Стратегии оптимизации сбора данных криогенной электронной томографии
Summary
Растущий спрос на крупномасштабный сбор данных в криогенной электронной томографии требует высокопроизводительных процедур получения изображений. Здесь описан протокол, который реализует последние разработки передовых стратегий сбора, направленных на максимизацию эффективности времени и пропускной способности сбора томографических данных.
Abstract
Криогенная электронная томография (криоЭТ) является мощным методом изучения 3D-структуры биологических образцов в близком к родному состоянию. Современное состояние криоЭТ в сочетании с анализом усреднения субтомограмм позволяет определять структуры макромолекулярных комплексов с высоким разрешением, которые присутствуют в нескольких копиях в томографических реконструкциях. Томографические эксперименты обычно требуют получения огромного количества наклонных рядов с помощью высококачественных просвечивающих электронных микроскопов с важными эксплуатационными расходами. Хотя пропускная способность и надежность автоматизированных процедур сбора данных постоянно улучшались в последние годы, процесс выбора интересующих регионов, в которых будет получен ряд наклонов, не может быть легко автоматизирован, и он по-прежнему зависит от ручного ввода пользователя. Таким образом, настройка крупномасштабного сеанса сбора данных является трудоемкой процедурой, которая может значительно сократить оставшееся время микроскопа, доступное для получения серии наклона. Здесь протокол описывает недавно разработанные реализации, основанные на пакете SerialEM и программном обеспечении PyEM, которые значительно повышают временную эффективность скрининга сетки и крупномасштабного сбора данных о сериях наклона. Представленный протокол иллюстрирует, как использовать функциональные возможности сценариев SerialEM для полной автоматизации сопоставления сетки, сопоставления квадратов сетки и получения рядов наклона. Кроме того, протокол описывает, как использовать PyEM для выбора дополнительных целей сбора в режиме off-line после начала автоматического сбора данных. Чтобы проиллюстрировать этот протокол, описано его применение в контексте сбора высококачественных данных серии наклона Sars-Cov-2. Представленный конвейер особенно подходит для максимизации временной эффективности томографических экспериментов, которые требуют тщательного выбора целей сбора и в то же время большого количества наклонных рядов, которые необходимо собрать.
Introduction
Методы криогенной электронной микроскопии (криоЭМ) основаны на визуализации биологических образцов с помощью просвечивающих электронных микроскопов (ТЭМ) после их быстрой витрификации, процесса пробоподготовки, который сохраняет молекулярные и клеточные структуры образцов в близком к нативном и гидратированном состоянии1,2. В криогенной электронной томографии (криоЭТ) 3D-модель остеклованного образца достигается путем получения ряда изображений одной и той же интересующей области из разных ориентаций, так называемого наклонного ряда, с последующей вычислительной реконструкцией томографического тома3. Этот передовой метод визуализации превратился в мощный метод структурного исследования биологических процессов в контексте их нативных клеточных сред4,5,6.
Помимо ультраструктурного анализа остеклованного образца, реконструкции высокоместных макромолекулярных комплексов, присутствующих в нескольких копиях в пределах томографического объема, могут быть получены путем применения субтомограммы в среднем5. Этот подход к реконструкции основан на итеративном выравнивании и усреднении подтомов, содержащих интересующую структуру, и направлен на увеличение отношения сигнал/шум и разрешения окончательной реконструкции7,8. Усреднение субтомограммы зависит от сбора и обработки большого объема данных, что часто требует получения сотен наклонных рядов с помощью высококачественных ТЭМ с обременительными эксплуатационными расходами.
В настоящее время настройка таких автоматизированных сеансов криоЭТ является трудоемким процессом, который обычно опирается на ручной ввод пользователя9,10,11. Как правило, цели идентифицируются путем визуального осмотра картографированной сетки и впоследствии настраиваются для автоматизированного сбора данных. На эффективность пользователя в выявлении точек сбора часто влияет характер образца, что становится особенно сложным при анализе очищенных макромолекул с неоптимальной концентрацией или в случае редких событий в переполненных клеточных средах, подразумевая использование коррелятивных подходов12. Кроме того, текущие рабочие процессы требуют получения изображений во время настройки при различных увеличениях, которые впоследствии будут использоваться для точной локализации и центрирования цели при автоматизированном сборе11,13,14. Эти высокоточные шаги повторного выравнивания имеют решающее значение для приложений с высоким разрешением, которые требуют, чтобы изображение выполнялось при высоком увеличении и требуют точных шагов центрирования для удержания интересующей области в результирующем небольшом поле зрения. В общей сложности для этой трудоемкой процедуры, в течение которой ТЕА не занимается сбором рядов наклона, отводится несколько часов каждого сеанса сбора данных. Поэтому, в зависимости от количества требуемых серий наклона, идентификация и настройка точек сбора может оказать значительное влияние на время микроскопа, доступное для сбора данных во время сеанса криоЭТ.
