Stratégies d’optimisation de l’acquisition de données de tomographie électronique cryogénique
Summary
La demande croissante de collecte de données à grande échelle en tomographie électronique cryogénique nécessite des routines d’acquisition d’images à haut débit. Décrit ici est un protocole qui met en œuvre les développements récents de stratégies d’acquisition avancées visant à maximiser l’efficacité du temps et le débit de la collecte de données tomographiques.
Abstract
La tomographie électronique cryogénique (cryoET) est une méthode puissante pour étudier la structure 3D d’échantillons biologiques dans un état proche du natif. Le cryoET de pointe actuel combiné à l’analyse de la moyenne des sous-tomogrammes permet la détermination structurelle à haute résolution des complexes macromoléculaires présents en plusieurs copies dans les reconstructions tomographiques. Les expériences tomographiques nécessitent généralement l’acquisition d’une grande quantité de séries d’inclinaison au moyen de microscopes électroniques à transmission haut de gamme avec des coûts d’exploitation opérationnels importants. Bien que le débit et la fiabilité des routines d’acquisition de données automatisées se soient constamment améliorés au cours des dernières années, le processus de sélection des régions d’intérêt auxquelles une série d’inclinaison sera acquise ne peut pas être facilement automatisé et repose toujours sur la saisie manuelle de l’utilisateur. Par conséquent, la mise en place d’une session de collecte de données à grande échelle est une procédure fastidieuse qui peut réduire considérablement le temps de microscope restant disponible pour l’acquisition de séries d’inclinaison. Ici, le protocole décrit les implémentations récemment développées basées sur le package SerialEM et le logiciel PyEM qui améliorent considérablement l’efficacité temporelle du criblage de grille et de la collecte de données de série d’inclinaison à grande échelle. Le protocole présenté illustre comment utiliser les fonctionnalités de script SerialEM pour automatiser entièrement le mappage de grille, le mappage de carrés de grille et l’acquisition de séries d’inclinaison. En outre, le protocole décrit comment utiliser PyEM pour sélectionner des cibles d’acquisition supplémentaires en mode hors ligne après le lancement de la collecte automatisée des données. Pour illustrer ce protocole, son application dans le contexte de la collecte de données haut de gamme de la série d’inclinaison Sars-Cov-2 est décrite. Le pipeline présenté est particulièrement adapté pour maximiser l’efficacité temporelle des expériences de tomographie qui nécessitent une sélection minutieuse des cibles d’acquisition et en même temps une grande quantité de séries d’inclinaison à collecter.
Introduction
Les méthodes de microscopie électronique cryogénique (cryoEM) sont basées sur l’imagerie d’échantillons biologiques au moyen d’un microscope électronique à transmission (TEM) après leur vitrification rapide, un processus de préparation d’échantillons qui préserve les structures moléculaires et cellulaires des échantillons dans un état proche du natif et hydraté1,2. En tomographie électronique cryogénique (cryoET), un modèle 3D de l’échantillon vitrifié est obtenu en acquérant un certain nombre d’images de la même région d’intérêt à partir de différentes orientations, la série dite d’inclinaison, suivie de la reconstruction computationnelle du volume tomographique3. Cette technique d’imagerie avancée est devenue une méthode puissante pour l’étude structurelle des processus biologiques dans le contexte de leur environnement cellulaire natif4,5,6.
En plus de l’analyse ultrastructurale de l’échantillon vitrifié, des reconstructions à haute résolution de complexes macromoléculaires présents en plusieurs copies dans le volume tomographique peuvent être obtenues en appliquant un sous-tomgramme de5en moyenne . Cette approche de reconstruction est basée sur l’alignement itératif et la moyenne des sous-volumes contenant la structure d’intérêt et vise à augmenter le rapport signal/bruit et la résolution de la reconstruction finale7,8. La moyenne des sous-totogrammes repose sur la collecte et le traitement d’une grande quantité de données qui nécessitent souvent l’acquisition de centaines de séries d’inclinaison au moyen de TLET haut de gamme avec des coûts d’exploitation opérationnels onéreux.
