In vivo Imágenes de calcio en la aceituna inferior de ratón

Se siguieron todas las directrices internacionales, nacionales e institucionales aplicables para el cuidado y uso de animales. Las técnicas asépticas de la cirugía fueron aplicadas a la inyección stereotaxic del vector del virus. 1. Inyección de vectores de virus esteretáxicos NOTA: Virus portador del material genético para la expresión de GCaMP6s (AAV9. Cag. GCaMP6s.WPRE.SV40) se inyecta estereotáxicamente como se describió anteriormente7,8 con las siguientes modificaciones. Utilice vidrio de cuarzo (diámetro externo: 1,14 mm, diámetro interno: 0,53 mm) en lugar de vidrio de borosilicato para fabricar una pipeta con cono largo y rígido para inyección io utilizando un tirador capilar láser con parámetros ajustados como en el manual del producto. Después de tirar, cortar 1-2 mm de la punta de la pipeta con un bisturí para adquirir un cono de 8-10 mm de largo con un diámetro de punta interna de 15-20 μm (Figura 1a). Finalice la pipeta biselando su punta a una forma de aguja de 30 ° con un biselador de micropipeta giratorio para una penetración cerebral más fácil y menos flexión de la pipeta (Figura 1a).NOTA: La pipeta de vidrio de borosilicato comúnmente utilizada será demasiado flexible para apuntar correctamente a las áreas profundas cuando se tira a esta longitud. Un inyector del nanoliter fue utilizado con la pipeta de cristal para entregar el virus en este estudio. Alternativamente, también se puede usar una jeringa de vidrio de precisión o un inyector de presión. Asegúrese de que el cofre del ratón se encuentra en la almohadilla térmica para que su cuello no se estire con suficiente apoyo corporal, y tenga mucho cuidado con la nivelación del cráneo al fijar el ratón en el marco estereotáxico (Figura 1b).NOTA: La diferencia Bregma-lambda debe ser inferior a 0,05 mm en dimensión vertical. Utilice 6,2 mm caudal, ±0,5 mm lateral y 6,6 mm ventral en relación con la bregma como las coordenadas para apuntar al núcleo principal de IO (Figura 1c).NOTA: La nivelación perfecta del cerebro aumentará dramáticamente la tasa de éxito de la inyección de virus en IO. Las coordenadas deben ser confirmadas por el experimentador, ya que se esperan diferencias significativas entre laboratorios, cepas de ratón e investigadores individuales. Para preparar el material de vídeo para esta publicación, se utilizó un ratón macho C57Bl/6J. Siga las pautas institucionales pertinentes para la atención postoperatoria y los procedimientos de alojamiento para animales transfectados viralmente durante 3-4 semanas. Figura 1:Inyección de vector de virus estereotáxico. (a) La pipeta de vidrio de cuarzo tirada por láser tiene un cono recto de 10-12 mm de largo. Después de tirar, cortar 1-2 mm de la punta. La pipeta se finaliza biselando la punta a una forma de aguja de 30°. (b)La inyección correcta se basa en la posición adecuada del cuerpo del ratón en el marco estereotáxico. Apoye el pecho del ratón para evitar estirar el cuello. Nivele la cabeza del ratón alineando el bregma y lambda horizontalmente. (c)La coordinación IO relativa a la bregma se muestra en la vista dorsal (izquierda) del cráneo del ratón y la vista coronal (parte superior derecha) del cerebro. La inyección alcanza la parte lateral del subnúcleo principal (IOPr) y dorsal (IOD) de IO (parte inferior derecha). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura. 2. Preparación de herramientas y consumibles para cirugía de abordaje ventral Prepare un tubo de intubación cortando una hendidura de 5 a 6 mm de largo y 0,8 mm de ancho de la punta de un catéter de calibre 20 para que el animal intubado pueda exhalar (Figura 2a).NOTA: La rendija es necesaria para que el animal exhale si se utiliza un vaporizador de isoflurano común con flujo de aire constante. Si se utiliza un ventilador además del vaporizador, el catéter se puede dejar intacto. Prepare una aguja roma para apoyar la tráquea durante la traqueotomía. Corte la punta afilada de una aguja de calibre 25 con alicates. Alisar la superficie de fractura con papel de