インビボ マウス劣オリーブにおけるカルシウムイメージング

動物のケアと使用に関するすべての適用可能な国際、国内、制度的ガイドラインに従った。無菌手術技術を立体性ウイルスベクター注射に適用した。 1. 立体ウイルスベクターインジェクション 注:GCaMP6sを発現するための遺伝物質を運ぶウイルス(AAV9.CAG.GCaMP6s.WPRE.SV40)は、前に述べたように立体的に注入される7,8以下の修飾を伴う。 石英ガラス(外径:1.14mm、内径:0.53mm)を使用して、製品マニュアルのように調整されたパラメータを持つレーザーキャピラリープーラーを使用して、IO注入用の長くて硬いテーパーでピペットを製造します。引っ張った後、ピペットの先端から1〜2mmをメスで切り取り、15〜20μmの内先端径を持つ8〜10mmの長テーパーを取得します(図1a)。回転マイクロピペットベベラーで30°針の形に先端をベベルしてピペットを完成させ、脳の浸透を容易にし、ピペットの屈曲を減らします(図1a)。注:一般的に使用されるホウケイ酸塩ガラスピペットは、この長さに引っ張られたときに正しく深い領域をターゲットにするには、あまりにも柔軟になります。ナノリットルインジェクターは、この研究でウイルスを提供するためにガラスピペットと一緒に使用されました.あるいは、精密ガラス注射器または圧力インジェクターも使用することができる。 マウスの胸部がサーマルパッドの上にあることを確認して、首が十分なボディサポートで引き伸ばされないようにし、ステレオタックスフレーム(図1b)でマウスを固定する際に頭蓋骨を平準化することに非常に注意してください。注: ブレグマ-ラムダの差は、垂直寸法で 0.05 mm 未満にする必要があります。 主なIO核を標的とする座標として、6.2mmカウダル、±0.5mm横長、および6.6mmの側腹を主なIO核を標的とする座標として使用する(図1c)。注:脳の完璧なレベリングは劇的にIOにウイルスを注入する成功率を増加させます.実験室、マウス株および個々の研究者間の有意な相違が予想されるように、座標は実験者によって確認されなければならない。この出版物のためのビデオ材料を準備するために、我々は1つの雄のC57Bl / 6Jマウスを使用しました。 ウイルス感染動物の術後ケアおよび住宅手順に関する関連する制度ガイドラインに3〜4週間従ってください。 図1:ステレオタキシックウイルスベクターインジェクション(a)レーザープルドクォーツガラスピペットは、長さ10〜12mmのストレートテーパーを有する。引っ張った後、先端から1〜2mmを切り落とします。ピペットは、先端を30°針状にベベルすることで完成します。(b)正しい射出は、ステレオタキシックフレーム内のマウス本体の適切な位置に依存する。マウスの胸を支えるので、首を伸ばさないようにします。ブレグマとラムダを水平に整列させることで、マウスヘッドを水平にします。(c)bregmaに対するIO協調は、脳のマウス頭蓋骨とコロナのビュー(右上)の後側のビュー(左)で示される。注射は、主体の側側部分(IOPr)およびIO(右下)の側側(IOD)下核に到達する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 2. 腹側アプローチ手術用ツールと消耗品の調製 20ゲージのカテーテルの先端から長さ5~6mm、幅0.8mmのスリットを切って挿管チューブを用意し、挿管動物が息を吐き出せるようにします(図2a)。注:一定の気流を持つ一般的なイソフルラン気化器を使用する場合、スリットは動物が息を吐くために必要です。気化器に加えて人工呼吸器を使用する場合、カテーテルはそのまま残すことができます。 気管切開中に気管を支えるために鈍い針を準備します。25ゲージの針の先端をペンチで切り落とします。紙で破断面を滑らかにします。ペンチで約15°の真ん中に鈍い針を曲げ.注:湾曲した針は気管を穏やかに持ち上げます。これにより、気管の変形が減少します。 50 mg/mL ケタミンを生理食塩水で 15% に希釈します。最終濃度は7.5mg/mLです。 清潔な手術ツールとリドカインゲル、生理食糸、ゼラチンスポンジ、吸収綿棒、石油ゼリー、洗浄ティッシュなどの消耗品を組み立てます。 イオフルーラン気化器のスイッチを入れ。動物の加熱パッドを38°Cに設定します。 ステレオタックスフレームの鼻コーンを水平に180°回転させ、マウスをフレーム腹側に固定できるようにします。鼻のコーンの高さを、イヤーバーのレベルになるように調整します。 3. 