In vivo Calcium beeldvorming in muis inferieure olijf

Alle toepasselijke internationale, nationale en institutionele richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van dieren werden gevolgd. Aseptische chirurgie technieken werden toegepast op de stereotaxic virus vector injectie. 1. Stereotaxic virus vector injectie OPMERKING: Virus met het genetisch materiaal voor het uitdrukken van GCaMP6s (AAV9. Cag. GCaMP6s.WPRE.SV40) wordt stereotaxisch geïnjecteerd zoals eerder beschreven7,8 met de volgende wijzigingen. Gebruik kwartsglas (uitwendige diameter: 1,14 mm, inwendige diameter: 0,53 mm) in plaats van borosilicaatglas om een pipet met lange en stijve taps toelopend voor IO-injectie te fabriceren met behulp van een lasercapillaire trekker met parameters aangepast zoals in de producthandleiding. Snijd na het trekken 1-2 mm van de punt van de pipet af met een scalpel om een 8-10 mm lange taper te verkrijgen met een interne tipdiameter van 15-20 μm (figuur 1a). Rond de pipet af door de punt af te schuinen tot een naaldvorm van 30° met een roterende micropipetafschuining voor gemakkelijkere hersenpenetratie en minder pipetbuiging(figuur 1a).OPMERKING: De veelgebruikte borosilicaatglaspipet is te flexibel om diepe gebieden correct te targeten wanneer deze tot deze lengte wordt getrokken. Een nanoliter injector werd gebruikt met de glazen pipet om het virus te leveren in deze studie. Als alternatief kan ook een precisieglasspuit of een drukinjector worden gebruikt. Zorg ervoor dat de muisborst op het thermische kussen ligt, zodat de nek niet voldoende lichaamsondersteuning heeft, en wees uiterst voorzichtig met het nivelleren van de schedel bij het bevestigen van de muis op het stereotaxic frame (Afbeelding 1b).OPMERKING: Bregma-lambda verschil moet kleiner zijn dan 0,05 mm in verticale afmeting. Gebruik 6,2 mm caudale, ±0,5 mm laterale en 6,6 mm ventrale ten opzichte van bregma als coördinaten voor het richten van de belangrijkste IO-kern (figuur 1c).OPMERKING: Perfecte nivellering van de hersenen zal het succespercentage van het injecteren van virus in IO drastisch verhogen. De coördinaten moeten door de experimenteerder worden bevestigd, aangezien er aanzienlijke verschillen worden verwacht tussen laboratoria, muizenstammen en individuele onderzoekers. Voor het voorbereiden van videomateriaal voor deze publicatie gebruikten we een mannelijke C57Bl / 6J-muis. Volg de relevante institutionele richtlijnen voor postoperatieve zorg- en huisvestingsprocedures voor viraal-getransfecteerde dieren gedurende 3-4 weken. Figuur 1: Stereotaxic virus vector injectie. (a) De lasergetrokken kwarts glazen pipet heeft een 10-12 mm lange rechte taps toelopende. Snijd na het trekken 1-2 mm van de punt af. De pipet wordt afgerond door de punt af te schuinen tot een naaldvorm van 30°. (b) De juiste injectie is afhankelijk van de juiste positie van het muislichaam in het stereotaxic frame. Steun de muisborst om te voorkomen dat de nek wordt gestrekt. Breng de muiskop waterpas door de bregma en lambda horizontaal uit te lijnen. (c) De IO-coördinatie ten opzichte van bregma wordt weergegeven in dorsale weergave (links) van de muisschedel en coronale weergave (rechtsboven) van de hersenen. Injectie bereikt het laterale deel van de principal (IOPr) en de dorsale (IOD) subnuclei van IO (rechtsonder). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. 