אין ויוו הדמיית סידן בעכבר זית נחות
Summary
אנו מציגים פרוטוקול לחשוף את גזע המוח של עכבר בוגר מהצד הגחוני. באמצעות עדשת מדד שבירה הדרגתית עם מיקרוסקופ מיניאטורי, ניתן להשתמש בהדמיית סידן כדי לבחון את הפעילות של סומטה עצבית זית נחותה ב- vivo.
Abstract
זית נחות (IO), גרעין במדולה הגחונית, הוא המקור היחיד לסיבים מטפסים היוצרים את אחד משני מסלולי הקלט הנכנסים למוטל המוח הקטן. IO הוצע זמן רב להיות חיוני עבור שליטה מוטורית ופעילותה נחשבת כיום במרכז השערות רבות של תפקודים מוטוריים וקוגניטיביים של המוח הקטן. בעוד הפיזיולוגיה והתפקוד שלה נחקרו היטב יחסית ברמה חד-תאית במבחנה, כיום אין דיווחים על ארגון פעילות רשת IO בבעלי חיים חיים. זאת בעיקר בשל המיקום האנטומי המאתגר ביותר של ה- IO, מה שמקשה על הכפוף לשיטות הדמיה פלואורסצנטיות קונבנציונליות, שבהן יש ליצור נתיב אופטי דרך המוח כולו הממוקם באופן דורסי לאזור העניין.
כאן אנו מתארים שיטה חלופית להשגת נתוני דימות סידן ברמה העדכנית ביותר מרשת ה- IO. השיטה מנצלת את המיקום הגחוני הקיצוני של ה- IO וכוללת הליך כירורגי להחדרת עדשת אינדקס שבירה הדרגתית (GRIN) דרך הקרביים בצוואר כדי לבוא במגע עם פני השטח הגחוניים של חיישן הסידן GCaMP6s-מבטא IO בעכברים מורדמים. הקלטת דימות סידן מייצגת מוצגת כדי להדגים את ההיתכנות להקליט פעילות נוירון IO לאחר הניתוח. אמנם מדובר בניתוח שאינו הישרדותי ויש לבצע את ההקלטות בהרדמה, אך הוא מונע פגיעה בגרעיני גזע המוח הקריטיים לחיים ומאפשר לבצע מגוון רחב של ניסויים החוקרים דפוסי פעילות מרחבית ושילוב קלט בקלט. הליך זה עם שינויים יכול לשמש להקלטות באזורים אחרים, סמוכים של גזע המוח הגחוני.
Introduction
המטרה העיקרית של מדעי המוח במערכות היא להבין כיצד דפוסי פעילות מרחבית של רשתות עצביות תורמים ליצירת התנהגות בעלי חיים. לפיכך, מתודולוגיית הדמיה פלואורסצנטית העושה שימוש בבדיקות רגישות לסידן הפכה בעשור האחרון לכלי מרכזי לבחינת פעילות רשת עצבית בבעליחיים 1,2 , שכן היא מאפשרת הדמיה שלדינמיקהכזו על פני קשקשים מרחביים החל מתאים בודדים ועד מעגלים מזוקלים. בשנים האחרונות, הגישה הנפוצה שבה מעגלים עצביים במבני מוח שטחיים (כגון קליפות מוח או מוחיות) מצוידים דרךחלון גולגולתי שקוף 3 הושלם עם השימוש של אינדקס שביר שבירה (GRIN) עדשות4 המאפשר בדיקה של דינמיקת הרשת במבני מוח עמוקים. עדשות GRIN הזמינות כיום מאפשרות להגיע למבנים בעומק של כמה מילימטרים, כגון האמיגדלה של העכבר, ההיפוקמפוס והגרעינים הבסיסיים5. עם זאת, אזורים רבים של עניין כגון גרעינים שונים במדולה הגחוני לשכב עמוק יותר באופן משמעותי, הצבת אותם בקצה של עדשת GRIN להגיע.
