In vivo Imagem de cálcio em rato de azeitona inferior

Todas as diretrizes internacionais, nacionais e institucionais aplicáveis para o cuidado e o uso dos animais foram seguidas. Técnicas de cirurgia asséptica foram aplicadas à injeção vetorial do vírus estereotaxic. 1. Injeção vetorial de vírus esteretaxic NOTA: Vírus que carrega o material genético para expressar GCaMP6s (AAV9. Cag. GCaMP6s.WPRE.SV40) é estereotaxicamente injetado como descrito anteriormente7,8 com modificações seguintes. Use vidro de quartzo (diâmetro externo: 1,14 mm, diâmetro interno: 0,53 mm) em vez de vidro borossilicato para fabricar uma pipeta com fita longa e rígida para injeção de IO usando um puxador capilar a laser com parâmetros ajustados como no manual do produto. Após puxar, corte 1-2 mm da ponta da pipeta com um bisturi para adquirir um taper de 8-10 mm de comprimento com um diâmetro de ponta interna de 15-20 μm(Figura 1a). Finalize a pipeta com a ponta para uma forma de agulha de 30° com um bipe micropipette rotativo para facilitar a penetração cerebral e menos dobra de pipeta(Figura 1a).NOTA: A pipeta de vidro borossilicato comumente usada será muito flexível para atingir corretamente áreas profundas quando puxadas para este comprimento. Um injetor de nanoliter foi usado com a pipeta de vidro para entregar o vírus neste estudo. Alternativamente, uma seringa de vidro de precisão ou um injetor de pressão também podem ser usados. Certifique-se de que o peito do mouse está sobre a almofada térmica para que seu pescoço não seja esticado com suporte suficiente do corpo, e tenha muito cuidado ao nivelar o crânio ao fixar o mouse na estrutura estereotaxic(Figura 1b).NOTA: A diferença bregma-lambda deve ser inferior a 0,05 mm na dimensão vertical. Utilize 6,2 mm caudal, ±0,5 mm lateral e ventral de 6,6 mm em relação ao bregma como as coordenadas para mirar o núcleo principal de IO(Figura 1c).NOTA: O nivelamento perfeito do cérebro aumentará drasticamente a taxa de sucesso da injeção de vírus no IO. As coordenadas devem ser confirmadas pelo experimentador, pois são esperadas diferenças significativas entre laboratórios, cepas de camundongos e pesquisadores individuais. Para preparar material de vídeo para esta publicação, utilizamos um rato C57Bl/6J masculino. Siga as diretrizes institucionais pertinentes para os procedimentos de assistência pós-operatória e habitação para animais viral-transfectados por 3-4 semanas. Figura 1: Injeção vetorial do vírus esteretaxic. (a) A pipeta de vidro de quartzo puxada a laser tem uma fita reta de 10-12 mm de comprimento. Depois de puxar, corte 1-2 mm da ponta. A pipeta é finalizada por chanfrar a ponta em forma de agulha de 30°. (b) A injeção correta depende da posição adequada do corpo do rato no quadro estereotaxic. Apoie o baú do mouse para evitar esticar o pescoço. Nivele a cabeça do rato alinhando a bregma e a lambda horizontalmente. (c) A coordenação do IO em relação à bregma é mostrada na visão dorsal (esquerda) do crânio do rato e da visão coronal (superior direito) do cérebro. A injeção atinge a parte lateral do principal (IOPr) e os sub núcleos dorsais (IOD) de IO (fundo direito). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 2. Preparação de ferramentas e materiais de consumo para cirurgia de abordagem ventral Prepare um tubo de intubação cortando uma fenda de 5 a 6 mm de comprimento e 0,8 mm de largura da ponta de um cateter de 20 bitolas para que o animal entubado possa respirar(Figura 2a).NOTA: A fenda é necessária para que o animal respire se for utilizado um vaporizador de isoflurane comum com fluxo de ar constante. Se um ventilador for usado além do vaporizador, o cateter pode ser deixado intacto. Prepare uma agulha sem corte para suportar a traqueia durante a traqueotomia. Corte a ponta afiada de