Kriyojenik Elektron Tomografi Veri Kazanımının Optimizasyonu stratejileri
Summary
Kriyojenik elektron tomografisinde büyük ölçekli veri toplama için artan talep, yüksek verimli görüntü alma rutinleri gerektirir. Burada açıklanan, tomografik veri toplamanın zaman verimliliğini ve verimini en üst düzeye çıkarmayı amaçlayan gelişmiş satın alma stratejilerinin son gelişmelerini uygulayan bir protokoldür.
Abstract
Kriyojenik elektron tomografisi (cryoET), biyolojik örneklerin 3D yapısını yerliye yakın bir durumda incelemek için güçlü bir yöntemdir. Mevcut son teknoloji cryoET, subtomogram ortalama analizi ile birlikte tomografik rekonstrüksiyonlarda birden fazla kopyada bulunan makromoleküler komplekslerin yüksek çözünürlüklü yapısal belirlenmesini sağlar. Tomografik deneyler genellikle önemli operasyonel çalışma maliyetlerine sahip üst düzey iletim elektron mikroskopları ile çok miktarda eğim serisinin elde edilmesini gerektirir. Otomatik veri toplama rutinlerinin aktarım hızı ve güvenilirliği son yıllarda sürekli olarak iyileşse de, bir eğim serisinin edinileceği ilgi alanlarını seçme süreci kolayca otomatikleşemez ve yine de kullanıcının manuel girişine dayanır. Bu nedenle, büyük ölçekli bir veri toplama oturumunun kurulumu, eğim serisi alımı için mevcut kalan mikroskop süresini önemli ölçüde azaltabilen zaman alıcı bir yordamdır. Burada protokol, SerialEM paketine ve pyem yazılımına dayalı olarak geliştirilen ve ızgara taraması ve büyük ölçekli eğim serisi veri toplamanın zaman verimliliğini önemli ölçüde artıran uygulamaları açıklar. Sunulan protokol, kılavuz eşleme, ızgara kare eşleme ve eğim serisi alımını tam olarak otomatikleştirmek için SerialEM komut dosyası işlevlerinin nasıl kullanılacağını gösterir. Ayrıca, protokol, otomatik veri toplama başlatıldıktan sonra devre dışı modda ek alım hedefleri seçmek için PyEM’in nasıl kullanılacağını açıklar. Bu protokolü göstermek için, Sars-Cov-2 tilt serisinin üst düzey veri toplama bağlamındaki uygulaması açıklanmıştır. Sunulan boru hattı, özellikle satın alma hedeflerinin dikkatli bir şekilde seçilmesini ve aynı zamanda çok miktarda eğim serisinin toplanmasını gerektiren tomografi deneylerinin zaman verimliliğini en üst düzeye çıkarmak için uygundur.
Introduction
Kriyojenik elektron mikroskopisi (cryoEM) yöntemleri, örneklerin moleküler ve hücresel yapılarını yerliye yakın ve hidratlı durumda koruyan bir numune hazırlama işlemi olan hızlı vitrifikasyonlarından sonra bir iletim elektron mikroskobu (TEM) ile biyolojik örneklerin görüntülenmesine dayanmaktadır1,2. Kriyojenik elektron tomografisinde (cryoET) vitrifiye numunenin 3D modeli, farklı yönelimlerden aynı ilgi bölgesinin bir dizi görüntüsü elde ederek elde edilir, eğim serisi olarak adlandırılır, ardından tomografik hacmin hesaplamalı rekonstrüksiyonu3. Bu gelişmiş görüntüleme tekniği, biyolojik süreçlerin yerel hücresel ortamları bağlamında yapısal olarak araştırılması için güçlü bir yönteme dönüştü4,5,6.
Vitrifiye numunenin ultrayapısal analizine ek olarak, tomografik hacim içinde birden fazla kopyada bulunan makromoleküler komplekslerin yüksek çözünürlüklü rekonstrüksiyonları, ortalama5subtomogram uygulanarak elde edilebilir. Bu yeniden yapılandırma yaklaşımı, ilgi yapısını içeren alt hacimlerin yinelemeli hizalanmasına ve ortalamasına dayanır ve sinyal-gürültü oranını ve nihai yeniden yapılandırmanın çözünürlüğünü artırmayı amaçlamaktadır7,8. Subtomogram ortalaması, genellikle üst düzey TEM’ler ve çok sayıda operasyonel çalışma maliyeti ile yüzlerce eğim serisinin alınmasını gerektiren büyük miktarda verinin toplanmasına ve işlenmesine dayanır.