כאן, אנו מתארים כיצד להתגבר על קושי זה על ידי ניצול הנגישות הקלה יחסית של medulla דרך ההיבט הגחוני של המוח. באמצעות עכברים בוגרים שבהם הזית הנחות (IO), גרעין במדולה הגחונית, נחתך ויראלית עם חיישן סידן GCaMP6s, אנו מתארים את הצעדים הכירורגיים (שונה מהשיטה המתוארת במקור Khosrovani et al. 20076) כדי למקם עדשת GRIN על פני השטח הגחוני של המוח של עכבר מורדם. באמצעות מיקרוסקופ מיניאטורי, אנו מדגימים את ההיתכנות של רישום פעילות עצבית באזורי מוח גחוני כל כך. בעוד ההליך הוא בהכרח ניתוח שאינו הישרדות ולא ניתן לבצע ניסויים בבעלי חיים ערים, השיטה מאפשרת בדיקה של דינמיקת רשת שלמה בהקשר של גירוי מסלול חושי או אפרנטי אחר, ומספקת יתרונות ברורים על פני גישות אקס ויוו כגון שימוש בתכשירי פרוסה חריפים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כמו ההליך הכירורגי כרוך פעולות שבוצעו באזור הגרון עם מבנים קריטיים חיוניים רבים (עורקים, עצבים), זה חיוני כי הוא מנוהל על ידי חוקר עם מיומנויות כירורגיות ברמה גבוהה. באופן הבא, אנו מדגישים ומעירים על מספר נקודות מפתח של ההליך; עם זאת, יש להזכיר כי שום כמות של עצה בכתב לא יכולה להחליף את החוויה, המיומנות והאינטואיציה של החוקר.
הצעד הקריטי ביותר בניתוח הוא קנה הנשימה. זה כרוך בחיתוך קנה הנשימה, החלפת isoflurane מן חרוט האף לצינור אינטובציה, הבטחת קנה הנשימה לעור החזה ותיקון קנה הנשימה ואת צינור אינטובציה יחד. כל הפעולות הללו חייבות להסתיים בצורה חלקה ומהירה כדי למנוע תאונות, כגון הרדמה לקויה, זרימת נוזלים לקנה הנשימה או החלקה של צינור אינטובציה. יש לזכור את הפרוטוקול לפני חיתוך קנה הנשימה.
דימום הוא אחד הגורמים העיקריים למוות של בעלי חיים בניתוח זה. מאז אזור הצוואר הוא צפוף עם כלי הדם, לחתוך צריך להתבצע רק כאשר קו הראייה ברור, כדי למנוע חיתוך ורידים ועורקים בלתי נראים. לכן, יש להסיר שרירים ורקמות חיבור המטשטשים את הראייה, ויש לנקות דם מנחמים שבורים לפני שמתקדמים.
בעלי חיים יכולים להישמר בחיים במשך זמן רב (יותר מ 8 שעות) מתחילת הניתוח. עם זאת, חשוב לסיים את ההליך הכירורגי במהירות ולכן יש יותר זמן לבחון נוירונים גזע המוח כאשר מצבם הפיזיולוגי של בעלי החיים הוא טוב. חוקר מיומן יכול לסיים את כל ההליך ב 70 דקות.
בעוד השיטה מספקת תצוגה נקייה של משטחי המוח הגחוני, למרבה הצער זה בלתי אפשרי לעשות זאת מבלי לבצע tracheotomy, כמו גם הסרת כמות משמעותית של רקמה באזור הגרון. לכן, לא ניתן לאפשר לחיה להתעורר מהרדמה. יתר על כן, למרות שניתן לשמור על החיה בחיים במשך שעות רבות עם התאמה זהירה של אספקת הרדמה, שמירה על טמפרטורת הגוף לחות, זה בלתי נמנע כי ניסויים ממושכים יוביל בסופו של דבר להיחלשות מצב החיה. נותר למומחיותו של החוקר לשקול את משך הזמן המקסימלי של הקלטות יציבות.
מגבלה אפשרית נוספת של השיטה כמתואר כאן היא כי כמו עדשת GRIN אינו מוכנס לתוך parenchyma המוח, רק נוירונים שטחיים יחסית (~ 150-200 מיקרומטר) ניתן לבדוק. בעוד השתלה כירורגית של עדשת GRIN אפשרית מבחינה טכנית, שיטת ניתוח חריפה אינה מאפשרת מספיק זמן לנוירונים להתאושש מלחץ חמצוני ונוכחות של דם לאחר ההשתלה סביר להניח לפגוע באיכות התמונה מעבר מקובל.
