In vivo Fare Kalitesiz Zeytinde Kalsiyum Görüntüleme

Hayvanların bakımı ve kullanımı için geçerli tüm uluslararası, ulusal ve kurumsal yönergelere uyuldu. Stereotaksik virüs vektör enjeksiyonuna aseptik cerrahi teknikleri uygulandı. 1. Stereotaksik virüs vektör enjeksiyonu NOT: GCaMP6s (AAV9) ekspresye etmek için genetik materyal taşıyan virüs. ÇAĞ. GCaMP6s.WPRE.SV40) stereotaksik olarak daha önce açıklandığı gibi enjekte edilir7,8 aşağıdaki değişikliklerle. Ürün kılavuzunda olduğu gibi ayarlanmış parametrelere sahip bir lazer kılcal çekme makinesi kullanarak IO enjeksiyonu için uzun ve sert konik bir pipet imal etmek için borosilikat cam yerine kuvars cam (dış çap: 1,14 mm, iç çap: 0,53 mm) kullanın. Çektikten sonra, 15-20 μm iç uç çapına sahip 8-10 mm uzunluğunda bir konik elde etmek için pipet ucundan neşterle 1-2 mm kesin (Şekil 1a). Daha kolay beyin penetrasyonu ve daha az pipet bükme için ucunu dönen bir mikropipette beveler ile 30° iğne şekline bükerek pipeti kesin hale getirmek (Şekil 1a).NOT: Yaygın olarak kullanılan borosilikat cam pipet, bu uzunluğa çekildiğinde derin alanları doğru bir şekilde hedeflemek için çok esnek olacaktır. Bu çalışmada virüsü iletmek için cam pipet ile bir nanoliter enjektör kullanıldı. Alternatif olarak, hassas bir cam şırınna veya basınç enjektörü de kullanılabilir. Fare göğsünün termal ped üzerinde olduğundan emin olun, böylece boynu yeterli vücut desteği ile gerilmez ve fareyi stereotaksik çerçeveye sabitlerken kafatasını düzleştirmeye son derece dikkat edin (Şekil 1b).NOT: Bregma-lambda farkı dikey boyutta 0,05 mm’den az olmalıdır. Ana GÇ çekirdeğini hedefleme koordinatları olarak bregma’ya göre 6,2 mm kaudal, ±0,5 mm yanal ve6,6mm ventral kullanın ( Şekil 1c ).NOT: Beynin mükemmel seviyelendirmesi, GÇ’ye virüs enjekte etme başarı oranını önemli ölçüde artıracaktır. Laboratuvarlar, fare suşları ve bireysel araştırmacılar arasında önemli farklılıklar beklendiği için koordinatlar deneyci tarafından onaylanmalıdır. Bu yayın için video materyali hazırlamak için bir erkek C57Bl / 6J fare kullandık. Viral transfected hayvanlar için 3-4 hafta boyunca ameliyat sonrası bakım ve barınma prosedürleri için ilgili kurumsal yönergeleri izleyin. Şekil 1: Stereotaksik virüs vektör enjeksiyonu. (a) Lazerle çekilen kuvars cam pipet 10-12 mm uzunluğunda düz koniktir. Çektikten sonra ucundan 1-2 mm kesin. Pipet, ucu 30° iğne şekline göre şekillendirilerek sonlandırılır. (b) Doğru enjeksiyon, fare gövdesinin stereotaksik çerçevedeki uygun konumuna dayanır. Boynun gerilmesini önlemek için fare göğsünü destekleyin. Bregma ve lambda’yı yatay olarak hizalayarak fare kafasını düzleştirme. (c) Bregma’ya göre GÇ koordinasyonu, fare kafatasının dorsal görünümünde (solda) ve beynin koronal görünümünde (sağ üstte) gösterilir. Enjeksiyon, anaparanın (IOPr) ve GÇ’nin dorsal (IOD) subnükleisinin (sağ alt) yanal kısmına ulaşır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 2. Ventral