אסטרטגיות לאופטימיזציה של רכישת נתונים טומוגרפיה אלקטרוגנית
Summary
הביקוש הגובר לאיסוף נתונים בקנה מידה גדול בטומוגרפיה קריוגנית של אלקטרונים דורש שגרת רכישת תמונות בתפוקה גבוהה. מתואר כאן פרוטוקול המיישם את ההתפתחויות האחרונות של אסטרטגיות רכישה מתקדמות שמטרתן למקסם את יעילות הזמן והתפוקה של איסוף נתונים טומוגרפיים.
Abstract
טומוגרפיה של אלקטרונים קריוגניים (cryoET) היא שיטה רבת עוצמה לחקר המבנה התלת-ממדי של דגימות ביולוגיות במצב קרוב לילידים. CryoET החדיש הנוכחי בשילוב עם ניתוח ממוצע תת-מערכת מאפשר קביעת מבנה ברזולוציה גבוהה של מתחמי מאקרומולקולריים הנמצאים בעותקים מרובים בתוך שחזורים טומוגרפיים. ניסויים טומוגרפיים דורשים בדרך כלל כמות עצומה של סדרות הטיה כדי להירכש באמצעות מיקרוסקופים אלקטרונים שידור גבוה עם עלויות תפעוליות חשובות. למרות שהתפוקה והאמינות של שגרות רכישת נתונים אוטומטיות השתפרו כל הזמן בשנים האחרונות, תהליך בחירת אזורי העניין שבהם תירכש סדרת הטיה לא ניתן לאוטומטיות בקלות והיא עדיין מסתמכת על הקלט הידני של המשתמש. לכן, ההגדרה של הפעלת איסוף נתונים בקנה מידה גדול היא הליך שגוזל זמן רב שיכול להפחית במידה ניכרת את זמן המיקרוסקופ הנותר הזמין לרכישת סדרת הטיה. כאן, הפרוטוקול מתאר את היישומים שפותחו לאחרונה בהתבסס על חבילת SerialEM ותוכנת PyEM שמשפרת באופן משמעותי את יעילות הזמן של סינון רשת ואיסוף נתונים של סדרות הטיה בקנה מידה גדול. הפרוטוקול המוצג ממחיש כיצד להשתמש בפונקציות Scripting של SerialEM כדי להפוך באופן אוטומטי מיפוי רשת, מיפוי ריבוע רשת ורכישת סידרות הטיה. יתר על כן, הפרוטוקול מתאר כיצד להשתמש ב- PyEM כדי לבחור יעדי רכישה נוספים במצב לא מקוון לאחר אתחול איסוף נתונים אוטומטי. כדי להמחיש פרוטוקול זה, היישום שלה בהקשר של איסוף נתונים מתקדמים של סדרת הטיה Sars-Cov-2 מתואר. הצינור המוצג מתאים במיוחד למקסם את יעילות הזמן של ניסויי טומוגרפיה הדורשים מבחר זהיר של יעדי רכישה ובמקביל כמות גדולה של סדרות הטיה שיש לאסוף.
Introduction
שיטות מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגניות (cryoEM) מבוססות על הדמיה של דגימות ביולוגיות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM) לאחר התחדשותם המהירה, תהליך הכנת מדגם המשמר את המבנים המולקולריים והתאים של דגימות במצב קרוב לילידיולחות 1,2. בטומוגרפיה קריוגנית של אלקטרונים (cryoET) מושג מודל תלת-ממדי של המדגם המהולל על ידי רכישת מספר תמונות של אותו אזור עניין מכיוונים שונים, מה שמכונה סדרת הטיה, ואחריו שחזור חישובי של כרך טומוגרפי3. טכניקת הדמיה מתקדמת זו התבגרה לשיטה רבת עוצמה לחקירה מבנית של תהליכים ביולוגיים בהקשר של סביבות התא הטבעיות שלהם4,5,6.
בנוסף לניתוח אולטרה-מבני של המדגם המהולל, ניתן להשיג שחזורים ברזולוציה גבוהה של מתחמי מאקרומולקולריים הנמצאים בעותקים מרובים בתוך הכרך הטומוגרפי על ידי החלת תת-אוטומוגרמה ממוצעתשל 5. גישת שחזור זו מבוססת על היישור האיטרטיבי ועל ממוצע של תתי-נפחים המכילים את מבנה העניין והיא נועדה להגדיל את יחס האות לרעש ואת הרזולוציה של השחזור הסופי7,8. תת-מערכת בממוצע מסתמכת על איסוף ועיבוד של כמות גדולה של נתונים הדורשת לעתים קרובות רכישה של מאות סדרות הטיה באמצעות TEMs יוקרתיים עם עלויות תפעוליות מכבידות.