2. Voorbereiding van gereedschappen en verbruiksartikelen voor ventrale benadering chirurgie Bereid een intubatiebuis voor door een 5 tot 6 mm lange en 0,8 mm brede spleet uit de punt van een katheter met 20 gauge te snijden, zodat het geïntubeerde dier kan uitademen (figuur 2a).OPMERKING: De spleet is nodig om het dier uit te ademen als een gewone isofluraanverdamper met constante luchtstroom wordt gebruikt. Als er naast de vaporizer een beademingsapparaat wordt gebruikt, kan de katheter intact blijven. Bereid een stompe naald voor om de luchtpijp te ondersteunen tijdens de tracheotomie. Snijd de scherpe punt van een 25-gauge naald af met een tang. Maak het breukoppervlak glad met schuurpapier. Buig de stompe naald in het midden tot ongeveer 15° met een tang.OPMERKING: Een gebogen naald tilt de luchtpijp voorzichtig op. Dit kan de vervorming van de luchtpijp verminderen. Verdun 50 mg/ml ketamine met zoutoplossing tot 15%. De uiteindelijke concentratie is 7,5 mg/ml. Monteer de schone operatiegereedschappen en de verbruiksartikelen, waaronder lidocaïnegel, zoutoplossing, gelatinesponzen, absorberende wattenstaafjes, vaseline en reinigingsweefsel. Schakel de isofluraan vaporizer in. Zet het dierenverwarmingskussen op 38 °C. Draai de neuskegel van stereotaxic frame 180° horizontaal, zodat de muis in de ventrale kant van het frame naar boven kan worden bevestigd. Stel de hoogte van de neuskegel zo in dat deze zich ter hoogte van de oorstaven bevindt. 3. Toediening van anesthesie en voorbereiding van de muis voor de operatie Weeg het dier met een weegschaal en bereken de hoeveelheid verdunde ketamine voor injectie.OPMERKING: De totale hoeveelheid ketamine die nodig is, is 56,25 mg per kg lichaamsgewicht. Daarom is het volume verdunde ketamine 7,5 ml per kg lichaamsgewicht. De nadelen van het gebruik van ketamine alleen omvatten slechte spierontspanning, tachycardie en verbeterdespiertonus 9. In dit protocol wordt ketamine echter alleen gebruikt om de periode van 10-20 s te bestrijken waarin de toediening van isofluraan wordt onderbroken als gevolg van de tracheotomie. Door deze stap zo kort mogelijk te houden, wordt het verdovingseffect van isofluraan niet significant verminderd en worden de nadelen van ketamine geminimaliseerd. Plaats de muis in de verdovingsinductiekamer die is voorgevuld met 5% isofluraan. Wanneer het dier volledig wordt verdoofd, aangetoond door verlies van rechtse reflex en dieper en langzamer ademhalingspatroon, schakelt u de isofluraanstroom naar de neuskegel van stereotaxic frame en verlaagt u de isofluraanconcentratie tot 2,5%. Bevestig het dier in de ventrale kant van het stereotaxieframe naar boven (Afbeelding 2b). Pas de hoogte en de toonhoogte van de neuskegel aan om ervoor te zorgen dat het dier gemakkelijk kan ademen. Houd het dier warm met het voorverwarmde verwarmingskussen.OPMERKING: Het bedekken van het onderste deel van het dierenlichaam met een stuk tissuepapier of aluminiumfolie kan helpen om de temperatuur van het dier te handhaven. Verwijder het huidhaar in keel- en dijgebieden met een scheerapparaat en ontharingscrème(afbeelding 2b). Breng de lidocaïnegel topisch aan op de keelhuid.OPMERKING: De perifere zuurstofverzadigingssensor (SpO2)van de dijklem, die in procedure 6 zal worden gebruikt, werkt het beste op de haarloze huid. Bewaak de temperatuur van het dier met een rectale thermometer (figuur 2b). Injecteer intraperitoneaal 1 ml warme (37 °C) zoutoplossing om het vochtverlies tijdens de operatie te compenseren. Beoordeel de diepte van anesthesie door sterk knijpen op de tenen van de achterpoten. Er mag geen detecteerbare reactie worden opgeroepen. Figuur 2: Voorbereiding van ventrale naderingsoperaties. (a) Bereid een intubatiebuis voor door een 5-6 mm lange en 0,8 mm brede spleet in de punt van de 20-gauge katheter te snijden. (b) Monteer de ventrale kant van het dier omhoog in een stereotaxic frame en pas de hoek van de neuskegel aan om ervoor te zorgen dat het dier gemakkelijk ademt. Scheer de huid rond de keel en dij. Bevestig de SpO2-sensor aan de dij voor het bewaken van de vitale functies van de muis. Plaats de rectale temperatuursonde voor het bewaken van de lichaamstemperatuur van de muis. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. 