Strategien zur Optimierung der Datenerfassung in der Kryoelektronentomographie
Summary
Die steigende Nachfrage nach großflächiger Datenerfassung in der kryogenen Elektronentomographie erfordert Bilderfassungsroutinen mit hohem Durchsatz. Hier wird ein Protokoll beschrieben, das die jüngsten Entwicklungen fortschrittlicher Akquisitionsstrategien implementiert, die darauf abzielen, die Zeiteffizienz und den Durchsatz der tomographischen Datenerfassung zu maximieren.
Abstract
Die kryogene Elektronentomographie (CryoET) ist eine leistungsfähige Methode, um die 3D-Struktur biologischer Proben in einem nativen Zustand zu untersuchen. Der aktuelle Stand der Technik CryoET in Kombination mit der Subtomogramm-Mittelungsanalyse ermöglicht die hochauflösende strukturelle Bestimmung makromolekularer Komplexe, die in mehreren Kopien innerhalb tomographischer Rekonstruktionen vorhanden sind. Tomographische Experimente erfordern in der Regel eine große Menge an Neigungsreihen, die mit High-End-Transmissionselektronenmikroskopen mit erheblichen Betriebskosten erfasst werden müssen. Obwohl sich der Durchsatz und die Zuverlässigkeit automatisierter Datenerfassungsroutinen in den letzten Jahren ständig verbessert haben, kann der Prozess der Auswahl von Regionen von Interesse, in denen eine Neigungsreihe erfasst wird, nicht einfach automatisiert werden und ist immer noch auf die manuelle Eingabe des Benutzers angewiesen. Daher ist der Aufbau einer groß angelegten Datenerfassungssitzung ein zeitaufwändiges Verfahren, das die verbleibende Mikroskopzeit, die für die Erfassung von Neigungsreihen zur Verfügung steht, erheblich reduzieren kann. Hier beschreibt das Protokoll die kürzlich entwickelten Implementierungen auf Basis des SerialEM-Pakets und der PyEM-Software, die die Zeiteffizienz des Grid-Screenings und der großflächigen Tilt-Series-Datenerfassung deutlich verbessern. Das vorgestellte Protokoll veranschaulicht, wie SerialEM-Skriptfunktionen verwendet werden, um die Rasterzuordnung, die Rasterquadratzuordnung und die Erfassung von Neigungsreihen vollständig zu automatisieren. Darüber hinaus beschreibt das Protokoll, wie PyEM verwendet wird, um zusätzliche Erfassungsziele im Offline-Modus auszuwählen, nachdem die automatisierte Datenerfassung initiiert wurde. Zur Veranschaulichung dieses Protokolls wird seine Anwendung im Rahmen der High-End-Datenerfassung der Sars-Cov-2-Neigungsserie beschrieben. Die vorgestellte Pipeline eignet sich besonders zur Maximierung der Zeiteffizienz von Tomographie-Experimenten, die eine sorgfältige Auswahl von Erfassungszielen und gleichzeitig eine große Menge an zu sammelnden Neigungsreihen erfordern.
Introduction
Kryogene Elektronenmikroskopie (CryoEM) Methoden basieren auf der Abbildung biologischer Proben mittels eines Transmissionselektronenmikroskops (TEM) nach ihrer schnellen Vitrifikation, einem Probenvorbereitungsverfahren, das die molekularen und zellulären Strukturen von Proben in einem nahezu nativen und hydratisierten Zustand bewahrt1,2. In der kryogenen Elektronentomographie (CryoET) wird ein 3D-Modell der verglasten Probe erreicht, indem eine Reihe von Bildern derselben Region von Interesse aus verschiedenen Orientierungen, die sogenannte Tilt-Serie, entnommen wird, gefolgt von der rechnerischen Rekonstruktion des tomographischen Bandes3. Diese fortschrittliche Bildgebungstechnik hat sich zu einer leistungsfähigen Methode zur strukturellen Untersuchung biologischer Prozesse im Kontext ihrer nativen zellulären Umgebung entwickelt4,5,6.
Neben der ultrastrukturellen Analyse der vitrifizierten Probe können hochauflösende Rekonstruktionen makromolekularer Komplexe, die in mehreren Kopien innerhalb des tomographischen Volumens vorhanden sind, durch Anwendung des Subtomogramms mit einem Mittelwert von5erhalten werden. Dieser Rekonstruktionsansatz basiert auf der iterativen Ausrichtung und Mittelung von Teilvolumina, die die interessierende Struktur enthalten, und zielt darauf ab, das Signal-Rausch-Verhältnis und die Auflösung der endgültigen Rekonstruktion7,8zu erhöhen. Die Subtomogramm-Mittelung beruht auf der Erfassung und Verarbeitung einer großen Datenmenge, die oft die Erfassung von Hunderten von Neigungsserien mittels High-End-TEMs mit belastenden Betriebskosten erfordert.
