Strategie per l'ottimizzazione dell'acquisizione dei dati della tomografia elettronica criogenica
Summary
La crescente domanda di raccolta dati su larga scala nella tomografia elettronica criogenica richiede routine di acquisizione delle immagini ad alto rendimento. Qui è descritto un protocollo che implementa i recenti sviluppi di strategie di acquisizione avanzate volte a massimizzare l’efficienza temporale e il throughput della raccolta dei dati tomografici.
Abstract
La tomografia elettronica criogenica (cryoET) è un metodo potente per studiare la struttura 3D di campioni biologici in uno stato vicino al nativo. L’attuale crioET all’avanguardia combinato con l’analisi della media dei subtomogrammi consente la determinazione strutturale ad alta risoluzione di complessi macromolecolari presenti in più copie all’interno di ricostruzioni tomografiche. Gli esperimenti tomografici di solito richiedono una grande quantità di serie di inclinazione da acquisire per mezzo di microscopi elettronici a trasmissione di fascia alta con importanti costi operativi di gestione. Sebbene il throughput e l’affidabilità delle routine di acquisizione dati automatizzate siano costantemente migliorati negli ultimi anni, il processo di selezione delle regioni di interesse in cui verrà acquisita una serie di inclinazione non può essere facilmente automatizzato e si basa ancora sull’input manuale dell’utente. Pertanto, l’applicazione di una sessione di raccolta dati su larga scala è una procedura dispendiosa in termini di tempo che può ridurre considerevolmente il tempo rimanente del microscopio disponibile per l’acquisizione della serie tilt. Qui, il protocollo descrive le implementazioni sviluppate di recente basate sul pacchetto SerialEM e sul software PyEM che migliorano significativamente l’efficienza temporale dello screening della griglia e della raccolta di dati della serie tilt su larga scala. Il protocollo presentato illustra come utilizzare le funzionalità di scripting SerialEM per automatizzare completamente la mappatura della griglia, la mappatura dei quadrati della griglia e l’acquisizione delle serie di inclinazione. Inoltre, il protocollo descrive come utilizzare PyEM per selezionare ulteriori obiettivi di acquisizione in modalità off-line dopo l’avvio della raccolta automatica dei dati. Per illustrare questo protocollo, viene descritta la sua applicazione nel contesto della raccolta di dati di fascia alta della serie di inclinazione Sars-Cov-2. La pipeline presentata è particolarmente adatta a massimizzare l’efficienza temporale degli esperimenti di tomografia che richiedono un’attenta selezione degli obiettivi di acquisizione e allo stesso tempo una grande quantità di serie di inclinazione da raccogliere.
Introduction
I metodi di microscopia elettronica criogenica (cryoEM) si basano sull’imaging di campioni biologici mediante un microscopio elettronico a trasmissione (TEM) dopo la loro rapida vetrificazione, un processo di preparazione del campione che preserva le strutture molecolari e cellulari dei campioni in uno stato vicino al nativo e idrato1,2. Nella tomografia elettronica criogenica (cryoET) si ottiene un modello 3D del campione vitrificato acquisendo un numero di immagini della stessa regione di interesse da diversi orientamenti, la cosiddetta serie tilt, seguita dalla ricostruzione computazionale del volume tomografico3. Questa tecnica di imaging avanzata è maturata in un potente metodo per l’indagine strutturale dei processi biologici nel contesto dei loro ambienti cellulari nativi4,5,6.
Oltre all’analisi ultrastrutturale del campione vitrificato, è possibile ottenere ricostruzioni ad alta risoluzione di complessi macromolecolari presenti in più copie all’interno del volume tomografico applicando subtomogrammi con una media di5. Questo approccio di ricostruzione si basa sull’allineamento iterativo e sulla media dei sotto-volumi contenenti la struttura di interesse ed è finalizzato ad aumentare il rapporto segnale-rumore e la risoluzione della ricostruzione finale7,8. La media dei sottotomogrammi si basa sulla raccolta e l’elaborazione di una grande quantità di dati che spesso richiede l’acquisizione di centinaia di serie di inclinazione per mezzo di TEM di fascia alta con onerosi costi operativi di gestione.
