In vivo Кальций Изображения в мыши Нижняя Оливковая
Summary
Мы представляем протокол, чтобы разоблачить ствол мозга взрослой мыши с брюшной стороны. С помощью градиентно-рефракционного индексного объектива с миниатюрным микроскопом, кальций изображения могут быть использованы для изучения активности нижней оливковой нервной сомата in vivo.
Abstract
Нижняя оливка (IO), ядро в брюшной медулле, является единственным источником альпинистских волокон, которые образуют один из двух входных путей, входящих в мозжечок. IO уже давно предлагается иметь решающее значение для управления двигателем и его деятельность в настоящее время считается в центре многих гипотез как двигательных, так и когнитивных функций мозжечка. Хотя его физиология и функция были относительно хорошо изучены на одноклеточном уровне in vitro,в настоящее время нет никаких сообщений об организации сетевой активности IO у живых животных. Это в значительной степени связано с чрезвычайно сложным анатомическим расположением IO, что затрудняет подвержение обычным флуоресцентным методам визуализации, где оптический путь должен быть создан через весь мозг, расположенный dorsally в область интереса.
Здесь мы описываем альтернативный метод получения самых новых данных визуализации кальция на уровне IO. Метод использует экстремальное брюшное расположение IO и включает в себя хирургическую процедуру для вставки градиентно-рефракционного индекса (GRIN) объектив через шею внутренности вступают в контакт с вентальной поверхности датчика кальция GCaMP6s-выражая ИО у анестезированной мышей. Показано, что репрезентативная запись изображений кальция демонстрирует возможность записи активности нейронов IO после операции. Хотя это не выживаемость хирургии и записи должны быть проведены под наркозом, он позволяет избежать повреждения жизненно важных ядер ствола мозга и позволяет проводить большое разнообразие экспериментов, исследуя spatiotemporal модели активности и входной интеграции в IO. Эта процедура с модификациями может быть использована для записи в других, смежных областях брюшного ствола мозга.
Introduction
Основная цель системной нейронауки – понять, как патиотемпоральные модели активности нейронных сетей способствуют генерации поведения животных. Таким образом, флуоресцентная методология визуализации с использованием чувствительных к кальцию зондов в последнее десятилетие стала основным инструментом для изучения активности нейроннойсети у живых животных 1,2 , так как позволяет визуализироватьтакуюдинамику в пространственных масштабах от одиночных клеток до мезомасштабных схем. В последние годы общий подход, при котором нейронные цепи в поверхностных структурах мозга (таких как мозговые или мозжечковые кортисы)изобрагются через прозрачное черепное окно 3, дополняется использованием градиентно-рефракционных линз (GRIN)4, позволяющих изучать динамику сети в глубоких структурах мозга. В настоящее время доступные линзы GRIN позволяют достичь в структуры несколько миллиметров глубиной, такие как мышеловка миндалина, гиппокамп и базальныеганглии 5. Тем не менее, многие области интереса, такие как различные ядра в брюшной медулле лежат значительно глубже, помещая их в крайности досягаемости объектива GRIN.
Здесь мы описываем, как преодолеть эту трудность, воспользовавшись относительно легкой доступностью медуллы через брюшной аспект мозга. Используя взрослых мышей, где нижняя оливка (IO), ядро в брюшной медулле, была вирусно трансфицирована с датчиком кальция GCaMP6s, мы описываем хирургические шаги (измененные из метода, описанного первоначально в Khosrovani и др. 20076), чтобы поместить объектив GRIN на брюшной поверхности мозга обезболивающей мыши. Используя миниатюрный микроскоп, мы демонстрируем целесообразность записи нейронной активности в таких чрезвычайно вентраловых областях мозга. Хотя процедура обязательно не выживаемость хирургии и никаких экспериментов может быть выполнена в бодрствующим животным, метод позволяет изучение нетронутой динамики сети в контексте сенсорной или другой афферентной стимуляции пути, обеспечивая явные преимущества по сравнению с ex vivo-подходов, таких как использование острых препаратов ломтик.
Protocol
Representative Results
Discussion
Поскольку хирургическая процедура включает в себя операции, выполняемые в области горла с многочисленными жизненно важными структурами (артериями, нервами), важно, чтобы она проводилась исследователем с высоким уровнем хирургических навыков. Далее мы выделяем и комментируем несколько ключевых моментов процедуры; однако, следует напомнить, что никакое количество письменных советов не может вытеснить опыт, мастерство и интуицию исследователя.
Наиболее важным шагом в хирургии является трахеотомия. Она включает в себя резки трахеи, переключение изофлюрана из конуса носа в инубации трубки, обеспечение трахеи к коже грудной клетки и связывания трахеи и инубации трубки вместе. Все эти операции должны быть завершены в гладкой и быстрой манере, чтобы избежать несчастных случаев, таких как неадекватная анестезия, приток жидкости в трахею или инуляции трубки соскальзывания. Нужно иметь протокол ясно в виду, прежде чем резки трахеи.
