Генерация мышиных первичных эпителиальных монослоев толстой кишки из кишечных крипт

Все процедуры, описанные ниже, были одобрены и проведены в соответствии с руководящими принципами, установленными Комитетом по институциональным уходу и использованию животных Мичиганского университета. 1. Подготовка реагентов для выделения и культивирование крипты (подготовка в тканевом культуре вытяжки) 50 мМ этилендиамина тетрауксусной кислоты (ЭДТА): Добавьте 50 мл 0,5 мл к 450 мл фосфатного буферного физиологического раствора без кальция (Ca2+)и магния (Mg2+)для приготовления 500 мл. В этом протоколе PBS будет относиться к PBS без кальция и магния, если не указано иное. Коктейльный буфер: Растворите 7,4 г сахарозы (43,3 мМ) и 5 г сорбита (54,9 мМ) в PBS для приготовления 500 мл. L-WRN (L-Wnt-3A, R-спондин и Ноггин) среды: Дополнение Advanced Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Ham’s F-12 (DMEM/F12) (780 мл) с 20% фетальной бычим сывороткой (FBS) (200 мл), 1x коммерчески доступной добавкой глутамина (10 мл), 100 Ед /мл пенициллина и 100 г/мл стрептомицина (10 мл) и стерилизовать фильтр с фильтром 0,22 мкм. Получайте клетки L-WRN через ATCC, выращивайте в колбах T175 и выбирайте с помощью Geneticin и Hygromycin. Медиа меняется и собирается в течение 12 дней.ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая партия носителей проверяется на активность Wnt с использованием анализа TOPflash Wnt Reporter. В этом случае были соблюдена протоколы Лаборатории трансляционного моделирования тканей Мичиганской медицины (https://www.umichttml.org/protocols). Клеточная линия TOPflash HEK 293 выращивается до слияния в колбе T75, трипсинизируется и наносится на пластину из 96 скважин. На следующий день различные разведения собранной среды добавляют к клеткам и инкубировали в 5% инкубаторе CO2 при 37 °C в течение ночи. На следующий день клетки льются, а анализ люциферазы светлячков проводится в соответствии с инструкциями производителя. Анализ нормализуют с помощью рекомбинантного Wnt-3A. Среда делится на 25 мл аликвот в конических трубках по 50 мл и хранится при -80 °C. Базовые среды: Для 500 мл добавка Advanced DMEM/F12 (448 мл) с 2x коммерчески доступной добавкой глютамина (10 мл), 20 мМ HEPES (10 мл), 100 ЕД/мл пенициллина и 100 г/мл стрептомицина (10 мл), 2 мМ N-ацетил-L-цистеина (2 мл), добавка N2 (10 мл) и добавка B27 (20 мл), фильтр стерилизовать фильтром 0,22 мкм. Разделите жиму на 25 мл аликвот в конической трубке по 50 мл и храните при -80 °C. LWRN complete media: Комбинируйте 25 мл среды LWRN с 25 мл базовой среды и добавку с 200 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF) (20 мкл) и 2x антибиотик-антимикотический раствор (1 мл). Храните всю мупли при 4 °C. Коллаген и ламинин: Растворите 5 мг порошка в 5 мл стерилизованной фильтрующей 100 мМ уксусной кислоты (добавьте 60 мкл уксусной кислоты к 9,94 мл воды молекулярного класса) для получения концентрации запаса 1 мг / мл. Вращают при 4 °C в течение 4 ч и делают 100 мкл аликвот в пробирках по 0,2 мл. Заморозить при -20 °C. Ламинин приобретается в концентрации 100 мкг/мл. Полная среда без факторов роста (CMGF-): Добавка Advanced DMEM/F12 (500 мл) с 1x коммерчески доступной добавкой глютамина (5 мл), 10 мМ HEPES (5 мл), 100 Ед/мл пенициллина и 100 г/мл стрептомицина (5 мл). Дифференцировка среды: к 9,2 мл CMGF-среды добавьте 200 мкл добавки B27, 100 мкл добавки N2, 20 мкл N-ацетил-L-цистеина, 500 мкл noggin media12 (изготовленной из Noggin-продуцирующих клеток) и 2 мкл EGF, чтобы получить 10 мл дифференцировки среды. 2. Подготовка пластин, камерных слайдов и вкладышек клеточных культур Покрытие 48-скважинной пластины и камерных слайдов для покрытия 2D монослоя: Используйте раствор покрытия, который представляет собой ламинин (разбавление 1:40, см. Таблицу материалов)и коллаген (разбавление 1:30) в холодном буферном фосфатном физиологическом растворе Dulbecco с Ca2+ и Mg2+ (DPBS). Добавляют 200 мкл раствора покрытия в каждую скважину и предварительно инкубируют пластину/камерный слайд в 5% инкубаторе CO2 при 37 °C в течение не менее 2 ч. Покрытие мембранных вставок клеточной культуры 0,4 мкм: Сделайте разбавление коллагена 1:30 в воде молекулярного класса и добавьте 200 мкл к каждой вставке. Держите пластину, содержащую мембранную вставку, на льду при 4 °C в течение 30 мин. После 30 мин инкубации держите пластину в 5% CO2 инкубаторе при 37 °C в течение 1,5-2 ч. Мембранные вставки из полиэстера и поликарбоната дают сопоставимые результаты.ПРИМЕЧАНИЕ: Любая пластина для посева тканей может быть посеяна (может быть выполнено масштабирование вверх и вниз) с использованием этого протокола путем регулировки объема коллагена / ламинина для получения полного покрытия поверхности покрытия. 