-translating expressome. Science. 369 (6503), 554-557 (2020).
- Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.7 Å inside cells. Nature Methods. 18, 186-193 (2020).
- Karuppasamy, M., Karimi Nejadasl, F., Vulovic, M., Koster, A. J., Ravelli, R. B. G. Radiation damage in single-particle cryo-electron microscopy: effects of dose and dose rate. Journal of Synchrotron Radiation. 18 (3), 398-412 (2011).
- Liberta, F., et al. Cryo-EM fibril structures from systemic AA amyloidosis reveal the species complementarity of pathological amyloids. Nature Communications. 10 (1), 1104 (2019).
- Radamaker, L., et al. Cryo-EM structure of a light chain-derived amyloid fibril from a patient with systemic AL amyloidosis. Nature Communications. 10 (1), 1103 (2019).