Кровоизлияние является одной из основных причин смерти животных в этой операции. Так как область шеи плотная с кровеносными сосудами, разрез должен быть выполнен только тогда, когда линия видимости ясна, чтобы избежать резки невидимых вен и артерий. Таким образом, мышцы и соединительные ткани, заслоняющие зрение, должны быть удалены, а кровь из сломанных капилляров должна быть очищена перед продвижением.
С начала операции животное может прожить в живых длительное время (более 8 часов). Тем не менее, важно закончить хирургическую процедуру быстро, так что больше времени для изучения нейронов ствола мозга, когда физиологическое состояние животных хорошее. Квалифицированный исследователь может закончить всю процедуру за 70 минут.
Хотя метод обеспечивает чистый вид поверхностей брюшного мозга, это, к сожалению, невозможно сделать это без выполнения трахеотомии, а также удаление значительного количества тканей в области горла. Поэтому животному нельзя позволить проснуться от наркоза. Кроме того, несмотря на то, что животное можно поддерживать в живых в течение многих часов при тщательной корректировке анестезии, поддержании температуры тела и гидратации, неизбежно, что длительные эксперименты в конечном итоге приведет к ослаблению состояния животного. Это оставлено на экспертизу исследователя, чтобы рассмотреть максимальную продолжительность стабильных записей.
Еще одно потенциальное ограничение метода, описанное здесь, заключается в том, что, поскольку объектив GRIN не вставляется в паренхиму мозга, можно изучить только относительно поверхностные нейроны (150-200 мкм). В то время как хирургическая имплантация объектива GRIN технически возможна, метод острой хирургии не позволяет достаточно времени для нейронов, чтобы оправиться от окислительного стресса и наличие крови после имплантации, вероятно, ухудшит качество изображения за пределами приемлемого.
Несмотря на вышеуказанные опасения, мы считаем, что это первый раз, когда метод для виво изображения нейронов IO представлен. Это позволяет изутовить spatiotemporal деятельности в нейронах IO в контексте in vivo в присутствии нетронутых афферентных входов от сенсорных систем, а также сигналов от мозжечковых ядер и мезодиенцефалическогосоединения 22, подвиг, который не был возможен до сих пор. С помощью этого метода, функция IO теперь может быть исследована в большей глубине с сочетанием сенсорной и оптогенетической стимуляции. Примечательно, что с эволюцией визуализации напряжения (например, наш недавний метод визуализации напряжения в IO 23), мы надеемся, что представленный хирургический метод будет вдохновлять многочисленных исследователей взять на себя задачу изучения того, как IO способствует генерации мозжечковых сложных шипов.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Эндрю Скотта из медиа-центра OIST за помощь в записи и редактировании видео. Кроме того, мы благодарим Хьюго Hoedemaker за его помощь в разработке хирургии разоблачить ствол мозга и д-р Кевин Дорганс за его помощь в рисовании диаграмм для цифр. Кроме того, большое спасибо Сальваторе Лакаве за его закадровый голос, а также всем членам nRIM и домашним животным за постоянную поддержку благополучия в трудные времена COVID-19.
Materials
| AAV.CAG.GCaMP6s.WPRE.SV40 | Addgene, USA | 100844-AAV9 | |
| Absorbable suture with 6 mm half circle needle | Natume, Japan | L6-60N2 | hook needle with thread |
| Absorption triangles | FST, Germany | 18105-03 | Surgical sponges |
| Stereo microscopes | Leica, Germany | M50 | |
| Castroviejo curved tip needle holder with lock | FST, Germany | 12061-01 | Surgery tool |
| cotton swabs | Sanyo, Japan | HUBY-340 | |
| Delicate suture tying forceps | FST, Germany | 11063-07 | Surgery tool |
| Delicate Suture Tying Forceps | FST, Germany | 11063-07 | Surgery tool |
| Dumont #5/45 forceps | FST, Germany | 11251-35 | Surgery tool |
| Fine Iris scissors | FST, Germany | 14060-09 | Surgery tool |
| Friedman-Pearson rongeur curved tip | FST, Germany | 16221-14 | Surgery tool |
| Gelfoam absorbable gelatin sponge | Pfizer, USA | 0315-08 | Hemostatic gelatin sponge |
| Glass-Capillary Nanoinjection | Neurostar, Germany | n/a | For virus vector injection |
| Graefe Forceps with serrated tip | FST, Germany | 11052-10 | Surgery tool |
| Implantation rod | Inscopix, USA | n/a | It is part of the nVoke2 system. It's designed to nVoke2 miniature microscpe and GRIN lens can be mounted on it |
| IsoFlo | Zoetis, UK | n/a | Isoflurane |
| KETALAR FOR INTRAMUSCULAR INJECTION | Daiichi Sankyo, Japan | n/a | Ketamine |
| Kimwipes | Kimberly-Clark, USA | Cleaning tissue | |
| Laser-Based Micropipette Puller | Sutter Instrument, USA | P-2000 | |
| Micropipette Beveler | Sutter Instrument, USA | BV-10 | |
| Motorized Stereotaxic based on Kopf, Model 900 | Neurostar, Germany | n/a | Stereotaxic frame |
| mouseOxPlus with rectal temperature sensor and thigh clamp pulse oximeter | Starr Life Sciences, PA, USA | MouseOxPlus | Measures animal heart rate, arterial oxygen saturation (SpO2), breath rate, and temperature |