4. Tracheotomie en intubatie (20-25 min) De luchtpijp blootstellen. Maak een verticale incisie in de keelhuid langs de middellijn. Scheid de nekhuid van de ingewanden eronder met behulp van de stompe dissectiemethode en snijd de huid af om de speekselklieren te onthullen (figuur 3a-b, 4a). Bevrijd speekselklieren uit het bindweefsel en draai ze zijdelings om om de sternothyroid spier bedekte luchtpijp met tang bloot te leggen (Figuur 3b-c).OPMERKING: De vaseline kan op het blootgestelde weefsel worden aangebracht om ze vochtig te houden. Vermijd het luchtpijpgebied om het schoon te houden voor de volgende stappen. Tracheotomie Injecteer de eerste dosis verdunde ketamine (7,5 mg/ml) intraperitonaal, 5 ml per kg lichaamsgewicht (37,5 mg/kg).OPMERKING: Het duurt 3-5 minuten voordat ketamine functioneert, dus de eerste dosis ketamine moet worden geïnjecteerd voordat de luchtpijp wordt gescheiden van de omliggende spieren en bloedvaten. Ketamine wordt toegediend in twee injecties vanwege het verhoogde risico op overdoseringseffecten in combinatie met isofluraan anesthesie. Splits de sternothyroidspier voorzichtig langs de middellijn met de punt van een fijne tang om de luchtpijp bloot te leggen (figuur 3c). Maak de luchtpijp los van de bloedvaten en de slokdarm met een tang met behulp van de stompe dissectiemethode. Injecteer intraperitoneaal de tweede dosis verdunde ketamine (7,5 mg/ml), 2,5 ml per kg lichaamsgewicht (18,75 mg/kg). Steek kruislings een stompe naald onder de luchtpijp om deze omhoog te steken (afbeelding 3d). Houd deze naald met de vingers vast om de luchtpijp te ondersteunen. Leid de hechtdraad rond de derde luchtpijpring met een halve cirkelnaald naar de schildklier (figuur 3d). Maak vier instrumentbanden op deze luchtpijpring.OPMERKING: De draad die aan de luchtpijpring is vastgemaakt, wordt gebruikt om de luchtpijp aan de dierenborst te vast te zetten. Snijd de draad bij deze stap niet af van de halve cirkelnaald. Luchtpijpringen zijn gemaakt van kraakbeen dat flexibel is, maar minder sterk dan botten. Bind de hechtdraad niet te strak vast, anders kan de ring breken. Knijp in de borsthuid met een tang. Doorboor de borsthuid met dezelfde halve cirkelnaald die in de laatste stap is gebruikt en leid de draad door de huid, ter voorbereiding op het vastzetten van de luchtpijp aan de borst in de volgende stap (afbeelding 3d). Til de luchtpijp voorzichtig op door aan de draad te trekken die aan de luchtpijpring is gebonden en snijd de luchtpijp rostral naar de gebonden ring en caudale naar de schildklier. Trek de trachea naar de borstkas. Verhoog de opening van de luchtpijp door er een klein stukje chirurgische spons onder toe te voegen.OPMERKING: Zorg ervoor dat er meer dan 5 minuten zijn verstreken na de tweede injectie ketamine voordat u de luchtpijp snijdt om het anesthesieniveau te garanderen. Verwijder de resterende vloeistof in de openingstip van de luchtpijp met een dunne strook reinigingsweefsel. Schakel de isofluraanstroom van stereotaxic neuskegel naar de intubatiebuis. Steek de intubatiebuis ongeveer 2 mm diep in de luchtpijp en zorg ervoor dat een deel van de spleet in de buis buiten de luchtpijp blijft om te kunnen ademen (afbeelding 3e, 4b).OPMERKING: Pas de hoek van de intubatiebuis en de invoegdiepte zorgvuldig aan om de muis soepel te laten ademen en om beschadiging van de luchtpijp te voorkomen. Vaseline kan aan de buitenkant van de luchtpijp worden aangebracht om te voorkomen dat het droog wordt, zodat de luchtpijp niet gemakkelijk scheurt. Bevestig de luchtpijp aan de borsthuid door 3-4 instrumentale banden te maken. Bind de luchtpijp vast met de hechtdraad om de intubatiebuis vast te maken (afbeelding 3e, 4b). Figuur 3: Tracheotomie en intubatie van de muis. (a-c) panelen tonen het proces van het blootstellen van luchtpijp. (a) Verwijder de keelhuid door langs de stippellijnen te snijden. (b) Draai de speekselklieren (SG) lateraal om de luchtpijp bedekt door de sternothyroid spier (SM) bloot te leggen. (c) Opengesneden SM langs de onderbroken lijn om de luchtpijp bloot te leggen. (d-e) panelen tonen de tracheotomie. d) Steun de luchtpijp met een stompe en gebogen naald. Bind de derde luchtpijpring caudale aan de schildklier voor het vastzetten van de luchtpijp aan de borsthuid. (e) Breng isofluraan