Derzeit ist die Einrichtung solcher automatisierten CryoET-Sitzungen ein zeitaufwändiger Prozess, der in der Regel auf der manuellen Eingabe des Benutzers9,10,11beruht. Typischerweise werden Ziele durch visuelle Inspektion des abgebildeten Rasters identifiziert und anschließend für die automatisierte Datenerfassung eingerichtet. Die Effizienz des Benutzers bei der Identifizierung von Erfassungspunkten wird oft von der Art der Probe beeinflusst, was bei der Analyse gereinigter Makromoleküle mit suboptimaler Konzentration oder bei seltenen Ereignissen in überfüllten zellulären Umgebungen besonders schwierig wird, was die Verwendung korrelativer Ansätze impliziert12. Darüber hinaus erfordern aktuelle Workflows die Erfassung von Bildern während des Aufbaus mit verschiedenen Vergrößerungen, die später für die präzise Lokalisierung und Zentrierung des Ziels während der automatisierten Erfassung verwendet werden11,13,14. Diese hochpräzisen Re-Alignment-Schritte sind entscheidend für hochauflösende Anwendungen, die eine hohe Vergrößerung der Bildgebung erfordern und genaue Zentrierungsschritte erfordern, um den interessierenden Bereich innerhalb des resultierenden kleinen Sichtfelds zu halten. Insgesamt werden mehrere Stunden jeder Datenerfassungssitzung für diesen zeitaufwändigen Vorgang festgelegt, bei dem das TEM nicht an der Erfassung von Neigungsreihen beteiligt ist. Abhängig von der Menge der erforderlichen Neigungsreihen kann die Identifizierung und Einrichtung von Erfassungspunkten daher einen erheblichen Einfluss auf die Mikroskopzeit haben, die für die Datenerfassung während einer KryoET-Sitzung zur Verfügung steht.
Hier wird ein optimiertes Protokoll beschrieben, das auf dem SerialEM-Softwarepaket15 und der neuesten Version der PyEM-Software16 basiert, um Raster zu kartieren, Rasterquadrate abzubilden, Ziele auszuwählen und automatisierte Datenerfassung für die Erfassung großflächiger Neigungsserien einzurichten. Das Schlüsselkonzept dieses Ansatzes besteht darin, SerialEM für jedes Erfassungselement rechnerisch generierte Bilder von PyEM zur Verfügung zu stellen, die als virtuelle Karten bezeichnet werden, um das Ziel genau zu lokalisieren und zu zentrieren. Um die tatsächliche Erfassungszeit zu gewinnen, erfolgt die Auswahl der Ziele sowie die Erstellung der virtuellen Karten offline mit einer zweiten Dummy-Instanz von SerialEM, wodurch der Auswahlprozess der Erfassungsziele von TEM-Operationen entkoppelt wird. Obwohl nicht daraufeingeht,wie die Datenqualität13,17 oder die Geschwindigkeit der Erfassung der Tilt-Serie18,19erhöht werden kann, konzentriert sich dieses Protokoll in erster Linie auf Strategien zur Optimierung der Zeiteffizienz der Einrichtung großer automatisierter KryoET-Sitzungen. Daher ist die Implementierung des vorgestellten Protokolls für diejenigen Wissenschaftler gedacht, die KryoET-Datenerfassungs-Workflows einrichten, die die Ausbeute der automatisierten Datenerfassung maximieren möchten, indem sie die für die Erfassung von Neigungsreihen verfügbare Mikroskopzeit erhöhen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Von einer Nischentechnik ist CryoET nun zu einer weit verbreiteten Methode gereift, um Strukturstudien auf zellulärer und molekularer Ebene mit beispiellos erreichbarer Auflösung21,22durchzuführen. Die ständig steigende Nachfrage nach KryoEM-Bildgebung hat die begrenzten Ressourcen, die für den Zugang zu dieser Technologie zur Verfügung stehen, belastet. Trotz der Eröffnung einer Reihe nationaler KryoEM-Einrichtungen und der Bemühungen wissenschaftlicher Institute, ihre TEM-Kapazität zu erhöhen, um die Bedürfnisse der Gemeinschaft weltweit zu unterstützen, ist der Zugang zu KryoEM-Instrumenten immer noch begrenzt und die für die Datenerhebung verfügbare Zeit muss daher von den Benutzern effizient genutzt werden, um den Ertrag jeder Mikroskopiesitzung zu maximieren. Die Notwendigkeit, Hunderte von Tilt-Serien in Kombination mit der begrenzten Zeit für die Datenerfassung zu erwerben, erforderte neuartige Bilderfassungsroutinen, um einen besseren Durchsatz zu erzielen, ohne die Datenqualität zu beeinträchtigen. Jüngste Entwicklungen in Hardware- und Imaging-Workflows haben die Geschwindigkeit der Tilt-Series-Erfassung18,19erheblicherhöht,was zu einer dramatischen Verschiebung des Verhältnisses zwischen der Zeit, die für die Einrichtung eines Erfassungspunkts aufgewendet wird, und der Zeit, die für die eigentliche Tilt-Series-Erfassung benötigt wird, geführt hat. Insgesamt wird das Verfahren zur Einrichtung von Erfassungspunkten zu einem der größten Engpässe für den erreichbaren Durchsatz von KryoET-Sitzungen.