uma agulha calibre 25 com alicate. Suavize a superfície da fratura com lixa. Dobre a agulha cega no meio até cerca de 15° com alicate.NOTA: Uma agulha curva eleva a traqueia suavemente. Isso pode diminuir a deformação da traqueia. Diluir 50 mg/mL de cetamina com soro fisiológico para 15%. A concentração final é de 7,5 mg/mL. Monte as ferramentas de cirurgia limpa e os consumíveis, incluindo gel de lidocaína, soro fisiológico, esponjas de gelatina, cotonetes absorventes, geleia de petróleo e tecido de limpeza. Ligue o vaporizador isoflurane. Coloque a almofada de aquecimento animal para 38 °C. Gire o cone do nariz do quadro estereotaxal 180° horizontalmente, para que o mouse possa ser fixado no lado ventral da moldura para cima. Ajuste a altura do cone do nariz para que esteja no nível das barras de ouvido. 3. Administração de anestesia e preparação do rato para a cirurgia Pesar o animal com uma balança de pesagem e calcular a quantidade de cetamina diluída para injeção.NOTA: A quantidade total de cetamina necessária é de 56,25 mgs por kg de peso corporal. Portanto, o volume de cetamina diluída é de 7,5 mL por kg de peso corporal. As desvantagens do uso da cetamina incluem relaxamento muscular ruim, taquicardia e tom muscular aprimorado9. Neste protocolo, porém, a cetamina só é usada para cobrir o período de 10-20 durante o qual a administração isoflurane é interrompida devido à traqueotomia. Mantendo este passo o mais breve possível, o efeito anestésico da isoflurane não é significativamente diminuído e as desvantagens usando cetamina são minimizadas. Coloque o rato na câmara de indução anestésico pré-preenchida com 5% de isoflurane. Quando o animal estiver totalmente anestesiado mostrado pela perda de reflexo de retardo e padrão de respiração mais profundo e lento, mude o fluxo isoflurane para o cone do nariz da estrutura estereotaxista e reduza a concentração de isoflurane para 2,5%. Fixar o animal no lado ventral do quadro estereotaxic para cima(Figura 2b). Ajuste a elevação e o tom do cone do nariz para garantir que o animal possa respirar facilmente. Mantenha o animal aquecido com a almofada de aquecimento pré-aquecida.NOTA: Cobrir a parte inferior do corpo animal com um pedaço de papel de tecido ou papel alumínio pode ajudar a manter a temperatura animal. Remova o cabelo da pele nas áreas da garganta e da coxa com um creme de barbear e depilação(Figura 2b). Aplique topicamente o gel de lidocaína na pele da garganta.NOTA: O sensor de saturação de oxigênio periférico do grampo da coxa (SpO2),que será utilizado no procedimento 6, funciona melhor na pele sem pelos. Monitore a temperatura animal com um termômetro retal(Figura 2b). Injete 1 mL de soro fisiológico quente (37 °C) intraperitonealmente para compensar a perda de fluido durante a cirurgia. Avalie a profundidade da anestesia com forte aperto nos dedos dos membros traseiros. Nenhuma resposta detectável deve ser evocada. Figura 2: Preparação da cirurgia de aproximação ventral. (a) Prepare um tubo de intubação cortando uma fenda de 5-6 mm de comprimento e 0,8 mm de largura na ponta do cateter de 20 bitolas. (b) Monte o lado ventral do animal para cima em uma estrutura estereotaxic e ajuste o ângulo do cone do nariz para garantir que o animal esteja respirando facilmente. Raspe a pele ao redor da garganta e das áreas da coxa. Conecte o sensor SpO2 à coxa para monitorar sinais vitais do mouse. Insira a sonda de temperatura retal para monitorar a temperatura corporal do mouse. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 4. Traqueotomia e intubação (20-25 min) Expondo a traqueia. Faça uma incisão vertical na pele da garganta ao longo da linha média. Separe a pele do pescoço das vísceras sob ela usando o método de dissecção sem corte e corte a pele para revelar as glândulas salivares (Figura 3a-b, 4a). Glândulas salivares livres do tecido conjuntivo e toco-as lateralmente para expor a traqueia coberta do músculo estetireóide com fórceps(Figura 3b-c).NOTA: A geleia de petróleo pode ser aplicada no tecido exposto para mantê-los úmidos. Evite a área da traqueia para mantê-la limpa para as etapas seguintes. traqueotomia Injete a primeira dose de cetamina diluída (7,5 mg/mL) intraperitoneally, 5 mL por kg de peso corporal (37,5 mg/kg).NOTA: Leva de 3-5 minutos para a cetamina funcionar, assim a primeira dose de cetamina deve ser injetada antes de separar a traqueia dos músculos e vasos sanguíneos circundantes. A cetamina é administrada em duas injeções devido ao alto risco de efeitos de overdose quando combinada com anestesia isoflurane. Divida cuidadosamente o músculo estetítroide ao longo da linha média com a ponta de um fórceps fino para expor a traqueia(Figura 3c). Retire a traqueia dos vasos sanguíneos e o esôfago com fórceps usando o método de dissecção contundente. Injete intraperitoneal a segunda dose de cetamina diluída (7,5 mg/mL), 2,5 mL por kg de peso corporal (18,75 mg/kg). Insira uma agulha sem corte sob a traqueia transversalmente para apoiá-la(Figura 3d). Segure esta agulha com os dedos para apoiar a traqueia. Guie o fio de sutura ao redor do terceiro anel de traqueia caudal para a glândula tireoide com uma agulha de meio círculo(Figura 3d). Faça quatro laços de instrumentos neste anel traqueal.NOTA: A rosca amarrada ao anel traqueal é usada para fixar a traqueia no peito do animal. Não corte o fio da agulha do meio círculo nesta etapa. Anéis traqueais são feitos de cartilagem que é flexível, mas menos forte que os ossos. Não amarre o fio de sutura muito apertado ou o anel pode quebrar. Belisque a pele do peito com um par de fórceps. Furar a pele do peito com a mesma agulha de meio círculo usada na última etapa e conduzir o fio através da pele, em preparação para fixar a traqueia no peito na próxima etapa(Figura 3d). Levante suavemente a traqueia puxando a rosca amarrada ao anel traqueal e corte o rostral traquea ao anel amarrado e caudal para as glândulas tireoides. Puxe a traqueia caudal em direção ao peito. Levante a abertura da traqueia adicionando um pequeno pedaço de esponja cirúrgica sob ela.NOTA: Certifique-se de que mais de 5 minutos passaram após a segunda injeção de cetamina antes de cortar a traqueia para garantir o nível de anestesia. Remova qualquer líquido restante dentro da ponta de abertura da traqueia com uma fina tira de tecido de limpeza. Troque o fluxo isoflurane do cone do nariz estereotaxic para o tubo de intubação. Insira o tubo de intubação na traqueia com cerca de 2 mm de profundidade e certifique-se de que parte da fenda no tubo permaneça fora da traqueia para permitir a respiração (Figura 3e, 4b).NOTA: Ajuste cuidadosamente o ângulo do tubo de intubação e a profundidade de inserção para fazer o mouse respirar suavemente e evitar danificar a traqueia. A geleia de petróleo pode ser aplicada do lado de fora da traqueia para evitar que seque, para que a traqueia não se rompa facilmente. Fixar a traqueia na pele do peito fazendo 3-4 laços instrumentais. Amarre a traqueia com a rosca de sutura para fixar o tubo de intubação (Figura 3e, 4b). Figura 3: Traqueotomia e intubação do rato. ospainéis apresentam o processo de exposição da traqueia. aRemova a pele da garganta cortando ao longo das linhas tracejadas. (b) Vire as glândulas salivares (SG) lateralmente para expor a traqueia coberta pelo músculo estetoide (SM). (c) Corte SM aberto ao longo da linha tracejada para expor a traqueia. Ospainéis mostram a traqueotomia. dApoie a traqueia com uma agulha cega e curvada. Amarre o terceiro anel de traquea caudal à glândula tireoide para fixar a traqueia na pele do peito. (e) Aplique