Şu anda bu tür otomatik cryoET oturumlarının kurulumu, genellikle kullanıcının manuel girişi9, 10,11‘edayanan zaman alıcı bir işlemdir. Genellikle, hedefler eşlenen kılavuzun görsel incelemesiyle tanımlanır ve daha sonra otomatik veri toplama için ayarlanır. Kullanıcının alım noktalarını belirlemedeki verimliliği genellikle numunenin doğasından etkilenir, özellikle saflaştırılmış makromolekülleri yetersiz konsantrasyonla analiz ederken veya kalabalık hücresel ortamlarda nadir olaylar olduğunda, korelatif yaklaşımların kullanıldığını ima ederken zorlayıcı hale gelir12. Ayrıca, mevcut iş akışları, daha sonra otomatik edinme sırasında hedefin hassas yerelleştirilmesi ve merkezlenmesi için kullanılacak çeşitli büyütmelerde kurulum sırasında görüntülerin alınmasını gerektirir11,13,14. Bu yüksek hassasiyetli yeniden hizalama adımları, görüntülemenin yüksek büyütmede gerçekleştirilmesini gerektiren ve ortaya çıkan küçük görüş alanında ilgi alanını korumak için doğru merkezleme adımları gerektiren yüksek çözünürlüklü uygulamalar için çok önemlidir. Tem’in eğim serisi alımıyla meşgul olmadığı bu zaman alıcı prosedür için her veri toplama seansının birkaç saati taahhüt edilir. Bu nedenle, gereken eğim serisinin miktarına bağlı olarak, alım noktalarının tanımlanması ve kurulması, bir cryoET oturumu sırasında veri toplama için mevcut mikroskop süresi üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir.
Burada açıklanan, gridleri haritalamak, ızgara karelerini eşlemek, hedefleri seçmek ve büyük ölçekli eğim serisi koleksiyonu için otomatik veri toplamayı ayarlamak için SerialEM yazılım paketi15 ve pyem yazılım16’nın en son sürümüne dayalı optimize edilmiş bir protokoldür. Bu yaklaşımın temel konsepti, Hedefin doğru yerelleştirilmesi ve ortalanması için sanal haritalar olarak adlandırdığı her edinme öğesi için PyEM tarafından hesaplamalı olarak oluşturulan görüntüler sağlamaktır. Gerçek satın alma süresi kazanmak için, hedeflerin seçimi ve sanal haritaların oluşturulması, SerialEM’in ikinci bir kukla örneği kullanılarak devre dışı gerçekleştirilir ve TEM operasyonlarından satın alma hedeflerinin seçim süreci ayrılırken. Veri kalitesinin nasıl artırılacağı ele alınmamakla birlikte13,17 veya eğim serisi edinme hızı18,19, bu protokol öncelikle büyük ölçekli otomatik cryoET oturumları kurulumunun zaman verimliliğini optimize etmek için stratejilere odaklanmıştır. Bu nedenle, sunulan protokolün uygulanması, tilt serisi alımı için mevcut mikroskop süresini artırarak otomatik veri toplama verimini en üst düzeye çıkarmak isteyen cryoET veri toplama iş akışları kuran bilim adamları içindir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Niş bir teknikten, cryoET artık hücresel ve moleküler düzeyde yapısal çalışmalar yapmak için yaygın bir yönteme dönüştü ve benzeri görülmemiş ulaşılabilir çözünürlük21,22. CryoEM görüntülemeye olan sürekli artan talep, bu teknolojiye erişmek için mevcut sınırlı kaynaklara baskı yaptı. Bir dizi ulusal kriyoEM tesisinin açılmasına ve bilim enstitülerinin dünya çapında toplumun ihtiyaçlarını desteklemek için TEM kapasitelerini artırma çabalarına rağmen, cryoEM araçlarına erişim hala sınırlıdır ve bu nedenle veri toplama için mevcut süre, kullanıcılar tarafından her mikroskopi seansının verimini en üst düzeye çıkarmak için verimli bir şekilde kullanılmalıdır. Veri toplama için mevcut sınırlı süre ile birlikte yüzlerce eğim serisi edinme ihtiyacı, veri kalitesinden ödün vermeden daha iyi verim elde etmek için yeni görüntü toplama rutinleri çağrısında bulundu. Donanım ve görüntüleme iş akışlarındaki son gelişmeler, eğim serisi edinme hızını önemli ölçüde artırdı18,19, böylece bir alım noktası kurmak için harcanan zaman ile gerçek eğim serisi alımı için gereken zaman arasındaki oranın dramatik bir şekilde değişmesine neden oldu. Tamamen, satın alma noktaları kurma prosedürü, cryoET oturumlarının ulaşılabilir verimi için en büyük darboğazlardan biri haline geliyor.