Здесь описан оптимизированный протокол, основанный на программном пакете SerialEM15 и последней версии программного обеспечения PyEM16 для отображения сеток, отображения квадратов сетки, выбора целей и настройки автоматического сбора данных для крупномасштабного сбора серий наклона. Ключевая концепция этого подхода заключается в предоставлении SerialEM вычислительно сгенерированных изображений PyEM для каждого элемента сбора, так и называется виртуальными картами, для точной локализации и центрирования цели. Чтобы получить фактическое время сбора, выбор целей, а также создание виртуальных карт выполняются в режиме off-line с использованием второго фиктивного экземпляра SerialEM, отделяя процесс выбора целей сбора от операций TEM. Хотя этот протокол не рассматривает способ повышения качества данных13,17 или скорость получения18,19серийнаклона,этот протокол в первую очередь ориентирован на стратегии оптимизации временной эффективности крупномасштабной автоматизированной настройки сеансов криоЭТ. Таким образом, реализация представленного протокола предназначена для тех ученых, которые создают рабочие процессы сбора данных cryoET, которые хотят максимизировать выход автоматизированного сбора данных за счет увеличения времени микроскопа, доступного для сбора клоновых рядов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Из нишевой техники криоЭТ в настоящее время превратился в широко распространенный метод для выполнения структурных исследований на клеточном и молекулярном уровне с беспрецедентным достижимым разрешением21,22. Постоянно растущий спрос на криоЭМ-визуализацию создает нагрузку на ограниченные ресурсы, доступные для доступа к этой технологии. Несмотря на открытие ряда национальных установок криоЭМ и усилия научных институтов по наращиванию своего потенциала в области ТЕА для удовлетворения потребностей сообщества во всем мире, доступ к криоЭМ-приборам по-прежнему ограничен, и поэтому пользователи должны эффективно использовать время, имеемое для сбора данных, для максимального увеличения отдачи от каждого сеанса микроскопии. Необходимость получения сотен наклонных рядов в сочетании с ограниченным временем, доступным для сбора данных, потребовала новых процедур сбора изображений для достижения лучшей пропускной способности без ущерба для качества данных. Последние разработки в области аппаратного обеспечения и рабочих процессов обработки изображений значительно увеличили скорость захвата серий tilt18,19,что привело к резкому смещению соотношения между временем, затраченным на установку точки сбора, и временем, необходимым для фактического приобретения серии tilt. В целом, процедура создания точек сбора становится одним из основных узких мест для достижимой пропускной способности сеансов cryoET.
Оптимизированный протокол, представленный здесь, позволил нам настроить в режиме off-line 171 позицию для автоматического томографического сбора в течение первого дня сеанса криоЭТ, в то время как микроскоп активно участвовал в других операциях (например, квадратное картирование, настройка и автоматическое получение рядов наклона), таким образом, не влияя на время микроскопа, доступное для сбора данных. В дополнение к максимизации пропускной способности сеанса cryoET, этот конвейер значительно сокращает время, затрачиваемое пользователем на подготовительный этап сеанса автоматизированного сбора данных. В описанном протоколе пользователю предлагается просмотреть сопоставленные квадраты сетки, чтобы определить подходящие области, представляющие интерес, и добавить их в Serial EM Navigator в качестве точек сбора. Затем все цели будут автоматически обработаны пакетно в SerialEM инструментом PyEM для производства виртуальных карт16. Таким образом, представленный вычислительный подход значительно быстрее, чем получение реальных карт привязки, за счет устранения периодов ожидания, связанных с движением стадии, получением изображения, изменением условий изображения между просмотром и предварительным просмотром, а также путем возможного повторения этих шагов при центрировании при высоком увеличении. Кроме того, поскольку каждое полученное изображение приводит к накоплению электронной дозы на интересуемом объекте23,использование виртуальных карт для точной перестройки целей уменьшает радиационный ущерб, наносимый на подготовительном этапе сеанса криоЭТ перед фактическим получением серии наклона. Протокол, описанный здесь, использует виртуальные карты как промежуточного, так и высокого увеличения (Preview и View, соответственно) для перестройки цели перед получением серии наклона. Эта процедура может быть легко изменена для использования только промежуточного увеличения View image, когда точность выравнивания имеет меньшее значение, например, в случае крупных структур, где конечная точность цели имеет меньшее значение10, или для образцов анализа одиночных частиц, которые плохо распределены по криотрешетке, требуя ручного выбора пользователем каждой точки сбора24, 25 г. Наконец, подход, основанный на использовании в режиме онлайн фиктивного экземпляра SerialEM, также облегчает настройку точек сбора через удаленное соединение, сводя к минимуму необходимость физического присутствия пользователя у микроскопа, что обеспечивает большую гибкость с точки зрения оперативной организации объекта.