lija. Doble la aguja roma en el medio a unos 15° con alicates.NOTA: Una aguja curva levanta la tráquea suavemente. Esto puede disminuir la deformación de la tráquea. Diluir 50 mg/mL de ketamina con solución salina al 15%. La concentración final es de 7,5 mg/mL. Monte las herramientas de cirugía limpia y los consumibles, incluyendo gel de lidocaína, solución salina, esponjas de gelatina, hisopos absorbentes, vaselina y tejido de limpieza. Encienda el vaporizador de isoflurano. Fije la almohadilla de calentamiento animal a 38 °C. Gire el cono de la nariz del marco estereotáxico 180 ° horizontalmente, para que el ratón se pueda fijar en el lado ventral del marco hacia arriba. Ajuste la altura del cono de la nariz para que esté al nivel de las barras para los oídos. 3. Administración de anestesia y preparación del ratón para la cirugía Pesar al animal con una báscula de pesaje y calcular la cantidad de ketamina diluida para inyección.NOTA: La cantidad total de ketamina necesaria es de 56,25 mg por kg de peso corporal. Por lo tanto, el volumen de ketamina diluida es de 7,5 mL por kg de peso corporal. Los inconvenientes de usar ketamina sola incluyen mala relajación muscular, taquicardia y tono muscular mejorado9. En este protocolo, sin embargo, la ketamina sólo se utiliza para cubrir el período de 10-20 s durante el cual la administración de isoflurano se interrumpe debido a la traqueotomía. Al mantener este paso lo más breve posible, el efecto anestésico del isoflurano no disminuye significativamente y se minimizan los inconvenientes del uso de ketamina. Coloque el ratón en la cámara de inducción anestésica precargada con isoflurano al 5%. Cuando el animal está completamente anestesiado demostrado por la pérdida del reflejo corrector y el patrón de respiración más profundo y lento, cambie el flujo de isoflurano al cono de la nariz del marco estereotáxico y reduzca la concentración de isoflurano al 2,5%. Fijar el animal en el marco estereotáxico del lado ventral hacia arriba (Figura 2b). Ajuste la elevación y el tono del cono de la nariz para asegurarse de que el animal pueda respirar fácilmente. Mantenga al animal caliente con la almohadilla de calentamiento precalentada.NOTA: Cubrir la parte inferior del cuerpo del animal con un pedazo de papel de seda o papel de aluminio puede ayudar a mantener la temperatura del animal. Retire el vello de la piel en las zonas de garganta y muslos con una afeitadora y crema de depilación (Figura 2b). Aplique tópicamente el gel de lidocaína en la piel de la garganta.NOTA: El sensor de saturación periférica de oxígeno (SpO2)de la abrazadera del muslo, que se utilizará en el procedimiento 6, funciona mejor en la piel sin pelo. Controlar la temperatura del animal con un termómetro rectal(Figura 2b). Inyecte 1 mL de solución salina caliente (37 °C) por vía intraperitoneal para compensar la pérdida de líquido durante la cirugía. Evaluar la profundidad de la anestesia por un fuerte pellizco en los dedos de los miembros posteriores. No se debe evocar ninguna respuesta detectable. Figura 2:Preparación de la cirugía de aproximación ventral. (a)Preparar un tubo de intubación cortando una hendidura de 5-6 mm de largo y 0,8 mm de ancho en la punta del catéter de calibre 20. b) Monte el lado ventral del animal en un marco estereotáxico y ajuste el ángulo del cono de la nariz para asegurarse de que el animal respira fácilmente. Afeitarse la piel alrededor de las áreas de la garganta y los muslos. Conecte el sensor SpO2 al muslo para monitorear los signos vitales del ratón. Inserte la sonda de temperatura rectal para controlar la temperatura corporal del ratón. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura. 4. Traqueotomía e intubación (20-25 min) Exponiendo la tráquea. Haga una incisión vertical en la piel de la garganta a lo largo de la línea media. Separe la piel del cuello de las vísceras debajo de ella mediante el método de disección contundente y corte la piel para revelar las glándulas salivales (Figura 3a-b, 4a). Libere las glándulas salivales del tejido conectivo y voltételas lateralmente para exponer la tráquea cubierta de músculo esternotiroideo con fórceps (Figura 3b-c).NOTA: La vaselina se puede aplicar sobre el tejido expuesto para mantenerlos húmedos. Evite el área de la tráquea para mantenerla limpia durante los siguientes pasos. traqueotomía Inyecte la primera dosis de ketamina diluida (7,5 mg/mL) por vía intraperitoneal, 5 mL por kg de peso corporal (37,5 mg/kg).NOTA: Se necesitan 3-5 minutos para que la ketamina funcione, por lo tanto, la primera dosis de ketamina debe inyectarse antes de separar la tráquea de los músculos y vasos sanguíneos circundantes. La ketamina se administra en dos inyecciones debido al riesgo elevado de efectos de sobredosis cuando se combina con anestesia con isoflurano. Divida cuidadosamente el músculo esternotiroideo a lo largo de la línea media con la punta de un fino fórceps para exponer la tráquea(Figura 3c). Desprenda la tráquea de los vasos sanguíneos y el esófago con fórceps utilizando el método de disección contundente. Inyecte por vía intraperitoneal la segunda dosis de ketamina diluida (7,5 mg/mL), 2,5 mL por kg de peso corporal (18,75 mg/kg). Inserte una aguja roma debajo de la tráquea de forma transversal para apuntalarla (Figura 3d). Sostenga esta aguja con los dedos para apoyar la tráquea. Guía el hilo de sutura alrededor del tercer anillo de tráquea caudal hasta la glándula tiroides con una aguja de semicírculo (Figura 3d). Haga cuatro lazos de instrumentos en este anillo traqueal.NOTA: El hilo atado al anillo traqueal se utiliza para asegurar la tráquea al pecho del animal. No corte el hilo de la aguja del semicírculo en este paso. Los anillos traqueales están hechos de cartílago que es flexible pero menos fuerte que los huesos. No ate el hilo de la sutura demasiado apretado o el anillo puede romperse. Pellizque la piel del pecho con un par de pinzas. Perforar la piel del pecho con la misma aguja de semicírculo utilizada en el último paso y conducir el hilo a través de la piel, en preparación para asegurar la tráquea al pecho en el siguiente paso (Figura 3d). Levante suavemente la tráquea tirando del hilo atado al anillo traqueal y corte la tráquea rostral al anillo atado y caudal a las glándulas tiroides. Tire de la tráquea caudal hacia el pecho. Levante la abertura de la tráquea agregando un pequeño pedazo de esponja quirúrgica debajo de ella.NOTA: Asegúrese de que hayan pasado más de 5 min después de la segunda inyección de ketamina antes de cortar la tráquea para asegurar el nivel de anestesia. Retire cualquier líquido restante dentro de la punta de apertura de la tráquea con una tira delgada de tejido de limpieza. Cambie el flujo de isoflurano del cono de la nariz estereotáxica al tubo de intubación. Inserte el tubo de intubación en la tráquea a unos 2 mm de profundidad y asegúrese de que parte de la rendija en el tubo permanezca fuera de la tráquea para permitir la respiración(Figura 3e,4b).NOTA: Ajuste cuidadosamente el ángulo del tubo de intubación y su profundidad de inserción para que el ratón respire suavemente y para evitar dañar la tráquea. La vaselina se puede aplicar en el exterior de la tráquea para evitar que se seque, por lo que la tráquea no se rompe fácilmente. Fije la tráquea a la piel del pecho haciendo 3-4 lazos instrumentales. Ate la tráquea con el hilo de sutura para asegurar el tubo de intubación(Figura 3e,4b). Figura 3:Traqueotomía e intubación de ratón. (a-c) los paneles muestran el proceso de exposición de la tráquea. (a ) Retire la piel de la garganta cortando a lo largo de las líneas discontinuas. (b)Voltear las glándulas salivales (SG) lateralmente para exponer la tráquea cubierta por el músculo esternotiroideo (SM). c) Hendidura abierta SM a lo largo de la línea discontinua para exponer la tráquea. (d-e) los paneles muestran la traqueotomía. (d) Apoyar la tráquea con una aguja roma y curvada. Ate el tercer anillo de tráquea caudal a la glándula tiroides para asegurar la tráquea a la piel del pecho. (e)Aplicar isoflurano con un tubo de intubación con una hendidura en la punta. Asegure la tráquea a la piel del pecho con el hilo de sutura. Asegure el tubo de intubación a la tráquea atándolos juntos. Barra de escala en a = 5 mm, se aplica a todos los paneles. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura. Figura 4:Diagrama esquemático de la cirugía de aproximación ventral desde la vista lateral. (a)Un dibujo esquemático con partes anatómicas relevantes indicadas en su ubicación relativa cuando el ratón se coloca de lado ventral hacia arriba. Abreviaturas: atlas de cobertura muscular (AM), músculo longitudinal (LM), glándulas salivales (SG), músculo esternotiroideo (SM), glándula tiroides (TG). b) Esquema de disposición del tubo de intubación en relación con la tráquea cuando se completa la traqueotomía. La tráquea está asegurada por los lazos en la piel del pecho (T-tráquea). El tubo de intubación (IT) está asegurado por los lazos alrededor del extremo de la tráquea (tubo en T). (c)Retire el tubérculo anterior del atlas (AAT) para despejar la línea de visión a la IO. (d) Esquemático que describe la posición del microscopio en miniatura (MM) y la lente GRIN por encima de la IO para el experimento de imagen. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura. 5. Exponer el tronco encefálico (40-45 min) Hendidura el músculo esternotiroideo a lo largo de la fibra muscular con las medidas de control fino. Corte la parte aislada con las tijeras de resorte (Figura 3e). Libere cuidadosamente la tráquea sobrantes y la laringe de los músculos para minimizar el daño en los vasos sanguíneos en los músculos. Retire la tráquea sobrada y la laringe. Libere el esófago del tejido adjunto con fórceps y córtuelo con tijeras de resorte. (Figura 5a). Retirar el músculo que cubre el arco ventral y el tubérculo anterior del atlas con fórceps finos y tijeras de resorte (Figura 5b).NOTA: Al retirar el músculo, divida parte del mismo con la punta de los fórceps finos. Corte la parte separada con un par de tijeras de resorte. Repita esto varias veces para exponer el arco ventral atlas para minimizar el riesgo de rasgar los vasos sanguíneos. Cortar los arcos ventrales del atlas con un rongeur (Figura 4c, 5c). Retire el tubérculo anterior del atlas. Retire la sangre y el líquido con esponja quirúrgica para ver el agujero magno y el tronco encefálico (Figura 4c, 5d). Expanda el foramen magnum eliminando el hueso occipital con un rongeur. (Figura 5d-e). Retire el cartílago delgado por encima del foramen magno con brocas finas y tijeras de resorte. Pelar cuidadosamente la capa perióstico de la duramadre con fórceps finos para tener una visión clara del tronco encef ventral (Figura 5f). No rompa la duramadre. Figura 5:Exponer el tronco encefálico del ratón para obtener imágenes de calcio. (a-f) los paneles muestran el proceso de exposición del tronco encefálico. (a) Retirar el músculo esternotiroideo (SM) marcado en la Figura 3e. Cortar la laringe y el esófago. (b)Retire el músculo longitudinal (LM) y el atlas de cobertura muscular (AM). (c) Cortar los arcos ventrales del atlas (AVA) con un rongeur y retirar el tubérculo anterior del atlas (AAT). d) Cortar el hueso occipital (OB) para expandir el foramen magno (FM). e) FM expandida. (f) Se elimina el cartílago delgado por encima del agujero magno. La capa perióstico de duramadre se desprende. El cuadrado indica el área que contiene neuronas IO superficiales. (g)Imagen de la IO con lente GRIN. Barra de escala en a=5 mm, se aplica a a-c. Barra de escala en d=2 mm, se aplica a d-e. Barra de escala en f=2 mm. Barra de escala en g=2 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 6. Imágenes de calcio Sujete el sensor SpO2 en el muslo del ratón para monitorizar signos vitales como la frecuencia cardíaca, la saturación de oxígeno y la frecuencia respiratoria(Figura 2b).NOTA: La frecuencia cardíaca debe estar entre 500 lpm y 600 lpm, la saturación de oxígeno debe ser superior al 90%, y la frecuencia respiratoria debe ser de 50-70 respiraciones por minuto10,11. Monte la sonda de lente GRIN (9 mm de longitud. 