Actuellement, la configuration de telles sessions cryoET automatisées est un processus fastidieux qui repose généralement sur la saisie manuelle de l’utilisateur9,10,11. En règle générale, les cibles sont identifiées par une inspection visuelle de la grille cartographiée, puis configurées pour la collecte automatisée de données. L’efficacité de l’utilisateur dans l’identification des points d’acquisition est souvent affectée par la nature de l’échantillon, devenant particulièrement difficile lors de l’analyse de macromolécules purifiées avec une concentration sous-optimale ou dans le cas d’événements rares dans des environnements cellulaires surpeuplés, impliquant l’utilisation d’approches corrélatives12. En outre, les flux de travail actuels nécessitent l’acquisition d’images lors de la configuration à différents grossissements qui seront ensuite utilisés pour la localisation précise et le centrage de la cible lors de l’acquisition automatisée11,13,14. Ces étapes de réaignement de haute précision sont cruciales pour les applications haute résolution, qui exigent que l’imagerie soit effectuée à fort grossissement et nécessitent des étapes de centrage précises pour conserver la région d’intérêt dans le petit champ de vision qui en résulte. Au total, plusieurs heures de chaque session de collecte de données sont engagées pour cette procédure fastidieuse au cours de laquelle le TEM n’est pas engagé dans l’acquisition de séries d’inclinaisons. Par conséquent, en fonction de la quantité de séries d’inclinaison requises, l’identification et la configuration des points d’acquisition peuvent avoir un impact considérable sur le temps de microscope disponible pour la collecte de données lors d’une session cryoET.
Vous trouverez ici un protocole optimisé basé sur le progiciel SerialEM15 et la dernière version du logiciel PyEM16 pour mapper les grilles, cartographier les carrés de grille, sélectionner des cibles et configurer l’acquisition automatisée de données pour la collecte de séries d’inclinaison à grande échelle. Le concept clé de cette approche est de fournir à SerialEM des images générées par calcul par PyEM pour chaque élément d’acquisition, appelées cartes virtuelles, pour la localisation et le centrage précis de la cible. Pour gagner du temps d’acquisition réel, la sélection des cibles ainsi que la création des cartes virtuelles sont effectuées hors ligne à l’aide d’une deuxième instance fictive de SerialEM, découpliant le processus de sélection des cibles d’acquisition des opérations TEM. Bien qu’il n’aborde pas la façon d’augmenter la qualité des données13,17 ou la vitesse d’acquisition de la série d’inclinaison18,19,ce protocole est principalement axé sur des stratégies visant à optimiser l’efficacité temporelle de la configuration automatisée de sessions cryoET à grande échelle. Par conséquent, la mise en œuvre du protocole présenté est destinée aux scientifiques qui établissent des flux de travail de collecte de données cryoET et qui souhaitent maximiser le rendement de l’acquisition automatisée de données en augmentant le temps de microscope disponible pour l’acquisition de séries d’inclinaison.
Protocol
Representative Results
Discussion
D’une technique de niche, cryoET a maintenant mûri en une méthode répandue pour effectuer des études structurelles au niveau cellulaire et moléculaire avec une résolution atteignable sans précédent21,22. La demande toujours croissante d’imagerie cryoEM a mis à rude épreuve les ressources limitées disponibles pour accéder à cette technologie. Malgré l’ouverture d’un certain nombre d’installations cryoEM nationales et les efforts des instituts scientifiques pour augmenter leur capacité de GDT afin de répondre aux besoins de la communauté dans le monde entier, l’accès aux instruments cryoEM est encore limité et le temps disponible pour la collecte de données doit donc être utilisé efficacement par les utilisateurs pour maximiser le rendement de chaque session de microscopie. La nécessité d’acquérir des centaines de séries d’inclinaison, combinée au temps limité disponible pour la collecte de données, a nécessité de nouvelles routines d’acquisition d’images pour obtenir un meilleur débit sans compromettre la qualité des données. Les développements récents dans les flux de travail de matériel et d’imagerie ont considérablement augmenté la vitesse d’acquisition de la série d’inclinaison18,19, entraînant ainsi un changement radical du rapport entre le temps passé à mettre en place un point d’acquisition et le temps nécessaire pour l’acquisition réelle de la série d’inclinaison. Dans l’ensemble, la procédure de mise en place des points d’acquisition devient l’un des principaux goulots d’étranglement pour le débit réalisable des sessions cryoET.