נכון לעכשיו ההתקנה של הפעלות cryoET אוטומטיות כאלה היא תהליך גוזל זמן, כי בדרך כלל מסתמך על קלט ידני של המשתמש9,10,11. בדרך כלל, יעדים מזוהים על-ידי בדיקה חזותית של הרשת הממופה ולאחר מכן מוגדרים לאיסוף נתונים אוטומטי. היעילות של המשתמש בזיהוי נקודות רכישה מושפעת לעתים קרובות מאופי המדגם, הופכת למאתגרת במיוחד בעת ניתוח מקרומולקולים מטוהרים עם ריכוז תת-אופטימלי או במקרה של אירועים נדירים בסביבות תאיות צפופות, מה שמרמז על השימוש בגישות קורלטיביות12. יתר על כן, זרימות העבודה הנוכחיות דורשות רכישת תמונות במהלך ההגדלה בהגדלות שונות שישמשו מאוחר יותר לוקליזציה מדויקת וריכוז היעד במהלך רכישה אוטומטית11,13,14. שלבי יישור מחדש מדויקים אלה חיוניים עבור יישומים ברזולוציה גבוהה, הדורשים לבצע את ההדמיה בהגדלה גבוהה ודורשים צעדי מיקוד מדויקים לשמירה על אזור העניין בתוך שדה הראייה הקטן שנוצר. בסך הכל, מספר שעות של כל הפעלת איסוף נתונים מתבצעות עבור הליך ארוך זה שבמהלכו TEM אינו עוסק ברכישת סדרת הטיה. לכן, בהתאם לכמות סדרת הטיה הנדרשת, זיהוי ותפאורה של נקודות רכישה יכולים להשפיע באופן ניכר על זמן המיקרוסקופ הזמין לאיסוף נתונים במהלך הפעלת cryoET.
המתואר כאן הוא פרוטוקול ממוטב המבוסס על חבילת התוכנה SerialEM15 והגירסה העדכנית ביותר תוכנת PyEM16 כדי למפות רשתות, למפות ריבועי רשת, לבחור יעדים ולהגדיר רכישת נתונים אוטומטית עבור איסוף סדרות הטיה בקנה מידה גדול. הרעיון המרכזי של גישה זו הוא לספק ל- SerialEM תמונות שנוצרו באופן חישובי על-ידי PyEM עבור כל פריט רכישה, המכונה מפות וירטואליות, עבור לוקליזציה מדויקת וריכוז היעד. כדי להשיג זמן רכישה בפועל, בחירת היעדים כמו גם יצירת המפות הווירטואליות מבוצעות באופן לא מקוון באמצעות מופע דמה שני של SerialEM, ניתוק תהליך הבחירה של יעדי רכישה מפעולות TEM. אמנם לא מתייחס כיצד להגדיל את איכות הנתונים13,17 או את המהירות של רכישת סדרת הטיה18,19, פרוטוקול זה מתמקד בעיקר באסטרטגיות כדי לייעל את יעילות הזמן של הגדרת הפעלות cryoET אוטומטי בקנה מידה גדול. לכן, יישום הפרוטוקול המוצג מיועד לאותם מדענים המקימים זרימות עבודה לאיסוף נתונים של CryoET המעוניינות למקסם את התשואה של רכישת נתונים אוטומטית על ידי הגדלת זמן המיקרוסקופ הזמין לרכישת סדרת הטיה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מטכניקת נישה, cryoET התבגרה כעת לשיטה נפוצה לביצוע מחקרים מבניים ברמה התאית והמולקולרית ברזולוציה חסרת תקדים21,22. הביקוש ההולך וגדל להדמיית cryoEM הכביד על המשאבים המוגבלים הזמינים לגישה לטכנולוגיה זו. למרות פתיחתם של מספר מתקני cryoEM לאומיים ומאמציהם של מכונים מדעיים להגדיל את יכולת TEM שלהם כדי לתמוך בצרכי הקהילה ברחבי העולם, הגישה למכשירי cryoEM עדיין מוגבלת ולכן יש להשתמש ביעילות בזמן הזמין לאיסוף נתונים על ידי המשתמשים כדי למקסם את התפוקה של כל מפגש מיקרוסקופיה. הצורך לרכוש מאות סדרות הטיה בשילוב עם הזמן המוגבל הזמין לאיסוף נתונים קרא לשגרת רכישת תמונות חדשנית כדי להשיג תפוקה טובה יותר מבלי להתפשר על איכות הנתונים. ההתפתחויות האחרונות בתהליכי עבודה של חומרה והדמיה הגבירו במידה ניכרת את מהירות רכישת סדרת הטיה18,19, וכתוצאה מכך שינוי דרמטי של היחס בין הזמן שהושקע כדי להגדיר נקודת רכישה וזמן הדרוש לרכישת סדרת הטיה בפועל. בסך הכל, ההליך להקמת נקודות רכישה הופך לאחד צווארי הבקבוק העיקריים לתפוקה ברת השגה של מפגשי cryoET.