yaklaşım cerrahisi için alet ve sarf malzemelerinin hazırlanması Entübe hayvanın nefes alabilmesi için 20 kalibrelik bir kateterin ucundan 5 ila 6 mm uzunluğunda ve 0,8 mm genişliğinde yarık keserek bir entübasyon tüpü hazırlayın (Şekil 2a).NOT: Sürekli hava akışına sahip ortak bir izofluran buharlaştırıcı kullanılırsa, hayvanın nefes al etmesi için yarık gereklidir. Buharlaştırıcıya ek olarak bir ventilatör kullanılırsa, kateter bozulmadan bırakılabilir. Trakeotomi sırasında trakeayı desteklemek için kör bir iğne hazırlayın. Pense ile 25 kalibrelik bir iğnenin keskin ucunu kesin. Kırılma yüzeyini zımpara kağıdı ile pürüzsüzleştirin. Ortadaki kör iğneyi pense ile yaklaşık 15 ° bükün.NOT: Kavisli bir iğne nefes nefesini nazikçe kaldırır. Bu, nefes borusunun deformasyonunu azaltabilir. 50 mg/mL ketamin’i salin ile% 15’e seyreltin. Son konsantrasyon 7.5 mg/mL’dir. Temiz cerrahi aletleri ve lidokin jeli, salin, jelatin süngerleri, emici sürüntüler, petrol jölesi ve temizleme dokusu dahil olmak üzere sarf malzemelerini birleştirin. İzofluran buharlaştırıcıyı aç. Hayvan ısıtma yastığını 38 °C’ye ayarlayın. Stereotaksik çerçevenin burun konisini yatay olarak 180° çevirin, böylece fare çerçevenin ventral tarafına yukarı sabitlenebilir. Burun koni yüksekliğini kulak çubukları seviyesinde olacak şekilde ayarlayın. 3. Anestezinin verilmesi ve farenin ameliyat için hazırlanması Hayvanı bir tartım terazisi ile tartın ve enjeksiyon için seyreltilmiş ketamin miktarını hesaplayın.NOT: İhtiyaç duyulan toplam ketamin miktarı kg vücut ağırlığı başına 56,25 mg’dır. Bu nedenle, seyreltilmiş ketamin hacmi kg vücut ağırlığı başına 7,5 mL’dir. Tek başına ketamin kullanmanın dezavantajları arasında zayıf kas gevşemesi, taşikardi ve gelişmiş kas tonus9bulunur. Bu protokolde ketamin sadece trakeotomi nedeniyle izoflurane yönetiminin kesintiye uğradığı 10-20 s dönemini karşılamak için kullanılır. Bu adımı mümkün olduğunca kısa tutarak, izofluranın anestezik etkisi önemli ölçüde azalmaz ve ketamin kullanan dezavantajlar en aza indirilmez. Fareyi% 5 izofluran ile önceden doldurulmuş anestezik indüksiyon odasına yerleştirin. Hayvan, sağ refleks kaybı ve daha derin ve daha yavaş nefes alma deseni ile tamamen uyuşturulduğu zaman, izofluran akışını stereotaksik çerçevenin burun konisine geçirin ve izofluran konsantrasyonu% 2.5’e düşürün. Hayvanı stereotaksik çerçeve ventral tarafta sabitle(Şekil 2b). Hayvanın kolayca nefes alabildiğinden emin olmak için burun konisinin yüksekliğini ve perdesini ayarlayın. Önceden ısıtılmış ısıtma yastığı ile hayvanı sıcak tutun.NOT: Hayvan vücudunun alt kısmını bir parça kağıt mendil veya alüminyum folyo ile örtmek, hayvan sıcaklığının korunmasına yardımcı olabilir. Boğaz ve uyluk bölgelerindeki cilt kıllarını tıraş makinesi ve epilasyon kremi ile çıkarın (Şekil 2b). Lidokin jelini boğaz derisine topik olarak uygulayın.NOT: Prosedür 6’da kullanılacak olan uyluk kelepçe periferik oksijen