isoflurane com um tubo de intubação com uma fenda na ponta. Fixar a traqueia na pele do peito com o fio de sutura. Fixar o tubo de intubação na traqueia amarrando-os juntos. Barra de escala em a=5 mm, aplica-se a todos os painéis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Diagrama esquemático da cirurgia de aproximação ventral a partir da visão lateral. (a) Um desenho esquemático com peças anatômicas relevantes indicadas em sua localização relativa quando o rato é colocado lado ventral para cima. Abreviaturas: atlas de cobertura muscular (AM), músculo longitudinal (ML), glândulas salivares (SG), músculo estetoide (SM), glândula tireoide (TG). bEsquema de arranjo do tubo de intubação em relação à traqueia quando a traqueotomia estiver concluída. A traqueia é protegida pelos laços na pele do peito (T-traquea). O tubo de intubação (TI) é fixado pelos laços ao redor da extremidade da traqueia (tubo T). cRemova o tubérculo anterior atlas (AAT) para limpar a linha de visão do IO. dEsquema descrevendo o posicionamento do microscópio em miniatura (MM) e da lente GRIN acima do IO para experimento de imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 5. Expor o tronco cerebral (40-45 min) Corte o músculo estetireóide ao longo da fibra muscular com os fórceps finos. Corte a parte isolada com a tesoura de mola(Figura 3e). Liberte cuidadosamente a traqueia que sobra e a laringe dos músculos para minimizar os danos nos vasos sanguíneos nos músculos. Remova a traqueia e a laringe. Liberte o esôfago do tecido conectado com fórceps e corte-o com uma tesoura de mola. (Figura 5a). Remova o músculo que cobre o arco ventral e o tubérculo anterior do atlas com fórceps finos e tesouras de mola(Figura 5b).NOTA: Ao remover o músculo, divida parte dele com a ponta dos fórceps finos. Corte a parte separada com uma tesoura de mola. Repita isso várias vezes para expor o arco ventral atlas para minimizar o risco de rasgar vasos sanguíneos. Corte os arcos ventral do atlas com um rongeur (Figura 4c, 5c). Remova o tubérculo anterior do atlas. Remova o sangue e o fluido com esponja cirúrgica para ver o forame magnum e o tronco cerebral(Figura 4c, 5d). Expanda o foramen magnum removendo o osso occipital com um rongeur. (Figura 5d-e). Remova a fina cartilagem acima do foien magnum com fórceps finos e tesouras de mola. Descasque cuidadosamente a camada periosteal da dura mater com fórceps finos para ter uma visão clara do tronco cerebral ventral(Figura 5f). Não quebre a dura gêmea. Figura 5: Exponha o tronco cerebral do rato para a imagem de cálcio. Ospainéis mostram o processo de exposição do tronco cerebral. aRemova o músculo estetoide (SM) rotulado na Figura 3e. Corte a laringe e o esôfago. (b) Remova o músculo longitudinal (LM) e o atlas de cobertura muscular (AM). (c) Corte os arcos ventral atlas (AVA) com um rongeur e remova o tubérculo anterior atlas (AAT). dCortar o osso occipital (OB) para expandir o foramen magnum (FM). (e) FM expandida . (f) A fina cartilagem acima do foramen magnum é removida. A camada periosteal de dura-mater é descascada. O quadrado indica a área contendo neurônios IO superficiais. (g) Imagem do IO com lente GRIN. Barra de escala em a=5 mm, aplica-se a a-c. Barra de escala em d=2 mm, aplica-se a d-e. Barra de escala em f=2 mm. Barra de escala em g=2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 6. Imagem de cálcio Fixar o sensor SpO2 na coxa do mouse para monitorar sinais vitais como frequência cardíaca, saturação de oxigênio e taxa de respiração(Figura 2b).NOTA: A frequência cardíaca deve ser entre 500 bpm e 600 bpm, a saturação de oxigênio deve ser superior a 90%, e a taxa de respiração deve ser de 50-70 respirações por minuto10,11. Monte a sonda de lente GRIN (9mm de comprimento. 