Burada sunulan optimize edilmiş protokol, mikroskop diğer işlemlerde (ör. kare haritalama, ayarlama ve otomatik eğim serisi alımı) aktif olarak çalışırken, bir cryoET oturumunun ilk günü içinde otomatik tomografik alım için çevrimdışı modda 171 pozisyon kurmamızı sağladı, böylece veri toplama için mevcut mikroskop süresini etkilemeden. Bir cryoET oturumunun aktarım hızını en üst düzeye çıkarmanın yanı sıra, bu işlem hattı, kullanıcı tarafından otomatik veri toplama oturumunun hazırlık aşamasında harcanan süreyi önemli ölçüde azaltır. Açıklanan protokolde, kullanıcıdan uygun ilgi alanlarını belirlemek ve bunları seri em gezginine alım noktaları olarak eklemek için eşlenen ızgara karelerine göz atmaları istenir. Daha sonra tüm hedefler, sanal haritaların üretimi için PyEM aracı tarafından SerialEM içinde toplu olarak otomatik olarak işlenir16. Bu nedenle, sunulan hesaplama yaklaşımı, sahne hareketi, görüntü alma, Görüntüleme ve Önizleme arasındaki görüntüleme koşullarının değiştirilmesi ve yüksek büyütmeyi merkezlerken bu adımların nihai tekrarlanmasıyla ilişkili bekleme sürelerini ortadan kaldırarak gerçek bağlantı haritalarını almaktan önemli ölçüde daha hızlıdır. Ek olarak, edinilen her görüntü ilgi çekici nesne üzerinde elektron dozu birikmesine yol açtığından23, hedeflerin hassas yeniden düzenlenmesi için sanal haritaların kullanılması, gerçek eğim serisi alımından önce bir cryoET seansının hazırlık aşamasında ortaya konan radyasyon hasarını azaltır. Burada açıklanan protokol, eğim serisi alımından önce hedefin yeniden hizalanması için hem orta hem de yüksek büyütme sanal haritalarını (sırasıyla Önizleme ve Görünüm) kullanır. Bu yordam kolayca sadece ara büyütme görüntüyü kullanmak için değiştirilebilir Hizalama doğruluğu daha az önemli olduğunda, örneğin, nihai hedef doğruluğunun daha az endişe verici olduğu büyük yapılar söz konusu olduğunda10 veya her alım noktasının kullanıcının manuel seçimini gerektiren kriyo ızgarasına kötü yayılmış tek parçacık analizi örnekleri için24, 25. Son olarak, sahte bir SerialEM örneğinin off-line kullanımına dayanan bir yaklaşım, kullanıcının mikroskoptaki fiziksel varlığı ihtiyacını en aza indirerek uzaktan bağlantı yoluyla alım noktalarının kurulumunu kolaylaştırır ve böylece tesisin operasyonel organizasyonu açısından daha fazla esneklik sağlar.
CryoET için teknoloji ve yöntemlerdeki son gelişmeler, otomatik veri toplama oturumlarının hızını ve güvenilirliğini büyük ölçüde artırdı. Ancak, bu yöntemin kalan hız sınırlayıcı adımlarını ele almak için daha fazla gelişme gerekir. En önemlisi, ızgara ve kare haritalamanın ilk adımı artık oturum kurulumunun en büyük darboğazlarından biri haline geliyor ve böylece mikroskop aşaması hareketlerinin hızını ve doğrudan elektron dedektörleri tarafından görüntü alımını artırmayı amaçlayan donanım iyileştirmelerine ihtiyaç duyuyor. Ayrıca, hedef tanımlama sürecini tamamen otomatikleştirmek için makine öğrenimi yaklaşımlarının geliştirilmesi, kullanıcıların uzmanlığına dayanan zaman alıcı bir prosedür olan ilgi alanlarını seçmek için kullanıcıların görsel inceleme ihtiyacını ortadan kaldırmak için çok önemli olacaktır.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Heidelberg, Almanya’daki Avrupa Moleküler Biyoloji Laboratuvarı’ndaki Yapısal ve Hesaplamalı Biyoloji Birimi ve Elektron Mikroskopi Çekirdek Tesisi’nden ve iNEXT-Discovery’den (proje numarası 871037) destek kabul ediyoruz. SerialEM yazılım paketinin yazarı Profesör David Mastronarde’nin mükemmel desteği için son derece minnettarız. Ayrıca herman Fung’a makalenin eleştirel okuması için teşekkür ederiz.