1 mm de diámetro) en la varilla de implantación.NOTA: Limpie la lente GRIN con un 70% de tejido de limpieza empapado en etanol antes de obtener imágenes para obtener una buena calidad de imagen. Fije la varilla de implantación en el marco estereotáxico y monte el microscopio en miniatura en la varilla de implantación.NOTA: La preparación del microscopio en miniatura para la obtención de imágenes debe completarse de acuerdo con las directrices apropiadas para el usuario del producto. Agregue varias gotas de solución salina caliente en el área del tronco encefálico para la inmersión de la lente GRIN. Acércate al tronco encefálico con la lente GRIN(Figura 4d,5g). Encienda el LED azul de excitación (455 ± 8) en el microscopio en miniatura. Localice las neuronas IO transfectadas por GCaMP6s mediante el monitoreo de la imagen de fluorescencia desde el microscopio en miniatura. Busque neuronas IO en una región en forma de rectángulo ~ 0.5-1.7 mm rostral al atlas restante y ~ 0.6-1.1 mm lateral a la línea media en el área superficial del tronco encefálico ventral (Figura 5f).NOTA: Al buscar un campo de visión apropiado para las imágenes de IO, busque la ubicación donde el diámetro promedio de somata coincide con el de la somata de la neurona IO (aproximadamente 15 μm12). Las regiones adyacentes en la formación reticular medular consisten en células significativamente más grandes13,14. Tenga cuidado al mover la lente GRIN verticalmente, ya que presionarla en el tronco cerebral con demasiada fuerza puede matar a los animales. 7. Eutanasia animal siguiendo el procedimiento Al final del experimento, eutanasiar al animal con dislocación cervical u otro método aprobado por la regulación local de cuidado de animales de laboratorio. Para una mayor investigación histológico, primero anestesiar al animal con fármaco inyectable, como la combinación de ketamina/xilazina (100 mg/kg y 10 mg/kg, respectivamente)15 antes de la perfusión cardíaca con la solución de Ringer seguida de una solución fijadora para fijar el cerebro. 8. Tratamiento de datos Preprocese el video de imágenes de calcio grabado antes de analizar los datos.NOTA: El software de procesamiento de datos comercial acompañado con el microscopio en miniatura se utilizó para este paso y los siguientes pasos de protocolo se relacionan con eso. Alternativamente, el software libre y de código abierto como CaImAn16,MINIPIPE17y MiniscoPy18 se puede utilizar tanto para el preprocesamiento como para el análisis. Cargue el vídeo de imágenes de calcio grabado en el software de procesamiento de datos. Haga clic en el botón Preprocesar. Defina un área de cultivo excluyendo regiones sin neuronas fluorescentes y recorte el video para disminuir el tamaño del archivo para un procesamiento más rápido. Haga clic en el botón Filtro espacial. Establezca el límite bajo y el límite alto para el filtro espacial en 0,005 píxeles-1y 0,5 píxeles-1, respectivamente. Aplique el filtro espacial en cada fotograma del vídeo para aumentar el contraste y suavizar la imagen.Nota: El filtro espacial es un filtro gaussiano de paso de banda. Los componentes de baja frecuencia espacial que se originan en celdas fuera de foco pueden confundir la corrección de movimiento en el siguiente paso. El componente de alta frecuencia espacial puede hacer que el vídeo parezca menos suave. Haga clic en el botón Corrección de movimiento. Aplique la corrección de movimiento al vídeo utilizando el primer fotograma como sistema de referencia para reducir los artefactos relacionados con el movimiento causados por el flujo sanguíneo en el tronco encefálico.NOTA: La corrección de movimiento utiliza un método de registro de imágenes desarrollado por Thevenaz et al19. Exporte el vídeo corregido en movimiento como formato TIFF. Aplique CNMF-E20 en el vídeo corregido por movimiento en MATLAB para identificar neuronas individuales, siguiendo las instrucciones para el código MATLAB cnmf-e en el repositorio en línea21.NOTA: CNMF-E es un enfoque de factorización de matriz no negativa restringido personalizado para imágenes de un fotón. Los scripts de demostración del repositorio se pueden modificar y utilizar para procesar datos.