極低温電子断層撮影の最適化戦略
Summary
極低温電子断層撮影における大規模なデータ収集の需要の高まりには、高スループット画像取得ルーチンが必要です。ここでは、断層データ収集の時間効率とスループットを最大化することを目的とした高度な取得戦略の最近の開発を実装するプロトコルを説明します。
Abstract
極低温電子断層撮影(cryoET)は、生体試料の3D構造を近原の状態で研究する強力な方法です。現在の最先端のcryoETとサブトモグラム平均分析を組み合わせることで、断層構造再建中に複数のコピーに存在する高分子複合体の高解像度構造決定が可能になります。断層実験では、通常、重要な運用ランニングコストを備えたハイエンドの透過型電子顕微鏡によって得られる膨大な量のチルトシリーズが必要です。近年、自動データ収集ルーチンのスループットと信頼性は絶えず向上していますが、傾斜系列を獲得する対象領域を選択するプロセスは簡単に自動化できず、ユーザーの手動入力に依存しています。そのため、大規模なデータ収集セッションのセットアップは、チルトシリーズ取得に利用可能な顕微鏡残り時間を大幅に短縮できる時間のかかる手順です。ここでは、このプロトコルは、グリッドスクリーニングと大規模なチルトシリーズデータ収集の時間効率を大幅に向上させるシリアルEMパッケージとPyEMソフトウェアに基づいて最近開発された実装を記述しています。このプロトコルは、SerialEM スクリプト機能を使用して、グリッド マッピング、グリッド スクエア マッピング、およびチルト シリーズの取得を完全に自動化する方法を示しています。さらに、このプロトコルは、自動データ収集が開始された後に、PyEMを使用して、オフラインモードで追加の取得ターゲットを選択する方法を説明しています。このプロトコルを例示するために、Sars-Cov-2チルトシリーズのハイエンドデータ収集の文脈におけるその応用について説明する。提示されたパイプラインは、収集対象の目標を慎重に選択すると同時に大量のチルトシリーズを必要とする断層撮影実験の時間効率を最大化するのに特に適しています。
Introduction
極低温電子顕微鏡(cryoEM)法は、高速ガラス化後の透過型電子顕微鏡(TEM)による生体試料のイメージングに基づくものであり、試料の分子構造と細胞構造をほぼ天然および水和状態に保つサンプル調製プロセス1,2。極低温電子断層撮影(cryoET)では、異なる配向から同じ関心領域の画像を多数取得することによってガラス化サンプルの3Dモデルが達成され、いわゆるチルト系列、続いて断層体容積3の計算再構成が行われた。この高度なイメージング技術は、彼らのネイティブ細胞環境4、5、6の文脈で生物学的プロセスの構造調査のための強力な方法に成熟した。
ガラス化試料の超構造解析に加えて、断層体積内の複数のコピーに存在する高分解能の高解像再構成は、サブトモグラム平均5を適用することによって得ることができる。この再構成アプローチは、目的の構造を含むサブボリュームの反復アライメントおよび平均化に基づいており、最終的な再構成7,8の信号対雑音比および分解能を高めることを目的としている。サブトモグラム平均化は、運用運用コストの厳しいハイエンドのTEMを使用して、数百のチルトシリーズの獲得を必要とする大量のデータの収集と処理に依存します。
現在、このような自動 cryoET セッションのセットアップは、通常、ユーザーの手動入力9、10、11に依存する時間のかかるプロセスです。通常、ターゲットは、マップされたグリッドの目視検査によって識別され、その後、自動データ収集用に設定されます。獲得点の同定におけるユーザの効率は、サンプルの性質に影響されることが多く、最適でない濃度で精製された高分子を分析する場合、または混雑した細胞環境内での稀な事象の場合には特に困難になり、相関アプローチ12の使用を示唆する。さらに、現在のワークフローでは、セットアップ時に画像をさまざまな倍率で取得する必要があり、後で自動取得11、13、14の間にターゲットの正確なローカリゼーションとセンタリングに使用されます。これらの高精度の再調整ステップは、高倍率でのイメージングを要求し、結果として得られる小さな視野内で対象領域を保持するための正確なセンタリングステップを必要とする高解像度アプリケーションにとって重要です。全体として、TEM がチルトシリーズの取得に従事していないこの時間のかかる手順に対して、各データ収集セッションの数時間がコミットされます。したがって、必要なチルトシリーズの量に応じて、取得ポイントの識別とセットアップは、cryoETセッション中にデータ収集に利用できる顕微鏡時間に大きな影響を与える可能性があります。
ここでは、SerialEMソフトウェアパッケージ15とPyEMソフトウェア16をベースに最適化されたプロトコルで、グリッドをマッピングし、グリッドの正方形をマッピングし、ターゲットを選択し、大規模なチルトシリーズコレクション用に自動データ集録を設定します。このアプローチの重要な概念は、ターゲットの正確なローカリゼーションとセンタリングのために、取得項目(仮想マップと呼ばれます)ごとにPyEMによって計算的に生成された画像をシリアルEMに提供することです。実際の取得時間を得るために、ターゲットの選択と仮想マップの作成は、SerialEMの2番目のダミーインスタンスを使用してオフラインで実行され、取得対象の選択プロセスをTEM操作から切り離します。データ品質13、17、またはチルトシリーズ取得18、19の速度を上げる方法を扱わないが、このプロトコルは、主に大規模な自動cryoETセッションの設定の時間効率を最適化するための戦略に焦点を当てています。したがって、提示されたプロトコルの実装は、傾斜シリーズの取得に利用可能な顕微鏡時間を増加させることによって、自動データ取得の歩留まりを最大化することを望むcryoETデータ収集ワークフローを確立する科学者のためのものです。