Das hier vorgestellte optimierte Protokoll ermöglichte es uns, im Offline-Modus 171 Positionen für die automatisierte tomographische Erfassung innerhalb des ersten Tages einer KryoET-Sitzung einzurichten, während das Mikroskop aktiv an anderen Operationen beteiligt war (z. B. Quadratische Kartierung, Tuning und automatisierte Neigungsreihenerfassung), ohne die für die Datenerfassung verfügbare Mikroskopzeit zu beeinträchtigen. Neben der Maximierung des Durchsatzes einer KryoET-Sitzung reduziert diese Pipeline den Zeitaufwand des Benutzers in der Vorbereitungsphase einer automatisierten Datenerfassungssitzung drastisch. Im beschriebenen Protokoll wird der Benutzer aufgefordert, die abgebildeten Rasterquadrate zu durchsuchen, um geeignete Bereiche von Interesse zu identifizieren und sie dem Serial EM Navigator als Erfassungspunkte hinzuzufügen. Alle Ziele werden dann automatisch im Batch innerhalb von SerialEM vom PyEM-Tool für die Erstellung der virtuellen Karten16verarbeitet. Der vorgestellte Berechnungsansatz ist daher wesentlich schneller als die Erfassung echter Verankerungskarten, indem die Wartezeiten eliminiert werden, die mit Bühnenbewegung, Bildaufnahme, Änderung der Bildgebungsbedingungen zwischen Ansicht und Vorschau verbunden sind, und durch die eventuelle Wiederholung dieser Schritte bei zentrierung bei hoher Vergrößerung. Da jedes aufgenommene Bild zur Anhäufung der Elektronendosis auf dem Objekt von Interesse23führt, reduziert die Verwendung virtueller Karten zur präzisen Neuausrichtung der Ziele die Strahlungsschäden, die in der Vorbereitungsphase einer KryoET-Sitzung vor der eigentlichen Neigungsreihenerfassung entstehen. Das hier beschriebene Protokoll verwendet sowohl virtuelle Karten mit mittlerer als auch mit hoher Vergrößerung (Vorschau bzw. Ansicht) für die Neuausrichtung des Ziels vor der Erfassung der Neigungsreihe. Dieses Verfahren kann leicht dadurch modifiziert werden, dass nur das Bild mit mittlerer Vergrößerung verwendet wird, wenn die Ausrichtungsgenauigkeit von geringerer Bedeutung ist, z. B. bei großen Strukturen, bei denen die endgültige Zielgenauigkeit weniger wichtig ist10 oder bei Einzelpartikelanalyseproben, die schlecht auf dem Kryogitter verteilt sind und die manuelle Auswahl jedes Erfassungspunkts durch den Benutzererfordern 24. ( 25) DER PRÄSIDENT. – Nach der 25 Schließlich erleichtert ein Ansatz, der auf der Offline-Verwendung einer Dummy-SerialEM-Instanz basiert, auch die Einrichtung von Erfassungspunkten durch Remote-Verbindung, indem die Notwendigkeit der physischen Anwesenheit des Benutzers am Mikroskop minimiert wird, wodurch mehr Flexibilität in Bezug auf die Betriebsorganisation der Anlage ermöglicht wird.
Die jüngsten Fortschritte in Technologie und Methoden für KryoET haben die Geschwindigkeit und Zuverlässigkeit automatisierter Datenerfassungssitzungen drastisch verbessert. Es sind jedoch weitere Entwicklungen erforderlich, um die verbleibenden ratenbegrenzenden Schritte dieser Methode anzugehen. Vor allem der erste Schritt des Grid- und Square-Mappings wird nun zu einem der größten Engpässe des Sitzungsaufbaus, wodurch die Notwendigkeit von Hardwareverbesserungen entsteht, die darauf abzielen, die Geschwindigkeit der Mikroskop-Bühnenbewegungen und der Bildaufnahme durch die direkten Elektronendetektoren zu erhöhen. Darüber hinaus wird die Entwicklung von Maschinellen Lernansätzen zur vollständigen Automatisierung des Prozesses der Zielidentifikation von entscheidender Bedeutung sein, um die notwendigkeit der visuellen Inspektion der Benutzer für die Auswahl der interessierenden Regionen zu eliminieren, ein zeitaufwendiges Verfahren, das auf dem Fachwissen der Benutzer beruht.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken der Structural and Computational Biology Unit und der Electron Microscopy Core Facility am European Molecular Biology Laboratory in Heidelberg sowie von iNEXT-Discovery (Projektnummer 871037). Wir sind sehr dankbar für die hervorragende Unterstützung durch den Autor des SerialEM-Softwarepakets, Professor David Mastronarde. Wir danken auch Herman Fung für die kritische Lektüre des Manuskripts.
Materials
| Transmission Electron Microscope | Our protocol is only based on computational workflows. The user will only need acess to a TEM of any kind |
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