aan met een intubatiebuis met een spleet in de punt. Bevestig de luchtpijp aan de borsthuid met de hechtdraad. Bevestig de intubatiebuis aan de luchtpijp door ze aan elkaar te vast te maken. Schaalbalk in a=5 mm, geldt voor alle panelen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 4: Schematisch schema van ventrale naderingschirurgie vanuit zijaanzicht. (a) Een schematische tekening met relevante anatomische delen aangegeven op hun relatieve locatie wanneer de muis ventrale kant naar boven wordt geplaatst. Afkortingen: spierbedekking atlas (AM), longitudinale spier (LM), speekselklieren (SG), sternothyroid spier (SM), schildklier (TG). b) Schematische opstelling van de intubatiebuis ten opzichte van de luchtpijp wanneer de tracheotomie is voltooid. De luchtpijp wordt vastgezet door de banden op de borsthuid (T-luchtpijp). De intubatiebuis (IT) wordt vastgezet door de banden rond het uiteinde van de luchtpijp (T-buis). (c) Verwijder de atlas anterieure tuberkel (AAT) om de gezichtslijn naar de IO te wissen. d) Schematisch dat de positionering van de miniatuurmicroscoop (MM) en de GRIN-lens boven de IO beschrijft voor beeldvormingsexperimenten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. 5. Blootstellen van de hersenstam (40-45 min) Snijd de sternothyroid spier langs de spiervezel met de fijne tang. Knip het geïsoleerde deel af met de veerschaar (afbeelding 3e). Bevrijd voorzichtig de overgebleven luchtpijp en het strottenhoofd van de spieren om de schade aan de bloedvaten in de spieren te minimaliseren. Verwijder de overgebleven luchtpijp en het strottenhoofd. Bevrijd de slokdarm van het aangekoppelde weefsel met een tang en snijd deze af met een veerschaar. (Figuur 5a). Verwijder de spier die de ventrale boog en de voorste knol van atlas bedekt met fijne tang en veerschaar (Figuur 5b).OPMERKING: Wanneer u de spier verwijdert, splitst u een deel ervan met de punt van de fijne tang. Knip het gescheiden deel af met een veerschaar. Herhaal dit meerdere keren om de atlas ventrale boog bloot te leggen om het risico op scheuren van bloedvaten te minimaliseren. Knip de ventrale bogen van atlas met een rongeur (Figuur 4c, 5c). Verwijder de voorste knol van de atlas. Verwijder het bloed en de vloeistof met een chirurgische spons om het foramen magnum en de hersenstam te bekijken(figuur 4c,5d). Breid het foramen magnum uit door het achterhoofdsbeen te verwijderen met een rongeur. (Figuur 5d-e). Verwijder het dunne kraakbeen boven de foramen magnum met fijne tang en veerschaar. Schil de periosteale laag van de dura mater voorzichtig met fijne tangen om een duidelijk zicht te hebben op de ventrale hersenstam (figuur 5f). Breek de dura mater niet. Figuur 5: Stel hersenstam van muis bloot voor calciumbeeldvorming. (a-f) panelen tonen het proces van het blootstellen van hersenstam. (a) Verwijder de sternothyroid spier (SM) gelabeld in figuur 3e. Snij het strottenhoofd en de slokdarm af. (b) Verwijder de langsspier (LM) en de spierbedekkingsatlas (AM). (c) Snijd de atlas ventrale bogen (AVA) met een rongeur en verwijder de atlas voorste knol (AAT). (d) Snijd het achterhoofdsbeen (OB) af om het foramen magnum (FM) uit te breiden. (e) Expanded FM. (f) Het dunne kraakbeen boven het foramen magnum wordt verwijderd. De periosteale laag dura mater wordt afgepeld. Het vierkant geeft het gebied aan dat oppervlakkige IO-neuronen bevat. (g) Beeld de IO met GRIN lens. Schaalbalk in a=5 mm, geldt voor a-c. Schaalbalk in d=2 mm, geldt voor d-e. Schaalbalk in f=2 mm. Schaalbalk in g=2 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. 6. Calcium beeldvorming Klem de SpO2-sensor op de dij van de muis om vitale functies zoals hartslag, zuurstofverzadiging en ademfrequentie te controleren (figuur 2b).OPMERKING: De hartslag moet tussen 500 bpm en 600 bpm liggen, de zuurstofverzadiging moet hoger zijn dan 90% en de ademsnelheid moet 50-70 ademhalingen per minuutzijn 10,11. Monteer de GRIN lenssonde (9mm lengte. 