1 mm de diâmetro) na haste de implantação.NOTA: Limpe a lente GRIN com tecido de limpeza 70% encharcado de etanol antes de fotografar para uma boa qualidade de imagem. Fixar a haste de implantação na estrutura estereotaxic e montar o microscópio em miniatura na haste de implantação.NOTA: A preparação do microscópio em miniatura para imagem deve ser concluída de acordo com as diretrizes adequadas do usuário do produto. Adicione várias gotas de soro fisiológico quente na área do tronco cerebral para imersão da lente GRIN. Aproxime-se do tronco cerebral com a lente GRIN(Figura 4d, 5g). Ligue o LED azul excitação (455 ± 8) no microscópio em miniatura. Localize os neurônios IO transfectados GCaMP6s monitorando a imagem de fluorescência do microscópio em miniatura. Procure por neurônios IO em uma região em forma de retângulo ~0,5-1,7 mm rostral para o atlas restante e ~0,6-1,1 mm lateral à linha média na área superficial do tronco cerebral ventral(Figura 5f).NOTA: Ao procurar um campo de visão adequado para imagens de IO, procure o local onde o diâmetro médio da somata corresponde ao do neurônio de IO somata (cerca de 15 μm12). As regiões adjacentes em formação reticular medular consistem em células significativamente maiores13,14. Tenha cuidado ao mover a lente GRIN verticalmente, pois pressioná-la no tronco cerebral muito forte pode matar animal. 7. Eutanização animal após o procedimento Ao final do experimento, eutanize o animal com deslocamento cervical ou outro método aprovado pela regulação de cuidados com animais laboratoriais locais. Para posterior investigação de histologia, primeiro anestesiar o animal com droga injetável, como combinação cetamina/xilazina (100 mg/kg e 10 mg/kg,respectivamente) 15 antes da perfusão cardíaca com a solução de Ringer seguida de solução fixa para fixar o cérebro. 8. Processamento de dados Pré-processe o vídeo de imagem de cálcio gravado antes de analisar dados.NOTA: O software de processamento de dados comercial acompanhado do microscópio em miniatura foi utilizado para esta etapa e as seguintes etapas de protocolo referem-se a isso. Alternativamente, softwares gratuitos e de código aberto, como CaImAn16,MINIPIPE17e MiniscoPy18, podem ser utilizados tanto para pré-processamento quanto para análise. Carregue o vídeo de imagem de cálcio gravado no software de processamento de dados. Clique no botão Pré-processo. Defina uma área de cultivo excluindo regiões sem neurônios fluorescentes e corte o vídeo para diminuir o tamanho do arquivo para um processamento mais rápido. Clique no botão Filtro Espacial. Defina o corte baixo e o corte alto para filtro espacial para 0,005pixels -1e 0,5pixels -1, respectivamente. Aplique o filtro espacial em cada quadro do vídeo para aumentar o contraste e suavizar a imagem.NOTA: O filtro espacial é um filtro gaussiano de bandpass. Componentes de baixa frequência espacial originários de células fora do foco podem confundir a correção de movimento na próxima etapa. O componente de alta frequência espacial pode fazer com que o vídeo pareça menos suave. Clique no botão Correção de movimento. Aplique a correção de movimento ao vídeo usando o primeiro quadro como quadro de referência para reduzir os artefatos relacionados ao movimento causados pelo fluxo sanguíneo no tronco cerebral.NOTA: A correção de movimento utiliza um método de registro de imagem desenvolvido por Thevenaz et al19. Exporte o vídeo corrigido por movimento como formato TIFF. Aplique CNMF-E20 no vídeo corrigido por movimento no MATLAB para identificar neurônios únicos, seguindo as instruções para o código CNMF-E MATLAB no repositório on-line21.NOTA: CNMF-E é uma abordagem de factorização matricial não negativa restrita personalizada para imagens de um fóton. Scripts de demonstração no repositório podem ser modificados e usados para processar dados.