doygunluğu (SpO2)sensörü en iyi tüysüz cilt üzerinde çalışır. Hayvan sıcaklığını bir rektal termometre ile izleyin (Şekil 2b). Ameliyat sırasında sıvı kaybını telafi etmek için intraperitoneal olarak 1 mL sıcak (37 °C) salin enjekte edin. Anestezinin derinliğini arka uzuv ayak parmaklarında güçlü bir tutamla değerlendirin. Algılanabilir yanıt çağrılmamalıdır. Şekil 2: Ventral yaklaşım ameliyatının hazırlanması. (a) 20’li kateterin ucunda 5-6 mm uzunluğunda ve 0,8 mm genişliğinde yarık keserek entübasyon tüpü hazırlayın. (b) Hayvan ventral tarafını stereotaksik bir çerçeveye monte edin ve hayvanın kolayca nefes almasını sağlamak için burun konisi açısını ayarlayın. Boğaz ve uyluk bölgelerindeki cildi tıraş edin. Fare yaşamsal belirtilerini izlemek için SpO2 sensörünü uyluğa takın. Fare gövdesi sıcaklığını izlemek için rektal sıcaklık probını yerleştirin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 4. Trakeotomi ve entübasyon (20-25 dk) Nefes nefesini açığa çıkarmak. Orta hat boyunca boğaz derisinde dikey bir kesi yapın. Künt diseksiyon yöntemini kullanarak boyun derisini altındaki iç organlardan ayırın ve tükürük bezlerini ortaya çıkarmak için cildi kesin (Şekil 3a-b, 4a). Bağ dokusundan tükürük bezlerini serbest bırakın ve sternotiroid kas kaplı trakeayı önps ile ortaya çıkarmak için yanal olarak çevirin (Şekil 3b-c).NOT: Petrol jölesi nemli tutmak için açıkta kalan dokuya uygulanabilir. Aşağıdaki adımlar için temiz tutmak için trakea bölgesinden kaçının. Trakeotomi Seyreltilmiş ketamin (7,5 mg/mL) intraperitoneal, kg vücut ağırlığı başına 5 mL (37,5 mg/kg) ilk dozunu enjekte edin.NOT: Ketamin çalışması 3-5 dakika sürer, bu nedenle trakeayı çevredeki kaslardan ve kan damarlarından ayırmadan önce ilk ketamin dozu enjekte edilmelidir. Ketamin, izofluran anestezisi ile birleştirildiğinde aşırı doz etki riskinin yüksek olması nedeniyle iki enjeksiyonda uygulanır. Sternotiroid kasını orta hat boyunca, nefes borusunun ortaya çıkması için ince bir önps ucuyla dikkatlice bölün (Şekil 3c). Künt diseksiyon yöntemini kullanarak nefes borusunu kan damarlarından ve yemek borusundanps ile ayırın. İkinci doz seyreltilmiş ketamin (7,5 mg/mL), kg vücut ağırlığı başına 2,5 mL (18,75 mg/kg) intraperitoneally enjekte edin. Trakeanın altına çapraz olarak künt bir iğne sokarak destekleyin (Şekil 3d). Nefes nefesini desteklemek için bu iğneyi parmaklarla tutun. Dikiş ipliğini üçüncü trakea halkası kaudal etrafında yarım daire iğne ile tiroid bezine yönlendirin (Şekil 3d). Bu trakeal halkaya dört alet bağı yap.NOT: Trakea halkasına bağlı iplik, nefes borusunun hayvan göğsüne sabitlenerek sabitlenerek kullanılması için kullanılır. Bu adımda ipliği yarım daire iğnesinden kesmeyin. Trakeal halkalar esnek ama kemiklerden daha az güçlü kıkırdaktan yapılmıştır. Dikiş ipliğini çok sıkı bağlamayın, aksi taktırabilir. Göğüs derisini bir çift sıyrıkla sıkıştırın. Göğüs derisini son adımda kullanılan aynı yarım daire