麻酔の投与と手術のためのマウスの準備 体重計で動物の重量を量り、注射のための希釈ケタミンの量を計算します。注: 必要なケタミンの合計量は 56.25 体重当たり mg.そのため、希釈ケタミンの体積は、体重1kg当たり7.5mLです。ケタミンを単独で使用することの欠点は、貧しい筋肉弛緩、頻脈および強化された筋肉の緊張9を含む。しかし、このプロトコルでは、ケタミンは、気管切開のためにイソフルラン投与が中断される10〜20の期間をカバーするためにのみ使用される。このステップをできるだけ簡潔にしておくことで、イオブルランの麻酔効果は著しく低下せず、ケタミンを用いた欠点は最小限に抑えられる。 5%のイオブルランをあらかじめ充填した麻酔誘導室にマウスを入れます。動物が完全に麻酔が行われると、右反射の喪失と深く、より遅い呼吸パターンが、イソフルランの流れを立体フレームの鼻コーンに切り替え、イソフルラン濃度を2.5%に減らす。 立体フレーム腹側の動物を上に固定します(図2b)。動物が簡単に呼吸できることを確認するために、鼻コーンの標高とピッチを調整します。事前に温めた暖房パッドで動物を暖かく保ちます。注:動物の体の下部をティッシュペーパーまたはアルミホイルで覆うことは、動物の温度を維持するのに役立ちます。 ●こどや太ももの部分の皮膚毛を剃り、脱毛クリームで取り除く(図2b)。喉の皮膚にリドカインゲルを局所的に塗布する。メモ:手順6で使用される大腿クランプの末梢酸素飽和度(SpO2)センサーは、無毛の皮膚に最適です。 直腸温度計で動物の温度を監視します(図2b)。 手術中の体液損失を補うために、腹腔内に1mLの温かい(37°C)腹腔内注射を行います。 後肢の足指に強いピンチで麻酔の深さを評価します。検出可能な応答を呼び出すべきではありません。 図2:腹側アプローチ手術の準備(a)20ゲージカテーテル先端部に長さ5~6mm、幅0.8mmのスリットを切断して挿管チューブを用意する。(b)動物側を立体的なフレームに取り付け、鼻の円錐角を調整して動物が呼吸しやすいようにします。喉と太ももの領域の周りの皮膚を剃ります。マウスのバイタルサインを監視するために、大腿にSpO2センサーを取り付けます。マウスの体温を監視するために直腸温度プローブを挿入します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 4. 気管切開術と挿管 (20-25 分) 気管を露出する。 正中線に沿って喉の皮膚に垂直切開を行います。鈍い解剖法を用いて頸部皮膚を下の内臓から分離し、唾液腺を明らかにするために皮膚を切り落とす(図3a-b、4a)。 結合組織から唾液腺を解放し、それらを横方向に反転させ、気管を覆ったステ無甲状腺の筋肉を鉗子で露出させる(図3b-c)。注:石油ゼリーは、それらを湿らせた保つために露出した組織に適用することができます。気管領域を避けて、次の手順で清潔に保ちます。 気管 切開 術 最初の用量の希釈ケタミン(7.5 mg/mL)の腹腔内、体重1kg当たり5mL(37.5mg/kg)を注入する。注:ケタミンが機能するには3〜5分かかりますので、周囲の筋肉や血管から気管を分離する前にケタミンの最初の用量を注入する必要があります。ケタミンは、イオブルラン麻酔と組み合わせると過剰摂取効果のリスクが高いため、2回の注射で投与される。 細かい鉗子の先端で中線に沿ってステ無甲状腺の筋肉を慎重に分割して気管を露出させる(図3c)。鈍い解剖法を使用して、血管と食道から気管を鉗子で取り外します。 腹腔内注射した2回目の希釈ケタミン(7.5mg/mL)、体重1kg当たり2.5mL(18.75mg/kg)を注入する。 気管の下に鈍い針を横方向に挿入して支える(図3d)。気管を支えるために指でこの針を持ちます。第3気管リングの周りの縫合糸を半円の針で甲状腺に導く(図3d)。この気管リングに4つの楽器のネクタイを作ります。注意:気管リングに結ばれた糸は、動物の胸部に気管を固定するために使用されます。このステップでは、半円針から糸を切り落とさないで下さい。気管リングは軟骨でできており、軟骨は骨よりも柔軟性はありますが、強度は低いです。縫合糸をきつく締めすぎないように、またはリングが壊れることがあります。 鉗子のペアで胸の皮膚をつまみます。最後のステップで使用したのと同じ半円の針で胸部の皮膚を突き刺し、次のステップで胸部に気管を固定する準備として、糸を皮膚に通す(図3d)。 気管リングに結ばれた糸を引っ張って気管をそっと持ち上げ、気管のrostralを結ばれたリングに切り、甲状腺に尾を引きます。尾大気管を胸に向かって引っ張ります。その下に手術用スポンジの小片を追加することによって気管の開口部を上げます。