Attualmente la configurazione di tali sessioni crioET automatizzate è un processo che richiede tempo e che di solito si basa sull’input manuale dell’utente9,10,11. In genere, gli obiettivi vengono identificati mediante ispezione visiva della griglia mappata e successivamente impostati per la raccolta automatica dei dati. L’efficienza dell’utente nell’identificare i punti di acquisizione è spesso influenzata dalla natura del campione, diventando particolarmente impegnativa quando si analizzano macromolecole purificate con concentrazione non ottimale o nel caso di eventi rari all’interno di ambienti cellulari affollati, implicando l’uso di approcci correlativi12. Inoltre, i flussi di lavoro attuali richiedono l’acquisizione di immagini durante il set-up a vari ingrandimenti che verranno successivamente utilizzati per la localizzazione e il centraggio precisi del target durante l’acquisizione automatizzata11,13,14. Questi passaggi di ricon allineamento ad alta precisione sono fondamentali per le applicazioni ad alta risoluzione, che richiedono che l’imaging venga eseguito con ingrandimenti elevati e richiedono passaggi di centrating accurati per mantenere la regione di interesse all’interno del piccolo campo visivo risultante. Complessivamente, diverse ore di ogni sessione di raccolta dati sono impegnate per questa procedura dispendiosa in termini di tempo durante la quale il TEM non è impegnato nell’acquisizione di serie tilt. Pertanto, a seconda della quantità di serie di inclinazione richiesta, l’identificazione e la configurazione dei punti di acquisizione possono avere un impatto considerevole sul tempo del microscopio disponibile per la raccolta dei dati durante una sessione crioET.
Qui è descritto un protocollo ottimizzato basato sul pacchetto software SerialEM15 e sull’ultima versione del software PyEM16 per mappare griglie, mappare quadrati di griglia, selezionare target e impostare l’acquisizione automatica dei dati per la raccolta di serie tilt su larga scala. Il concetto chiave di questo approccio è quello di fornire a SerialEM immagini generate computazionalmente da PyEM per ogni elemento di acquisizione, denominate mappe virtuali, per la localizzazione e la centratizzazione accurate del target. Per ottenere il tempo di acquisizione effettivo, la selezione dei target e la creazione delle mappe virtuali vengono eseguite off-line utilizzando una seconda istanza fittizia di SerialEM, disaccoppiando il processo di selezione degli obiettivi di acquisizione dalle operazioni TEM. Pur non affrontando come aumentare la qualità dei dati13,17 o la velocità di acquisizione della serie tilt18,19,questo protocollo si concentra principalmente sulle strategie per ottimizzare l’efficienza temporale della configurazione delle sessioni cryoET automatizzate su larga scala. Pertanto, l’implementazione del protocollo presentato è destinata a quegli scienziati che stabiliscono flussi di lavoro di raccolta dati crioET che desiderano massimizzare la resa dell’acquisizione automatica dei dati aumentando il tempo del microscopio disponibile per l’acquisizione della serie tilt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Da tecnica di nicchia, la cryoET è ormai maturata in un metodo diffuso per eseguire studi strutturali a livello cellulare e molecolare con risoluzione raggiungibile senza precedenti21,22. La domanda sempre crescente di imaging crioEM ha messo a dura prova le limitate risorse disponibili per accedere a questa tecnologia. Nonostante l’apertura di una serie di strutture crioEM nazionali e gli sforzi degli istituti scientifici per aumentare la loro capacità TEM di supportare le esigenze della comunità in tutto il mondo, l’accesso agli strumenti crioEM è ancora limitato e il tempo disponibile per la raccolta dei dati deve quindi essere utilizzato in modo efficiente dagli utenti per massimizzare la resa di ogni sessione di microscopia. La necessità di acquisire centinaia di serie di inclinazioni combinata con il tempo limitato disponibile per la raccolta dei dati ha richiesto nuove routine di acquisizione delle immagini per ottenere un throughput migliore senza compromettere la qualità dei dati. I recenti sviluppi nei flussi di lavoro hardware e di imaging hanno notevolmente aumentato la velocità di acquisizione della serie tilt18,19, determinando così un drammatico spostamento del rapporto tra il tempo impiegato per impostare un punto di acquisizione e il tempo necessario per l’acquisizione della serie di inclinazione effettiva. Complessivamente, la procedura per la creazione di punti di acquisizione sta diventando uno dei principali colli di bottiglia per il throughput raggiungibile delle sessioni cryoET.