למרות החששות לעיל, אנו מאמינים שזו הפעם הראשונה שיטה להדמיה in vivo של נוירונים IO מוצג. זה מאפשר בדיקה של פעילות spatiotemporal בתאי העצב IO בהקשר vivo בנוכחות כניסות afferent שלם ממערכות חושיות, כמו גם את האותות מן הגרעינים המוח הקטן ואת צומת mesodiencephalic22, הישג שלא היה אפשרי עד כה. בשיטה זו, הפונקציה של IO עכשיו ניתן לחקור לעומק יותר עם שילוב של גירוי חושי ואופטוגנטי. יש לציין כי עם האבולוציה של הדמיית מתח (כגון השיטה האחרונה שלנו להדמיית מתח ב- IO 23), אנו מקווים שהשיטה הכירורגית המוצגת תעורר חוקרים רבים לקחת על האתגר של חקירת האופן שבו ה- IO תורם ליצירת קוצים מורכבים במוח הקטן.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לאנדרו סקוט ממרכז המדיה של OIST על עזרתו בהקלטת וידאו ועריכה. כמו כן, אנו מודים להוגו הודמייקר על עזרתו בפיתוח הניתוח לחשיפת גזע המוח וד”ר קווין דורגנס על עזרתו בשרטוט דיאגרמות לדמויות. בנוסף, תודה רבה לסלבטורה לאקאבה על קריינות הקריינות שלו, כמו גם לכל חברי nRIM וחיות המחמד על התמיכה המתמשכת ברווחה בזמנים הקשים של COVID-19.
Materials
| AAV.CAG.GCaMP6s.WPRE.SV40 | Addgene, USA | 100844-AAV9 | |
| Absorbable suture with 6 mm half circle needle | Natume, Japan | L6-60N2 | hook needle with thread |
| Absorption triangles | FST, Germany | 18105-03 | Surgical sponges |
| Stereo microscopes | Leica, Germany | M50 | |
| Castroviejo curved tip needle holder with lock | FST, Germany | 12061-01 | Surgery tool |
| cotton swabs | Sanyo, Japan | HUBY-340 | |
| Delicate suture tying forceps | FST, Germany | 11063-07 | Surgery tool |
| Delicate Suture Tying Forceps | FST, Germany | 11063-07 | Surgery tool |
| Dumont #5/45 forceps | FST, Germany | 11251-35 | Surgery tool |
| Fine Iris scissors | FST, Germany | 14060-09 | Surgery tool |
| Friedman-Pearson rongeur curved tip | FST, Germany | 16221-14 | Surgery tool |
| Gelfoam absorbable gelatin sponge | Pfizer, USA | 0315-08 | Hemostatic gelatin sponge |
| Glass-Capillary Nanoinjection | Neurostar, Germany | n/a | For virus vector injection |
| Graefe Forceps with serrated tip | FST, Germany | 11052-10 | Surgery tool |
| Implantation rod | Inscopix, USA | n/a | It is part of the nVoke2 system. It's designed to nVoke2 miniature microscpe and GRIN lens can be mounted on it |
| IsoFlo | Zoetis, UK | n/a | Isoflurane |
| KETALAR FOR INTRAMUSCULAR INJECTION | Daiichi Sankyo, Japan | n/a | Ketamine |
| Kimwipes | Kimberly-Clark, USA | Cleaning tissue | |
| Laser-Based Micropipette Puller | Sutter Instrument, USA | P-2000 | |
| Micropipette Beveler | Sutter Instrument, USA | BV-10 | |
| Motorized Stereotaxic based on Kopf, Model 900 | Neurostar, Germany | n/a | Stereotaxic frame |
| mouseOxPlus with rectal temperature sensor and thigh clamp pulse oximeter | Starr Life Sciences, PA, USA | MouseOxPlus | Measures animal heart rate, arterial oxygen saturation (SpO2), breath rate, and temperature |
| nVoke2 integrarted Calcium imaging micro camera system | Inscopix, USA | 1000-003026 | Miniature microscope |
| Ohaus Compact Scales | Ohaus, USA | CS 200 | Scale used to weight animal |
| Otsuka Normal Saline | Otsuka Pharmaceutical Factory, Japan | n/a | |
| Physiological-biological temperature controller system | SuperTech Instruments, Hungary | TMP-5b | Thermal pad for mouse |
| ProView Lens Probe 1.0 mm diameter, 9.0 mm length | Inscopix, USA | 1050-002214 | Gradient-refractive index (GRIN) lens |
| Q114-53-10NP glass capillaries | Sutter Instrument, USA | 112017 | Customized quartz glass capillaries |
| Safety IV Catheter 20G | B. Braun, Germany | 4251652-03 | 20 gauage catheter used to prepare intubation tube |
| Sand paper | ESCO, Japan | EA366MC | Used to polish the tip of 25G needle to prepare curved and blunt needle |
| Scalpel blade | Muromachi Kikai, Japan | 10010-00 | Used to cut the tip of quartz glass pipette |
| SomnoSuite low flow inhalation anesthesia system | Kent Scientific, USA | SOMNO | Provides precise control of isoflurane flow |