iğnesi ile delin ve bir sonraki adımda nefes borusunun göğsüne sabitleme hazırlığında ipliği deriden geçirin(Şekil 3d). Trakea halkasına bağlı ipliği çekerek nefes ucsunu hafifçe kaldırın ve trakea rostralini bağlı halkaya ve kaudal tiroid bezlerine kesin. Kaudal trakeayı göğsüne doğru çekin. Altına küçük bir parça cerrahi sünger ekleyerek nefes borusunun açılmasını kaldırın.NOT: Anestezi seviyesini sağlamak için nefes nefesini kesmeden önce ikinci ketamin enjeksiyonundan sonra 5 dakikadan fazla geçtiğinden emin olun. Nefes borusunun açma ucunun içinde kalan sıvıyı ince bir temizleme dokusu şeridi ile çıkarın. izofluran akışını stereotaksik burun konisinden entübasyon tüpüne geçirin. Entübasyon tüpünü yaklaşık 2 mm derinliğinde nefes borusuna yerleştirin ve nefes almaya izin vermek için tüpteki yarığın bir kısmının nefes borusunun dışında kaldığından emin olun (Şekil 3e, 4b).NOT: Farenin nefesini sorunsuz bir şekilde almak ve nefes borusuna zarar vermemek için entübasyon tüpünün açısını ve yerleştirme derinliğini dikkatlice ayarlayın. Petrol jölesi kurumasını önlemek için nefes borusunun dışına uygulanabilir, böylece trakea kolayca yırtılmasın. 3-4 aletli bağ yaparak nefes borusunun göğüs derisine sabitlenerek. Entübasyon tüpünü sabitlemek için nefes borusunu dikiş ipliğine bağlayın (Şekil 3e, 4b). Şekil 3: Trakeotomi ve fare entübasyonu. (a-c) paneller trakea maruz kalma sürecini gösterir. (a) Kesik çizgiler boyunca keserek boğaz derisini çıkarın. (b) Sternotiroid kas (SM) ile kaplı trakeayı ortaya çıkarmak için tükürük bezlerini (SG) yanal olarak çevirin. (c) Nefes borusuna maruz kalmak için kesik çizgi boyunca SM’yi kesin. (d-e) panelleri trakeotomiyi gösterir. (d) Nefes borusuna künt ve kavisli bir iğne ile destek edin. Trakeayı göğüs derisine sabitlemek için üçüncü trakea halkası kaudal’i tiroid bezine bağlayın. (e) Ucunda yarık olan entübasyon tüpü ile izofluran uygulayın. Nefes borusunun dikiş ipliği ile göğüs derisine sabitleyin. Entübasyon tüpünü birbirine bağlı olarak nefes borusuna sabitleyin. Ölçek çubuğu a=5 mm, tüm panellere uygulanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Ventral yaklaşım cerrahisinin yanal görünümden şematik şeması. (a) Fare ventral taraf yukarı yerleştirildiğinde göreceli konumlarında belirtilen ilgili anatomik parçalara sahip şematik bir çizim. Kısaltmalar: kas kaplama atlası (AM), boyuna kas (LM), tükürük bezleri (SG), sternotiroid kas (SM), tiroid bezi (TG). (b) Trakeotomi tamamlandığında entübasyon tüpünün trakea ile ilgili olarak düzenlenmesi şeması. Trakea göğüs derisindeki (T-trakea) bağlarla sabitlanır. Entübasyon tüpü (IT), trakea ucunun (T tüpü) etrafındaki bağlarla sabitlenerek sabitlenen bir tüptür. (c) GÇ’ye görüş hattını temizlemek için atlas ön tüberkülünü (AAT) çıkarın. (d) Minyatür mikroskop (MM) ve GRIN lensin görüntüleme deneyi için GÇ’nin üzerinde konumlandırılmasını açıklayan şematik. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 5. Beyin sapının açığa çıkarttırı (40-45 dk) Sternotiroid kası ince önps ile kas lifi boyunca kesin. İzole edilmiş kısmı yay makası ile kesin (Şekil 3e). Kaslardaki kan damarlarındaki hasarı en aza indirmek için sol trakeayı ve gırtlağı kaslardan dikkatlice boşaltın. Sol nefes borusu ve larinksi çıkarın. Yemek borusunu ekli dokudanps ile serbest bırakın ve yay makası ile kesin. (Şekil 5a). Ventral kemeri ve atlasın ön tüberkülünü kaplayan kası ince ön ve yay makası ile çıkarın (Şekil 5b).NOT: Kası çıkarırken, bir kısmını ince tokmaların ucuyla bölün. Ayrılmış kısmı bir çift yay makası ile kesin. Kan damarlarının parçalanması riskini en aza indirmek için atlas ventral kemerini ortaya çıkarmak için bunu birçok kez tekrarlayın. Atlasın ventral kemerlerini bir rongeur ile kesin (Şekil 4c, 5c). Atlasın ön tüberkülünü çıkarın. Foramen magnum ve beyin sapını görüntülemek için kanı ve sıvıyı cerrahi süngerle çıkarın (Şekil 4c, 5d). Oksipital kemiği bir rongeur ile çıkararak foramen magnum’unu genişletin. (Şekil 5d-e). Foramen magnum üzerindeki ince kıkırdağı ince forseps ve yay makası ile çıkarın. Ventral beyin sapının net bir görünümüne sahip olmak için dura mater’in periosteal tabakasını ince tokmaklarla dikkatlice soyun (Şekil 5f). Dura mater’i kırmayın. Şekil 5: Kalsiyum görüntüleme için farenin beyin sapı ortaya çıkar. (a-f) panelleri beyin sapının açığa maruz kalma sürecini gösterir. (a) Şekil 3eetiketli sternotiroid kasını (SM) çıkarın. Larinksi ve yemek borusunu kesin. (b) Boyuna kası (LM) ve kas kaplama atlasını (AM) çıkarın. (c) Atlas ventral kemerlerini (AVA) bir rongeur ile kesin ve atlas ön tüberkülünü (AAT) çıkarın. (d) Foramen magnumunu (FM) genişletmek için oksipital kemiği (OB) kesin. (e) Genişletilmiş FM. (f) Foramen magnum üzerindeki ince kıkırdak çıkarılır. Dura mater periosteal tabakası soyulur. Kare, yüzeysel IO nöronları içeren alanı gösterir. (g) GÇ’i GRIN lensle görüntüleyin. A=5 mm’deki ölçek çubuğu, a-c için geçerlidir. Ölçek çubuğu d=2 mm, d-e için geçerlidir. Çubuğu f=2 mm olarak ölçeklendirin. Çubuğu g=2 mm olarak ölçeklendirin. 6. Kalsiyum görüntüleme Kalp atış hızı, oksijen doygunluğu ve nefes hızı gibi hayati belirtileri izlemek için SpO2 sensörünü farenin uyluğuna kelepçeleyin (Şekil 2b).NOT: Kalp atış hızı 500 bpm ile 600 bpm arasında olmalı, oksijen doygunluğu% 90’dan yüksek olmalı ve nefes hızı dakikada 50-70 nefes olmalıdır10,11. GRIN lens probunu (9 mm uzunluk. 1 mm çapında) implantasyon çubuğuna monte edin.NOT: İyi görüntüleme kalitesi için görüntülemeden önce GRIN lensi etanolle ıslatılmış temizleme dokusu ile temizleyin. İmplantasyon çubuğunu stereotaksik çerçeveye sabitlenin ve minyatür mikroskobu implantasyon çubuğuna monte edin.NOT: Minyatür mikroskobun görüntüleme için hazırlanması uygun ürün kullanıcı yönergelerine göre tamamlanmalıdır. GRIN lensin batırılması için beyin sapı alanına birkaç damla ılık salin ekleyin. Grin lens ile beyin sapına