Materials
| Transmission Electron Microscope | Our protocol is only based on computational workflows. The user will only need acess to a TEM of any kind |
References
- Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryo-electron microscopy of viruses. Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).
- Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
- Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. Structural studies by electron tomography: From Cells to Molecules. Annual Review of Biochemistry. 74 (1), 833-865 (2005).
- Pfeffer, S., Mahamid, J. Unravelling molecular complexity in structural cell biology. Current Opinion in Structural Biology. 52, 111-118 (2018).
- Schur, F. K. M. Toward high-resolution in situ structural biology with cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Current Opinion in Structural Biology. 58, 1-9 (2019).
- Bohning, J., Bharat, T. A. M. Towards high-throughput in situ structural biology using electron cryotomography. Progress in Biophysics and Molecular Biology. , (2020).
- Briggs, J. A. Structural biology in situ–the potential of subtomogram averaging. Current Opinion in Structural Biology. 23 (2), 261-267 (2013).
- Wan, W., Briggs, J. A. G. . Methods in Enzymology. 579, 329-367 (2016).
- Tan, Y. Z., Cheng, A., Potter, C. S., Carragher, B. Automated data collection in single particle electron microscopy. Microscopy. 65 (1), 43-56 (2016).
- Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. Using Tomoauto: A protocol for high-throughput automated cryo-electron tomography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (107), e53608 (2016).
- Resch, G. P. . Methods in Cell Biology. 152, 135-178 (2019).
- Bharat, T. A., Kukulski, W. . Correlative Imaging: Focusing on the Future. , 137-153 (2019).
- Hagen, W. J. H., Wan, W., Briggs, J. A. G. Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging. Journal of Structural Biology. 197 (2), 191-198 (2017).
- O’Toole, E., vander Heide, P., McIntosh, R. J., Mastronarde, D. . Cellular Imaging: Electron Tomography and Related Techniques. , 95-116 (2018).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16, 471-477 (2019).
- Turonova, B., et al. Benchmarking tomographic acquisition schemes for high-resolution structural biology. Nature Communications. 11 (1), 876 (2020).
- Chreifi, G., Chen, S., Metskas, L. A., Kaplan, M., Jensen, G. J. Rapid tilt-series acquisition for electron cryotomography. Journal of Structural Biology. 205 (2), 163-169 (2019).
- Eisenstein, F., Danev, R., Pilhofer, M. Improved applicability and robustness of fast cryo-electron tomography data acquisition. Journal of Structural Biology. 208 (2), 107-114 (2019).
- Turonova, B., et al. In situ structural analysis of SARS-CoV-2 spike reveals flexibility mediated by three hinges. Science. 370 (6513), 203-208 (2020).
- O’Reilly, F. J., et al. In-cell architecture of an actively transcribing-translating expressome. Science. 369 (6503), 554-557 (2020).
- Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.7 Å inside cells. Nature Methods. 18, 186-193 (2020).
- Karuppasamy, M., Karimi Nejadasl, F., Vulovic, M., Koster, A. J., Ravelli, R. B. G. Radiation damage in single-particle cryo-electron microscopy: effects of dose and dose rate. Journal of Synchrotron Radiation. 18 (3), 398-412 (2011).
- Liberta, F., et al. Cryo-EM fibril structures from systemic AA amyloidosis reveal the species complementarity of pathological amyloids. Nature Communications. 10 (1), 1104 (2019).
- Radamaker, L., et al. Cryo-EM structure of a light chain-derived amyloid fibril from a patient with systemic AL amyloidosis. Nature Communications. 10 (1), 1103 (2019).