| Surgic XT Plus drill | NSK | Y1002774 | For virus vector injection |
| Syringe 1 ml | Terumo, Japan | SS-01T | |
| Syringe needle 25G | Top, Japan | 00819 | Used to make blunt and bended needle |
| Syringe needle 26G | Terumo, Japan | NN-2613S | |
| Thrive 2100 Professional Trimmer | Thrive, Japan | n/a | Shaver |
| Vannas-Tübingen spring scissors | FST, Germany | 15004-08 | Surgery tool |
| Vaseline | Hayashi Pure Chemical, Japan | 22000255 | |
| Veet sensitive skin | Veet, Canada | n/a | Hair removal cream |
| Xylocaine Jelly 2 % 30ml | Aspen Japan, Japan | 871214 |
References
- Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology. British Journal of Pharmacology. , (2011).
- Zhang, T., et al. Kilohertz two-photon brain imaging in awake mice. Nature Methods. , (2019).
- Lin, X., Zhao, T., Xiong, W., Wen, S., Jin, X., Xu, X. M. Imaging neural activity in the primary somatosensory cortex using Thy1-GCaMP6s transgenic mice. Journal of Visualized Experiments. 2019 (143), 1-8 (2019).
- Lee, H. S., Han, J. H. Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse. Journal of visualized experiments. (162), 1-19 (2020).
- Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy. Nature Methods. 16 (1), 11-13 (2019).
- Khosrovani, S., Van Der Giessen, R. S., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. G. In vivo mouse inferior olive neurons exhibit heterogeneous subthreshold oscillations and spiking patterns. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (40), 15911-15916 (2007).
- Osten, P., Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2007).
- Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice. Journal of visualized experiments : JoVE. , e61023 (2020).
- Green, C. J., Knight, J., Precious, S., Simpkin, S. Ketamine alone and combined with diazepam or xylazine in laboratory animals: A 10 year experience. Laboratory Animals. 15 (2), 163-170 (1981).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable andn inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (2), 174-178 (2011).
- Vrieler, N., et al. Variability and directionality of inferior olive neuron dendrites revealed by detailed 3D characterization of an extensive morphological library. Brain Structure and Function. , 1677-1695 (2019).
- Esposito, M. S., Capelli, P., Arber, S. Brainstem nucleus MdV mediates skilled forelimb motor tasks. Nature. , (2014).
- Martin, E. M., Devidze, N., Shelley, D. N., Westberg, L., Fontaine, C., Pfaff, D. W. Molecular and neuroanatomical characterization of single neurons in the mouse medullary gigantocellular reticular nucleus. Journal of Comparative Neurology. , (2011).
- Cold Spring Harbor. Ketamine/Xylazine. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. eLife. 8, 1-45 (2019).
- Lu, J., et al. MIN1PIPE: A Miniscope 1-Photon-Based Calcium Imaging Signal Extraction Pipeline. Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).
- . GitHub – PeyracheLab/miniscoPy: A package to analyse calcium imaging data recorded with the Miniscope Available from: https://github.com/PeyracheLab/miniscoPy (2020)
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. , (1998).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. eLife. 7, 1-37 (2018).
- . GitHub – zhoupc/CNMF_E: Constrained Nonnegative Matrix Factorization for microEndoscopic data Available from: https://github.com/zhoupc/CNMF_E (2020)
- De Gruijl, J. R., Bosman, L. W. J., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. G. Inferior olive: All ins and outs. Handbook of the Cerebellum and Cerebellar Disorders. , (2013).
- Dorgans, K., Kuhn, B., Uusisaari, M. Y. Imaging Subthreshold Voltage Oscillation With Cellular Resolution in the Inferior Olive in vitro. Frontiers in Cellular Neuroscience. , (2020).