注:麻酔レベルを確保するために気管を切断する前にケタミンの2回目の注射後に5分以上経過していることを確認してください。 洗浄ティッシュの薄いストリップと気管の開口部の先端の中に残っている液体を取除きます。ステレオタックスノーズコーンから挿管チューブにイオブルランの流れを切り替えます。チューブチューブを深さ約2mmの気管に挿入し、チューブ内のスリットの一部が気管の外側に残っていることを確認して呼吸を可能にする(図3e、4b)。注:慎重に挿管チューブとその挿入深さの角度を調整して、マウスの息をスムーズにし、気管を損傷しないようにします。油性ゼリーは気管の外側に塗布して乾燥を防ぐことができるので、気管が容易に破裂することはありません。 3-4インストゥルメンタルタイズを作ることによって胸の皮膚に気管を固定します。管管を縫合糸で結び、挿管管を固定します(図3e、4b)。 図3: 気管切開とマウスの挿管(a-c)パネルは気管を露出するプロセスを示す。() 破線に沿って切って喉の皮膚を取り除く。(b) 唾液腺(SG)を横方向に反転させ、ステノ甲状腺筋(SM)で覆われた気管を露出させる。(c) スリットは、破線に沿って SM を開き、気管を露出する。(d-e) パネルは気管切開を示す。(d) 鈍い湾曲した針で気管を支える。胸部の皮膚に気管を固定するために甲状腺に3番目の気管リング尾部を結びます。(e)先端にスリットが付いている挿管管でイソフルランを適用する。縫合糸で胸部の皮膚に気管を固定します。挿管チューブを一緒に結ぶことによって気管に固定します。スケールバーはa =5 mmで、すべてのパネルに適用されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図4:横方向から腹側アプローチ手術の模式図を 示す図(a)マウスが腹側を上に置いたときに、関連する解剖学的部分が相対的な位置に示された模式図。略語: 筋肉被覆アトラス (AM), 縦筋 (LM), 唾液腺 (SG), ステノ甲状腺筋肉 (SM), 甲状腺 (TG).(b)気管切開が完了したときの気管に関する挿管管の配置の概略。胸部の皮膚の結びつき(T気管)によって気管が固定される。挿管管チューブ(IT)は、気管端(Tチューブ)の周囲のネクタイによって固定されています。(c) アトラス前ツベル(AAT)を取り外して、IOに対する視線をクリアします。(d)撮像実験用IO上のミニチュア顕微鏡(MM)とGRINレンズの位置を説明する回路図。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 5. 脳幹の露出 (40-45 分) 細かい鉗子で筋線維に沿って、ステノ甲状腺の筋肉をスリットします。スプリングハサミで孤立した部分を切り落とします(図3e)。 筋肉の血管の損傷を最小限に抑えるために、残った気管と喉頭を筋肉から慎重に解放します。残った気管と喉頭を取り除く。鉗子で付着した組織から食道を解放し、春のはさみでそれを切り落とす。(図5a) 腹側のアーチを覆う筋肉とアトラスの前塊茎を細かい鉗子とスプリングハサミで取り除く(図5b)。注:筋肉を取り除くときは、細かい鉗子の先端で筋肉の一部を分割します。分離した部分をスプリングハサミで切り落とします。これを何度も繰り返して、アトラス腹側のアーチを露出して血管を裂くリスクを最小限に抑えます。 アトラスの腹側のアーチをロンギュールで切る(図4c、5c)。アトラスの前塊茎を取り除く。手術用スポンジで血液と体液を取り除き、頭脳のマグナムと脳幹を見る(図4c、5d)。 後頭部の骨をロンギュールで取り除くことによって、前頭部のマグナムを拡大する。(図 5d-e) 細かい鉗子とスプリングハサミで、前衛マグナムの上の薄い軟骨を取り除きます。硬膜の骨膜層を細かい鉗子で慎重に剥がし、腹側脳幹をはっきりと見えるようにする(図5f)。デュラマーターを壊さないで下ろしてください。 図5: カルシウムイメージング用マウスの脳幹を露呈する。(a-f)パネルは脳幹を露出するプロセスを示す。()図3eに標識されたステム甲状腺筋(SM)を取り外します。喉頭と食道を切り落とします。(b) 縦筋(LM)と筋肉被覆アトラス(AM)を取り除く。(c) アトラス腹側アーチ(AVA)をロンギュールで切断し、アトラス前塊茎(AAT)を取り除く。(d)後頭部骨(OB)を切り落とし、前頭部(FM)を拡大する。(e)拡張FM. (f) 前門のマグナムの上の薄い軟骨が除去される。デュラマーターのペリオスチール層は剥がれます。正方形は表面的なIOニューロンを含む領域を示す。