Il protocollo ottimizzato qui presentato ci ha permesso di impostare, in modalità off-line, 171 posizioni per l’acquisizione tomografica automatizzata entro il primo giorno di una sessione crioET mentre il microscopio era attivamente impegnato in altre operazioni (ad esempio, mappatura quadrata, messa a punto e acquisizione automatica di serie di inclinazioni), senza quindi influire sul tempo del microscopio disponibile per la raccolta dei dati. Oltre a massimizzare il throughput di una sessione cryoET, questa pipeline riduce drasticamente la quantità di tempo investito dall’utente nella fase preparatoria di una sessione di raccolta dati automatizzata. Nel protocollo descritto, all’utente viene chiesto di sfogliare i quadrati della griglia mappati per identificare le regioni di interesse adatte e aggiungerle al Serial EM Navigator come punti di acquisizione. Tutti i target verranno poi elaborati automaticamente in batch all’interno di SerialEM dallo strumento PyEM per la produzione delle mappe virtuali16. L’approccio computazionale presentato è quindi notevolmente più veloce rispetto all’acquisizione di mappe di ancoraggio reali eliminando i periodi di attesa associati al movimento del palco, all’acquisizione dell’immagine, al cambiamento delle condizioni di imaging tra View e Preview e all’eventuale reiterazione di questi passaggi mentre si centra ad alto ingrandimento. Inoltre, poiché ogni immagine acquisita porta all’accumulo di dose di elettroni sull’oggetto di interesse23,l’uso di mappe virtuali per il riallineamento preciso dei bersagli riduce il danno da radiazione introdotto nella fase preparatoria di una sessione crioET prima dell’acquisizione della serie di inclinazione effettiva. Il protocollo qui descritto fa uso di mappe virtuali a ingrandimento sia intermedio che alto (anteprima e vista, rispettivamente) per il riallineamento del target prima dell’acquisizione della serie tilt. Questa procedura può essere facilmente modificata per utilizzare l’ingrandimento intermedio Visualizza immagine quando la precisione di allineamento è di minore importanza, ad esempio, nel caso di strutture di grandi dimensioni in cui la precisione del target finale è di minore preoccupazione10 o per campioni di analisi di singole particelle che sono scarsamente distribuiti sulla crio-griglia che richiedono la selezione manuale dell’utente di ciascun punto di acquisizione24, 25. Infine, un approccio basato sull’utilizzo off-line di un’istanza SerialEM fittizia facilita anche la configurazione dei punti di acquisizione tramite connessione remota riducendo al minimo la necessità della presenza fisica dell’utente al microscopio, consentendo così una maggiore flessibilità in termini di organizzazione operativa della struttura.
I recenti progressi nella tecnologia e nei metodi per la crioET hanno drasticamente migliorato la velocità e l’affidabilità delle sessioni automatizzate di raccolta dei dati. Tuttavia, sono necessari ulteriori sviluppi per affrontare le restanti fasi di limitazione della velocità di questo metodo. In particolare, la fase iniziale della mappatura della griglia e del quadrato sta diventando uno dei principali colli di bottiglia della configurazione della sessione, generando così la necessità di miglioramenti hardware volti ad aumentare la velocità dei movimenti dello stadio del microscopio e dell’acquisizione di immagini da parte dei rivelatori di elettroni diretti. Inoltre, lo sviluppo di approcci di apprendimento automatico per automatizzare completamente il processo di identificazione del target sarà cruciale per eliminare la necessità dell’ispezione visiva degli utenti per la selezione delle regioni di interesse, una procedura che richiede tempo e si basa sull’esperienza degli utenti.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo il supporto dell’Unità di Biologia Strutturale e Computazionale e della Electron Microscopy Core Facility presso l’European Molecular Biology Laboratory di Heidelberg, in Germania, e di iNEXT-Discovery (numero di progetto 871037). Siamo estremamente grati per l’eccellente supporto dell’autore del pacchetto software SerialEM, il professor David Mastronarde. Ringraziamo anche Herman Fung per la lettura critica del manoscritto.
Materials
| Transmission Electron Microscope | Our protocol is only based on computational workflows. The user will only need acess to a TEM of any kind |
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