Le protocole optimisé présenté ici nous a permis de mettre en place, en mode hors ligne, 171 positions pour l’acquisition tomographique automatisée au cours du premier jour d’une session cryoET pendant que le microscope était activement engagé dans d’autres opérations (par exemple, la cartographie carrée, le réglage et l’acquisition automatisée de séries d’inclinaison), sans affecter le temps de microscope disponible pour la collecte de données. En plus de maximiser le débit d’une session cryoET, ce pipeline réduit considérablement le temps investi par l’utilisateur dans la phase préparatoire d’une session de collecte de données automatisée. Dans le protocole décrit, l’utilisateur est invité à parcourir les carrés de grille cartographiés pour identifier les régions d’intérêt appropriées et les ajouter au Serial EM Navigator en tant que points d’acquisition. Toutes les cibles seront ensuite automatiquement traitées par lots au sein de SerialEM par l’outil PyEM pour la production des cartes virtuelles16. L’approche computationnelle présentée est donc considérablement plus rapide que l’acquisition de cartes d’ancrage réelles en éliminant les périodes d’attente associées au mouvement de la scène, à l’acquisition d’images, au changement des conditions d’imagerie entre la vue et l’aperçu, et par la réitération éventuelle de ces étapes tout en se centrant à un grossissement élevé. De plus, comme chaque image acquise entraîne une accumulation de dose d’électrons sur l’objet d’intérêt23,l’utilisation de cartes virtuelles pour le réalignement précis des cibles réduit les dommages causés par le rayonnement introduits dans la phase préparatoire d’une session cryoET avant l’acquisition réelle de la série d’inclinaisons. Le protocole décrit ici utilise des cartes virtuelles à grossissement intermédiaire et élevé (Preview et View, respectivement) pour le réalignement de la cible avant l’acquisition de la série d’inclinaison. Cette procédure peut facilement être modifiée pour n’utiliser que le grossissement intermédiaire De l’image lorsque la précision de l’alignement est moins importante, par exemple, dans le cas de grandes structures où la précision cible ultime est moins préoccupante10 ou pour des échantillons d’analyse de particules uniques qui sont mal répartis sur la cryo-grille nécessitant la sélection manuelle par l’utilisateur de chaque point d’acquisition24, 25. Enfin, une approche basée sur l’utilisation hors ligne d’une instance SerialEM factice facilite également la mise en place de points d’acquisition via une connexion à distance en minimisant le besoin de la présence physique de l’utilisateur au microscope, permettant ainsi plus de flexibilité en termes d’organisation opérationnelle de l’installation.
Les progrès récents de la technologie et des méthodes pour cryoET ont considérablement amélioré la vitesse et la fiabilité des sessions de collecte de données automatisées. Toutefois, d’autres développements sont nécessaires pour aborder les étapes restantes de limitation des taux de cette méthode. Plus particulièrement, l’étape initiale de la cartographie en grille et en carré devient maintenant l’un des principaux goulots d’étranglement de la configuration de la session, générant ainsi le besoin d’améliorations matérielles visant à augmenter la vitesse des mouvements des étages du microscope et de l’acquisition d’images par les détecteurs d’électrons directs. En outre, le développement d’approches d’apprentissage automatique pour automatiser entièrement le processus d’identification des cibles sera crucial pour éliminer le besoin d’inspection visuelle des utilisateurs pour sélectionner les régions d’intérêt, une procédure longue qui repose sur l’expertise des utilisateurs.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons le soutien de l’unité de biologie structurale et computationnelle et de l’installation centrale de microscopie électronique du Laboratoire européen de biologie moléculaire à Heidelberg, en Allemagne, ainsi que d’iNEXT-Discovery (numéro de projet 871037). Nous sommes extrêmement reconnaissants de l’excellent soutien de l’auteur du progiciel SerialEM, le professeur David Mastronarde. Nous remercions également Herman Fung pour la lecture critique du manuscrit.
Materials
| Transmission Electron Microscope | Our protocol is only based on computational workflows. The user will only need acess to a TEM of any kind |
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