(g)Gは、GRINレンズを使用してIOを画像化します。スケールバーはa=5 mmで、a-cに適用されます。d=2 mm のスケールバーは d-e に適用されます。f = 2 mm のスケール バー。g=2 mm のスケール バーをクリックして、この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 6. カルシウムイメージング マウスの太ももにSpO2センサーをクランプして、心拍数、酸素飽和度、呼吸速度などのバイタルサインを監視します(図2b)。注:心拍数は500 bpmと600 bpmの間で、酸素飽和度は90%より高く、呼吸率は毎分10、11回50〜70呼吸でなければなりません。 GRINレンズプローブ(長さ9mm、直径1mm)を注入ロッドに取り付けます。注:イメージング品質を高める前に、70%エタノール浸し洗浄組織でGRINレンズを洗浄してください。 ステレオタックスフレームに埋め込みロッドを固定し、移植ロッドにミニチュア顕微鏡を取り付けます。注: イメージング用の小型顕微鏡の準備は、適切な製品ユーザーガイドラインに従って完了する必要があります。 GRINレンズを浸漬するために、脳幹領域に温かい生理食糸を数滴加えます。 GRINレンズ(図4d、5g)で脳幹に近づく。ミニチュア顕微鏡の励起ブルーLED(455±8)をオンにします。ミニチュア顕微鏡から蛍光画像を監視することにより、GCaMP6sトランスフェクションIOニューロンを見つけます。残りのアトラスに対して~0.5~1.7mmの四角形の領域でIOニューロンを探し、腹側脳幹の表面領域の中線に対して〜0.6-1.1mmの横方向を探す(図5f)。注:IOイメージングの適切な視野を探す場合は、ソマタの平均直径がIOニューロンソマタの平均直径と一致する場所を探します(約15 μm12)。髄質網状形成における隣接領域は、有意に大きい細胞13、14から成る。GRINレンズを垂直に動かす際には、脳幹に強く押し込みすぎると動物が死ぬ可能性があるため、注意してください。 7. 安楽死させる動物の手順 実験の終わりに、子宮頸部脱臼または地元の実験動物の治療規則によって承認された他の方法で動物を安楽死させる。 さらなる組織学の調査のために、最初にケタミン/キシラジンの組み合わせ(それぞれ100mg/kgと10 mg/kg)15リンガーの溶液で心臓灌流の前に、脳を固定するための固定液を続ける注射薬で動物を麻酔する。 8. データ処理 記録されたカルシウムイメージングビデオを事前に処理してから、データを分析します。注: ミニチュア顕微鏡に付属する商用データ処理ソフトウェアは、このステップに使用され、次のプロトコル手順はそれに関連しています。また、CaImAn 16、MINIPIPE 17、MiniscoPy18などのフリーでオープンソースのソフトウェアを、前処理と分析の両方に利用することもできます。 記録されたカルシウムイメージングビデオをデータ処理ソフトウェアにロードします。 [ 前処理 ] ボタンをクリックします。蛍光ニューロンのない領域を除くトリミング領域を定義し、より高速な処理のためにファイルサイズを小さくするためにビデオをトリミングします。 [ 空間フィルター ] ボタンをクリックします。空間フィルタのカットオフとハイカットオフをそれぞれ 0.005 ピクセル-1、0.5 ピクセル-1 に設定します。ビデオの各フレームに空間フィルターを適用して、コントラストを高め、画像を滑らかにします。注: 空間フィルタはバンドパス ガウス フィルタです。焦点が合っていないセルから発生する低空間周波数成分は、次のステップでモーション補正を混乱させる可能性があります。高空間周波数成分は、ビデオの滑らかさを低下させる原因となる場合があります。 [モーション補正]ボタンをクリックします。最初のフレームを基準フレームとして使用して、脳幹の血流によって引き起こされる動き関連のアーティファクトを減らすことによって、動画にモーション補正を適用します。注意:モーション補正は、Thevenazら19によって開発された画像登録方法を使用しています。 モーション補正ビデオを TIFF 形式で書き出します。 オンラインリポジトリ21 のCNMF-E MATLABコードの指示に従って、単一のニューロンを識別するためにMATLABの動き補正ビデオにCNMF-E20を適用する。注: CNMF-E は、1 光子イメージング用にカスタマイズされた、制約付き非負行列ファクタリゼーションアプローチです。リポジトリ内のデモ スクリプトは、データの処理に変更および使用できます。