Последние достижения в области технологий и методов криоЭТ значительно повысили скорость и надежность автоматизированных сеансов сбора данных. Однако для решения остальных этапов ограничения скорости этого метода необходимы дальнейшие разработки. В частности, начальный этап картографирования сетки и квадратов в настоящее время становится одним из основных узких мест в настройке сеанса, что создает необходимость в аппаратных улучшениях, направленных на увеличение скорости движений ступени микроскопа и получения изображения прямыми электронными детекторами. Кроме того, разработка подходов машинного обучения для полной автоматизации процесса идентификации целей будет иметь решающее значение для устранения необходимости визуального осмотра пользователей для выбора интересующих регионов, что является трудоемкой процедурой, которая опирается на опыт пользователей.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признаем поддержку со стороны Отдела структурной и вычислительной биологии и Центра электронной микроскопии в Европейской лаборатории молекулярной биологии в Гейдельберге, Германия, и iNEXT-Discovery (номер проекта 871037). Мы чрезвычайно благодарны за отличную поддержку автору программного пакета SerialEM, профессору Дэвиду Мастронарде. Мы также благодарим Германа Фунга за критическое прочтение рукописи.
Materials
| Transmission Electron Microscope | Our protocol is only based on computational workflows. The user will only need acess to a TEM of any kind |
References
- Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryo-electron microscopy of viruses. Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).
- Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
- Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. Structural studies by electron tomography: From Cells to Molecules. Annual Review of Biochemistry. 74 (1), 833-865 (2005).
- Pfeffer, S., Mahamid, J. Unravelling molecular complexity in structural cell biology. Current Opinion in Structural Biology. 52, 111-118 (2018).
- Schur, F. K. M. Toward high-resolution in situ structural biology with cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Current Opinion in Structural Biology. 58, 1-9 (2019).
- Bohning, J., Bharat, T. A. M. Towards high-throughput in situ structural biology using electron cryotomography. Progress in Biophysics and Molecular Biology. , (2020).
- Briggs, J. A. Structural biology in situ–the potential of subtomogram averaging. Current Opinion in Structural Biology. 23 (2), 261-267 (2013).
- Wan, W., Briggs, J. A. G. . Methods in Enzymology. 579, 329-367 (2016).
- Tan, Y. Z., Cheng, A., Potter, C. S., Carragher, B. Automated data collection in single particle electron microscopy. Microscopy. 65 (1), 43-56 (2016).
- Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. Using Tomoauto: A protocol for high-throughput automated cryo-electron tomography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (107), e53608 (2016).
- Resch, G. P. . Methods in Cell Biology. 152, 135-178 (2019).
- Bharat, T. A., Kukulski, W. . Correlative Imaging: Focusing on the Future. , 137-153 (2019).
- Hagen, W. J. H., Wan, W., Briggs, J. A. G. Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging. Journal of Structural Biology. 197 (2), 191-198 (2017).
- O’Toole, E., vander Heide, P., McIntosh, R. J., Mastronarde, D. . Cellular Imaging: Electron Tomography and Related Techniques. , 95-116 (2018).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16, 471-477 (2019).
- Turonova, B., et al. Benchmarking tomographic acquisition schemes for high-resolution structural biology. Nature Communications. 11 (1), 876 (2020).
- Chreifi, G., Chen, S., Metskas, L. A., Kaplan, M., Jensen, G. J. Rapid tilt-series acquisition for electron cryotomography. Journal of Structural Biology. 205 (2), 163-169 (2019).
- Eisenstein, F., Danev, R., Pilhofer, M. Improved applicability and robustness of fast cryo-electron tomography data acquisition. Journal of Structural Biology. 208 (2), 107-114 (2019).
- Turonova, B., et al. In situ structural analysis of SARS-CoV-2 spike reveals flexibility mediated by three hinges. Science. 370 (6513), 203-208 (2020).
- O’Reilly, F. J., et al. In-cell architecture of an actively transcribing-translating expressome. Science. 369 (6503), 554-557 (2020).
- Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.7 Å inside cells. Nature Methods. 18, 186-193 (2020).
- Karuppasamy, M., Karimi Nejadasl, F., Vulovic, M., Koster, A. J., Ravelli, R. B. G. Radiation damage in single-particle cryo-electron microscopy: effects of dose and dose rate. Journal of Synchrotron Radiation. 18 (3), 398-412 (2011).
- Liberta, F., et al. Cryo-EM fibril structures from systemic AA amyloidosis reveal the species complementarity of pathological amyloids. Nature Communications. 10 (1), 1104 (2019).
- Radamaker, L., et al. Cryo-EM structure of a light chain-derived amyloid fibril from a patient with systemic AL amyloidosis. Nature Communications. 10 (1), 1103 (2019).