| nVoke2 integrarted Calcium imaging micro camera system | Inscopix, USA | 1000-003026 | Miniature microscope |
| Ohaus Compact Scales | Ohaus, USA | CS 200 | Scale used to weight animal |
| Otsuka Normal Saline | Otsuka Pharmaceutical Factory, Japan | n/a | |
| Physiological-biological temperature controller system | SuperTech Instruments, Hungary | TMP-5b | Thermal pad for mouse |
| ProView Lens Probe 1.0 mm diameter, 9.0 mm length | Inscopix, USA | 1050-002214 | Gradient-refractive index (GRIN) lens |
| Q114-53-10NP glass capillaries | Sutter Instrument, USA | 112017 | Customized quartz glass capillaries |
| Safety IV Catheter 20G | B. Braun, Germany | 4251652-03 | 20 gauage catheter used to prepare intubation tube |
| Sand paper | ESCO, Japan | EA366MC | Used to polish the tip of 25G needle to prepare curved and blunt needle |
| Scalpel blade | Muromachi Kikai, Japan | 10010-00 | Used to cut the tip of quartz glass pipette |
| SomnoSuite low flow inhalation anesthesia system | Kent Scientific, USA | SOMNO | Provides precise control of isoflurane flow |
| Surgic XT Plus drill | NSK | Y1002774 | For virus vector injection |
| Syringe 1 ml | Terumo, Japan | SS-01T | |
| Syringe needle 25G | Top, Japan | 00819 | Used to make blunt and bended needle |
| Syringe needle 26G | Terumo, Japan | NN-2613S | |
| Thrive 2100 Professional Trimmer | Thrive, Japan | n/a | Shaver |
| Vannas-Tübingen spring scissors | FST, Germany | 15004-08 | Surgery tool |
| Vaseline | Hayashi Pure Chemical, Japan | 22000255 | |
| Veet sensitive skin | Veet, Canada | n/a | Hair removal cream |
| Xylocaine Jelly 2 % 30ml | Aspen Japan, Japan | 871214 |
References
- Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology. British Journal of Pharmacology. , (2011).
- Zhang, T., et al. Kilohertz two-photon brain imaging in awake mice. Nature Methods. , (2019).
- Lin, X., Zhao, T., Xiong, W., Wen, S., Jin, X., Xu, X. M. Imaging neural activity in the primary somatosensory cortex using Thy1-GCaMP6s transgenic mice. Journal of Visualized Experiments. 2019 (143), 1-8 (2019).
- Lee, H. S., Han, J. H. Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse. Journal of visualized experiments. (162), 1-19 (2020).
- Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy. Nature Methods. 16 (1), 11-13 (2019).
- Khosrovani, S., Van Der Giessen, R. S., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. G. In vivo mouse inferior olive neurons exhibit heterogeneous subthreshold oscillations and spiking patterns. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (40), 15911-15916 (2007).
- Osten, P., Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2007).
- Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice. Journal of visualized experiments : JoVE. , e61023 (2020).
- Green, C. J., Knight, J., Precious, S., Simpkin, S. Ketamine alone and combined with diazepam or xylazine in laboratory animals: A 10 year experience. Laboratory Animals. 15 (2), 163-170 (1981).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable andn inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (2), 174-178 (2011).
- Vrieler, N., et al. Variability and directionality of inferior olive neuron dendrites revealed by detailed 3D characterization of an extensive morphological library. Brain Structure and Function. , 1677-1695 (2019).
- Esposito, M. S., Capelli, P., Arber, S. Brainstem nucleus MdV mediates skilled forelimb motor tasks. Nature. , (2014).
- Martin, E. M., Devidze, N., Shelley, D. N., Westberg, L., Fontaine, C., Pfaff, D. W. Molecular and neuroanatomical characterization of single neurons in the mouse medullary gigantocellular reticular nucleus. Journal of Comparative Neurology. , (2011).
- Cold Spring Harbor. Ketamine/Xylazine. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. eLife. 8, 1-45 (2019).
- Lu, J., et al. MIN1PIPE: A Miniscope 1-Photon-Based Calcium Imaging Signal Extraction Pipeline. Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).
- . GitHub – PeyracheLab/miniscoPy: A package to analyse calcium imaging data recorded with the Miniscope Available from: https://github.com/PeyracheLab/miniscoPy (2020)
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. , (1998).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. eLife. 7, 1-37 (2018).
- . GitHub – zhoupc/CNMF_E: Constrained Nonnegative Matrix Factorization for microEndoscopic data Available from: https://github.com/zhoupc/CNMF_E (2020)
- De Gruijl, J. R., Bosman, L. W. J., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. G. Inferior olive: All ins and outs. Handbook of the Cerebellum and Cerebellar Disorders. , (2013).
- Dorgans, K., Kuhn, B., Uusisaari, M. Y. Imaging Subthreshold Voltage Oscillation With Cellular Resolution in the Inferior Olive in vitro. Frontiers in Cellular Neuroscience. , (2020).