3. Изоляция крипты ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом рассечения приготовьте коллагеновые и/или пластинчатые вставки/мембранные вставки/слайд камеры с покрытием коллагеном и/ламинином и оставьте их в инкубаторе с 5% CO2 при 37 °C. Подготовьте чистый рабочий стол и стерильные хирургические инструменты, подходящие для хирургии, а также шкаф биологической безопасности для культивирования 2D-монослоев. Убедитесь, что все другое стандартное оборудование для 2D-однослойного культивирования, такое как увлажненный инкубатор CO2, настольные центрифуги (поддерживается при 4 °C), микроскоп и пипетки (включая серологические пипетки), готовы. Используйте мышей C57Bl/6, 8-12 недель. Усыпленить мышей, используя одобренный метод эвтаназии. Опрыскивайте туши мышей 70% раствором этанола (EtOH) для очистки области рассечения и удаления избытка EtOH с помощью бумажной салфетки.ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что крипты изоляции крипт (такие как PBS, 50 мМ ЭДТА, буфер встряхивания) хранятся в холодном состоянии. Эти реагенты могут быть приготовлены за один день до этого и хороши для использования в течение не менее 3 месяцев при хранении при 4 °C. Кроме того, убедитесь, что полная среда LWRN хранится в шариковой / водяной бане при 37 °C до использования. Используя чистые ножницы для рассечения и щипцы, рассеките толстую кишку от прямой кишки до слепой кишки. Удерживайте конец толстой кишки с помощью щипцов и очень осторожно смывайте фекалии с помощью ледяного PBS в шприце 10 мл, оснащенном питательной трубкой 20 Г(рисунок 1A). Убедитесь, что вы не разорваны толстой кишкой. Удалить проксимальную часть толстой кишки. Это будет участок толстой кишки, ближайший к илеоцекальному соединению. С помощью щипцов осторожно сдвиньте дистальную обитель на питательную трубку 20 г, связав толстую кишку в конце трубки наконечником с помощью 4-0 шелковой шовной нити(рисунок 1B). Переверните толстую кишку наизнанку пальцами через связанный конец и свяжите другой конец шелковой шовной нитью 4-0. Используя хирургические ножницы, срежьте толстую кишку ниже кончика питательной трубки(рисунок 1C,D, E). Используя поршень повторного шприца 1,25 мл, осторожно откройте развязанный конец перевернутой толстой кишки на кончике повторного шприца 1,25 мл. Сдвиньте перевернутую обхватку на конец шприца и плотно завяжите шелковой шовной нитью 4-0(рисунок 1F,G). Вставьте поршень в шприц и надувайте толстую кишку, чтобы сформировать колбасу. Надувать до тех пор, пока колбаса толстой кишки не будет выглядеть тургентной без видимых морщин(рисунок 1H). Поместите шприц/толстую кишку в 15 мл пробирки с 5 мл раствора для восстановления клеток на льду в течение 20 мин, раздувайте и сдувайте толстую кишку один раз в 5 мин(Рисунок 1I). Колбаса должна оставаться надутой во время инкубации. Завяжите 4-0 шелковой шовной нитью ниже кончика повторного шприца с надутой толстой кишкой. Отрежьте колбасу от повторного шприца и поместите в 15 мл пробирку, содержащую 10 мл 50 мМ (2 мМ для тонкой кишки) ЭДТА в течение 40 мин и вращайте при 4 °C(рисунок 1J,K). Отстой от раствора ЭДТА и замените 5 мл встряхивания буфера. Взбалтнуть колбасу вручную в вертикальном положении (энергично) в течение 2 мин. Декантирует встряхивающий раствор в новую трубку объемом 15 мл и повторяет шаг встряхивания в общей сложности 10 мл крипт в встряхивающий буфер. Возьмите 20 мкл суспензии крипты в чашке Петри и подсчитайте количество склепов под микроскопом. Рассчитайте концентрацию крипты в криптах/мкл. В зависимости от концентрации разбавьте образцы до получения 5 крипт/мклв момент нанесения покрытия (1000 крипт/см2). Вращайте трубку с изолированными криптами с помощью настольной центрифуги при 400 х г в течение 10 мин при 4 °C. Тем временем извлеките из инкубатора 48-скважинную пластину/вставку/камеру и поместите ее в шкаф для обеспечения биобезопасности. Аспирировать раствор покрытия с помощью P200 и оставить пластину с крышкой, слегка смещенной, пока ячейки не будут готовы к покрытию. 4. Культивирование 2D монослоя ПРИМЕЧАНИЕ: Для подробного протокола о том, как генерировать монослои кишечного эпителия из 3D-колоноидов, проверьте протоколы лабораторий Эстеса и Ковбаснюка (7,11). Снимите трясущийся буфер с помощью серологической пипетки 10 мл. Убедитесь, что гранула цела и может использовать P1000 для удаления оставшейся жидкости. Повторно суспензируют гранулы в 3 мл полной среды LWRN и пипетки вверх и вниз с P1000. Добавьте 200 мкл крипт в каждую скважину предварительно покрытой 48-скважинной пластинчатой/камерной горки и инкубируют в 5% CO2 инкубаторе при 37 °C. На следующий день аспирировать носитель с помощью P200 и добавить свежие носители. Клетки слиются через 24-48 ч. Для мембранных вставок клеточной культуры добавьте 200 мкл крипт (5 крипт/мкл) в верхнюю часть вкладышей и 600 мкл полной среды L-WRN в нижнюю часть. На следующий день аспирировать носитель с помощью P200 и добавлять свежие носители только в верхнюю камеру. Инкубировать пластину в 5% CO2 инкубаторе при 37 °C. Трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER) измеряется каждый день с помощью эпителиального вольт/Омметра (EVOM).ПРИМЕЧАНИЕ: Если культура имеет значение TEER более 300 Ω,см2, они должныбытьслижены. Слияние достигается через 3-4 дня. Меняйте медиафайлы каждые 2 дня.