הפרוטוקול הממוטב שהוצג כאן איפשר לנו להגדיר, במצב לא מקוון, 171 עמדות לרכישה טומוגרפית אוטומטית ביום הראשון של הפעלת cryoET בזמן שהמיקרוסקופ היה מעורב באופן פעיל בפעולות אחרות (למשל, מיפוי ריבועי, כוונון ורכישת סדרת הטיה אוטומטית), ובכך מבלי להשפיע על זמן המיקרוסקופ הזמין לאיסוף נתונים. בנוסף למקסם את התפוקה של הפעלת cryoET, צינור זה מקטין באופן דרסטי את משך הזמן המושקע על ידי המשתמש בשלב ההכנה של הפעלת איסוף נתונים אוטומטית. בפרוטוקול המתואר, המשתמש מתבקש לעיין בריבועי הרשת הממופים כדי לזהות אזורים מתאימים של עניין ולהוסיף אותם לנווט EM טורי כנקודות רכישה. לאחר מכן, כל היעדים יעובדו באופן אוטומטי באצווה בתוך SerialEM על-ידי הכלי PyEM לייצור המפות הווירטואליות16. לפיכך, הגישה החישובית המוצגת מהירה בהרבה מרכישת מפות עיגון אמיתיות על-ידי ביטול תקופות ההמתנה הקשורות לתנועת הבמה, רכישת תמונות, שינוי תנאי ההדמיה בין תצוגה לתצוגה מקדימה, ועל-ידי חזרה על שלבים אלה תוך התמקדות בהגדלה גבוהה. בנוסף, כמו כל תמונה שנרכשה מובילה הצטברות של מינון אלקטרונים על אובייקט עניין23, השימוש במפות וירטואליות עבור יישוב מחדש מדויק של המטרות מפחית את נזקי הקרינה שהוצגו בשלב ההכנה של מפגש cryoET לפני רכישת סדרת הטיה בפועל. הפרוטוקול המתואר כאן עושה שימוש במפות וירטואליות ביניים וגבוהות (תצוגה מקדימה ותצוגה, בהתאמה) לכיוון מחדש של היעד לפני רכישת סדרת הטיה. הליך זה יכול להשתנות בקלות רק כדי להשתמש רק בהגדלת ביניים הצג תמונה כאשר דיוק היישור הוא בעל חשיבות פחותה, למשל, במקרה של מבנים גדולים שבהם דיוק היעד האולטימטיבי הוא פחותדאגה 10 או עבור דגימות ניתוח חלקיקים בודדים כי הם מפוזרים בצורה גרועה על רשת ההקפאה הדורשת את הבחירה הידנית של המשתמש של כל נקודת רכישה24, 25. לבסוף, גישה המבוססת על שימוש לא מקוון של מופע SerialEM דמה גם מקלה על הגדרת נקודות רכישה באמצעות חיבור מרחוק על ידי מזעור הצורך בנוכחות הפיזית של המשתמש במיקרוסקופ, ובכך מאפשרת גמישות רבה יותר מבחינת הארגון התפעולי של המתקן.
ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיה ובשיטות עבור cryoET שיפרו באופן דרסטי את המהירות והאמינות של הפעלות איסוף נתונים אוטומטיות. עם זאת, נדרשות התפתחויות נוספות כדי לטפל בשלבים הנותרים של הגבלת התעריפים בשיטה זו. בעיקר, השלב הראשוני של מיפוי רשת וגלבוע הופך כעת לאחד צווארי הבקבוק העיקריים של הגדרת ההפעלה, ובכך יוצר את הצורך בשיפורי חומרה שמטרתם להגביר את המהירות של תנועות שלב מיקרוסקופ ורכישת תמונה על ידי גלאי אלקטרונים ישירים. בנוסף, פיתוח גישות למידת מכונה לאוטומטיות מלאה של תהליך זיהוי היעד יהיה קריטי כדי למנוע את הצורך של הבדיקה החזותית של המשתמשים לבחירת אזורי העניין, הליך שגוזל זמן רב המסתמך על המומחיות של המשתמשים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים בתמיכה מהיחידה לביולוגיה מבנית וחישובית וממתקן הליבה של מיקרוסקופיית אלקטרונים במעבדה האירופית לביולוגיה מולקולרית בהיידלברג, גרמניה ומ-iNEXT-Discovery (מספר הפרויקט 871037). אנו אסירי תודה על התמיכה המצוינת של מחבר חבילת התוכנה SerialEM, פרופסור דיוויד מסטרונרד. אנו מודים גם להרמן פונג על הקריאה הביקורתית של כתב היד.
Materials
| Transmission Electron Microscope | Our protocol is only based on computational workflows. The user will only need acess to a TEM of any kind |
References
- Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryo-electron microscopy of viruses. Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).
- Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
- Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. Structural studies by electron tomography: From Cells to Molecules. Annual Review of Biochemistry. 74 (1), 833-865 (2005).
- Pfeffer, S., Mahamid, J. Unravelling molecular complexity in structural cell biology. Current Opinion in Structural Biology. 52, 111-118 (2018).
- Schur, F. K. M. Toward high-resolution in situ structural biology with cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Current Opinion in Structural Biology. 58, 1-9 (2019).
- Bohning, J., Bharat, T. A. M. Towards high-throughput in situ structural biology using electron cryotomography. Progress in Biophysics and Molecular Biology. , (2020).
- Briggs, J. A. Structural biology in situ–the potential of subtomogram averaging. Current Opinion in Structural Biology. 23 (2), 261-267 (2013).
- Wan, W., Briggs, J. A. G. . Methods in Enzymology. 579, 329-367 (2016).
- Tan, Y. Z., Cheng, A., Potter, C. S., Carragher, B. Automated data collection in single particle electron microscopy. Microscopy. 65 (1), 43-56 (2016).
- Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. Using Tomoauto: A protocol for high-throughput automated cryo-electron tomography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (107), e53608 (2016).
- Resch, G. P. . Methods in Cell Biology. 152, 135-178 (2019).
- Bharat, T. A., Kukulski, W. . Correlative Imaging: Focusing on the Future. , 137-153 (2019).
- Hagen, W. J. H., Wan, W., Briggs, J. A. G. Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging. Journal of Structural Biology. 197 (2), 191-198 (2017).
- O’Toole, E., vander Heide, P., McIntosh, R. J., Mastronarde, D. . Cellular Imaging: Electron Tomography and Related Techniques. , 95-116 (2018).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16, 471-477 (2019).
- Turonova, B., et al. Benchmarking tomographic acquisition schemes for high-resolution structural biology. Nature Communications. 11 (1), 876 (2020).
- Chreifi, G., Chen, S., Metskas, L. A., Kaplan, M., Jensen, G. J. Rapid tilt-series acquisition for electron cryotomography. Journal of Structural Biology. 205 (2), 163-169 (2019).
- Eisenstein, F., Danev, R., Pilhofer, M. Improved applicability and robustness of fast cryo-electron tomography data acquisition. Journal of Structural Biology. 208 (2), 107-114 (2019).
- Turonova, B., et al. In situ structural analysis of SARS-CoV-2 spike reveals flexibility mediated by three hinges. Science. 370 (6513), 203-208 (2020).
- O’Reilly, F. J., et al. In-cell architecture of an actively transcribing-translating expressome. Science. 369 (6503), 554-557 (2020).
- Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.7 Å inside cells. Nature Methods. 18, 186-193 (2020).
- Karuppasamy, M., Karimi Nejadasl, F., Vulovic, M., Koster, A. J., Ravelli, R. B. G. Radiation damage in single-particle cryo-electron microscopy: effects of dose and dose rate. Journal of Synchrotron Radiation. 18 (3), 398-412 (2011).
- Liberta, F., et al. Cryo-EM fibril structures from systemic AA amyloidosis reveal the species complementarity of pathological amyloids. Nature Communications. 10 (1), 1104 (2019).
- Radamaker, L., et al. Cryo-EM structure of a light chain-derived amyloid fibril from a patient with systemic AL amyloidosis. Nature Communications. 10 (1), 1103 (2019).