1 mm diameter) op de implantatiestang.OPMERKING: Reinig de GRIN-lens met 70% met ethanol doordrenkt reinigingsweefsel voordat u beeldvorming maakt voor een goede beeldkwaliteit. Bevestig de implantatiestaaf op het stereotaxic frame en monteer de miniatuurmicroscoop op de implantatiestaaf.OPMERKING: De voorbereiding van de miniatuurmicroscoop voor beeldvorming moet worden voltooid volgens de juiste gebruikersrichtlijnen van het product. Voeg enkele druppels warme zoutoplossing toe in het hersenstamgebied voor onderdompeling van de GRIN-lens. Benader de hersenstam met de GRIN-lens(figuur 4d,5g). Zet de excitatie blauwe LED (455 ± 8) in de miniatuurmicroscoop aan. Lokaliseer de GCaMP6s-getransfecteerde IO-neuronen door het fluorescentiebeeld vanuit de miniatuurmicroscoop te controleren. Zoek naar IO-neuronen in een rechthoekvormig gebied ~0,5-1,7 mm rostrale naar de resterende atlas en ~0,6-1,1 mm zijwaarts naar de middellijn in het oppervlakkige gebied van de ventrale hersenstam (Figuur 5f).OPMERKING: Wanneer u op zoek bent naar een geschikt gezichtsveld voor IO-beeldvorming, zoek dan naar de locatie waar de gemiddelde diameter van somata overeenkomt met die van IO-neuron somata (ongeveer 15 μm12). De aangrenzende gebieden in medullaire reticulaire vorming bestaan uit aanzienlijk grotere cellen13,14. Wees voorzichtig bij het verticaal bewegen van de GRIN-lens, omdat het te hard indrukken op de hersenstam dieren kan doden. 7. Euthanaseren van dieren volgens procedure Aan het einde van het experiment euthanaseert u het dier met cervicale dislocatie of een andere methode die is goedgekeurd door de lokale regelgeving voor dierverzorging. Voor verder histologisch onderzoek, eerst verdoven het dier met injecteerbare drug, zoals ketamine/xylazine combinatie (100 mg/kg en 10 mg/kg, respectievelijk)15 vóór hartperfusie met Ringer’s oplossing gevolgd door fixatieve oplossing om de hersenen te repareren. 8. Gegevensverwerking Verwerk de opgenomen calciumbeeldvideo vooraf voordat u gegevens analyseert.OPMERKING: De commerciële gegevensverwerkingssoftware met de miniatuurmicroscoop is voor deze stap gebruikt en de volgende protocolstappen hebben daarmee betrekking. Als alternatief kunnen gratis en open source software zoals CaImAn16,MINIPIPE17en MiniscoPy18 worden gebruikt voor zowel voorbewerking als analyse. Laad de opgenomen calciumbeeldvideo in de gegevensverwerkingssoftware. Klik op de knop Voorverwerking. Definieer een bijsnijdgebied met uitzondering van gebieden zonder fluorescerende neuronen en snijd de video bij om de bestandsgrootte te verkleinen voor snellere verwerking. Klik op de knop Ruimtelijk filter. Stel de lage cut-off en de hoge cut-off voor ruimtelijk filter in op respectievelijk 0,005 pixel-1en 0,5 pixel-1. Pas het ruimtelijke filter toe op elk frame van de video om het contrast te vergroten en het beeld vloeiend te maken.OPMERKING: Het ruimtelijke filter is een bandpass Gaussiaans filter. Componenten met een lage ruimtelijke frequentie die afkomstig zijn uit ongerichte cellen kunnen in de volgende stap bewegingscorrectie verstoren. Een component met een hoge ruimtelijke frequentie kan ervoor zorgen dat de video minder vloeiend lijkt. Klik op de knop Bewegingscorrectie. Pas de bewegingscorrectie toe op de video door het eerste frame als referentieframe te gebruiken om de bewegingsgerelateerde artefacten veroorzaakt door de bloedstroom in de hersenstam te verminderen.OPMERKING: De bewegingscorrectie maakt gebruik van een beeldregistratiemethode ontwikkeld door Thevenaz et al19. Exporteer de bewegingsgecorrigeerde video als TIFF-indeling. Pas CNMF-E20 toe op de bewegingsgecorrigeerde video in MATLAB om afzonderlijke neuronen te identificeren, volgens de instructies voor de CNMF-E MATLAB-code in de online repository21.OPMERKING: CNMF-E is een beperkte niet-negatieve matrixfactorisatiebenadering die is aangepast voor beeldvorming met één foton. Demoscripts in de repository kunnen worden gewijzigd en gebruikt om gegevens te verwerken.