Protocol
Representative Results
Discussion
ニッチな技術から、cryoETは今では、前例のない到達可能な解像度21、22で細胞および分子レベルで構造研究を行うために広範な方法に成熟している。cryoEMイメージングに対する需要が増え続けており、この技術にアクセスできる限られたリソースに負担をかけている。多数の国のクライオエム施設が開設され、世界中のコミュニティのニーズをサポートするTEM能力を高める科学機関の努力にもかかわらず、cryoEM機器へのアクセスは依然として限られており、データ収集に利用可能な時間は、各顕微鏡セッションの収量を最大化するためにユーザーが効率的に使用する必要があります。データの品質を損なうことなく、より良いスループットを達成するために、新しい画像取得ルーチンのために呼び出されたデータ収集に利用可能な限られた時間と組み合わせた数百のチルトシリーズを取得する必要性。ハードウェアおよびイメージングワークフローの最近の発展は、チルトシリーズ取得の速度を大幅に増加させ、18,19で、取得ポイントの設定にかかる時間と実際のチルトシリーズ取得に必要な時間の比が劇的に変化しています。全体として、取得ポイントを設定する手順は、cryoETセッションの達成可能なスループットの主要なボトルネックの1つになりつつあります。
ここで紹介する最適化されたプロトコルにより、cryoETセッションの初日に自動断層線取得のための171の位置を設定することができ、顕微鏡は他の操作(例えば、正方形マッピング、チューニング、自動チルトシリーズ取得)に積極的に従事していました。このパイプラインは、cryoET セッションのスループットを最大化するだけでなく、自動データ収集セッションの準備段階でユーザーが投資する時間を大幅に削減します。説明されたプロトコルでは、ユーザーは、適切な関心領域を識別し、取得ポイントとしてシリアルEMナビゲータにそれらを追加するために、マップされたグリッドの正方形を参照するように求められます。すべてのターゲットは、仮想マップ16の生産のための PyEM ツールによって SerialEM 内でバッチ処理されます。したがって、提示された計算アプローチは、ステージの動き、画像取得、ビューとプレビューの間のイメージング条件の変化に関連する待ち時間を排除し、高倍率を中心にしてこれらのステップを最終的に繰り返すことによって、実際のアンカーマップを取得するよりもかなり速くなります。さらに、各取得画像が対象物23に電子線量の蓄積をもたらすので、標的の正確な再調整のための仮想マップの使用は、実際のチルトシリーズ取得前にcryoETセッションの準備段階で導入された放射線損傷を減少させる。ここで説明するプロトコルは、チルトシリーズの取得前にターゲットの再調整のために中間および高倍率仮想マップ(それぞれプレビューとビュー)の両方を使用しています。この手順は、位置合わせ精度の重要性が低い場合にのみ中間倍率ビュー画像を使用するように簡単に変更することができますが、例えば、最終的なターゲット精度がそれほど重要でない大きな構造の場合は10、または各取得ポイント24のユーザーの手動選択を必要とするクライオグリッド上で不十分な単一粒子分析サンプルの場合、 25.最後に、ダミーのSerialEMインスタンスのオフライン使用に基づくアプローチは、顕微鏡でのユーザーの物理的な存在の必要性を最小限に抑えることによって、リモート接続を介して取得ポイントのセットアップを容易にし、施設の運用上の組織の面でより柔軟性を可能にします。
最近のcryoETの技術と方法の進歩により、自動データ収集セッションの速度と信頼性が大幅に向上しました。しかし、この方法の残りのレート制限ステップに対処するために、さらなる開発が必要です。最も顕著なのは、グリッドと正方形マッピングの初期段階がセッション設定の主要なボトルネックの1つになりつつあり、顕微鏡ステージの動きの速度を上げ、直接電子検出器による画像取得の速度を高めることを目的としたハードウェアの改善の必要性を生み出しています。さらに、ターゲット識別のプロセスを完全に自動化するための機械学習アプローチの開発は、関心のある地域を選択するためのユーザーの目視検査の必要性を排除するために重要です, ユーザーの専門知識に依存する時間のかかる手順.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、ドイツ・ハイデルベルクにある欧州分子生物学研究所の構造・計算生物学ユニット及び電子顕微鏡コア施設及びiNEXT-Discovery(プロジェクト番号871037)からの支援を認める。SerialEM ソフトウェア パッケージの著者である David Mastronarde 教授の優れたサポートに非常に感謝しています。また、原稿の批判的な読書のためにハーマンフンに感謝します。
Materials
| Transmission Electron Microscope | Our protocol is only based on computational workflows. The user will only need acess to a TEM of any kind |
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