yaklaşın (Şekil 4d, 5g). Minyatür mikroskoptaki heyecan verici mavi LED’i (455 ± 8) açın. Minyatür mikroskoptan floresan görüntüsünü izleyerek GCaMP6s transfected IO nöronlarını bulun. Kalan atlasa dikdörtgen şeklindeki bir bölgede ~0,5-1,7 mm rostral ve ventral beyin sapının yüzeysel bölgesinde orta çizgiye ~0,6-1,1 mm yanal GÇ nöronları arayın (Şekil 5f).NOT: GÇ görüntüleme için uygun bir görüş alanı ararken, somatanın ortalama çapının GÇ nöron somatasınınkiyle eşleştiği yeri arayın (yaklaşık 15 μm12). Medüller retiküler formasyondaki bitişik bölgeler önemli ölçüde daha büyük hücrelerden oluşur13,14. GRIN lensi dikey olarak hareket ettirirken dikkatli olun, çünkü beyin sapına çok sert basmak hayvanı öldürebilir. 7. Prosedürü takip eden hayvan ötenazi Deney sonunda, hayvanı servikal çıkık veya yerel laboratuvar hayvan bakım yönetmeliği tarafından onaylanan başka bir yöntemle ötenazi yapın. Daha fazla histoloji araştırması için, önce hayvanı ketamin/ ksilazin kombinasyonu (sırasıyla 100 mg / kg ve 10 mg / kg) gibi enjekte edilebilir ilaçla uyuşturun, Ringer’ın çözeltisi ile kalp perfüzyondan önce15 ve ardından beyni düzeltmek için fiksatif çözelti. 8. Veri işleme Verileri analiz etmeden önce kaydedilen kalsiyum görüntüleme videosunu önceden işleyin.NOT: Minyatür mikroskop eşliğinde ticari veri işleme yazılımı bu adım için kullanılmıştır ve aşağıdaki protokol adımları bununla ilgilidir. Alternatif olarak, CaImAn16, MINIPIPE17ve MiniscoPy18 gibi ücretsiz ve açık kaynaklı yazılımlar hem ön işleme hem de analiz için kullanılabilir. Kaydedilen kalsiyum görüntüleme videosunu veri işleme yazılımına yükleyin. Önişlem düğmesini tıklatın. Floresan nöron içermeyen bölgeler hariç bir kırpma alanı tanımlayın ve daha hızlı işlem için dosya boyutunu azaltmak için videoyu kırpın. Uzamsal Filtre düğmesini tıklatın. Uzamsal filtre için düşük kesmeyi ve yüksek kesmeyi sırasıyla 0,005 piksel-1ve 0,5 piksel-1 olarak ayarlayın. Kontrastı artırmak ve görüntüyü yumuşatmak için videonun her karesine uzamsal filtre uygulayın.NOT: Uzamsal filtre bir bandpass Gauss filtresidir. Odak dışı hücrelerden kaynaklanan düşük uzamsal frekans bileşenleri, bir sonraki adımda hareket düzeltmesini şaşırtabilir. Yüksek uzamsal frekans bileşeni videonun daha az pürüzsüz görünmesine neden olabilir. Hareket Düzeltme düğmesini tıklatın. Beyin sapındaki kan akışının neden olduğu hareketle ilgili eserleri azaltmak için referans kare olarak ilk kareyi kullanarak videoya hareket düzeltmesini uygulayın.NOT: Hareket düzeltme, Thevenaz veark. Hareket düzeltilmiş videoyu TIFF biçimi olarak dışa aktarın. Çevrimiçidepodaki CNMF-E MATLAB kodu talimatlarını izleyerek tek nöronları tanımlamak için MATLAB’daki hareket düzeltilmiş videoya CNMF-E20 uygulayın.NOT: CNMF-E, tek foton görüntüleme için özelleştirilmiş kısıtlı negatif olmayan matris faktörizasyon yaklaşımıdır. Depodaki demo komut dosyaları değiştirilebilir ve verileri işlemek için kullanılabilir.