Erzeugung von murinen primären Dickdarmepithel-Monoschichten aus Darmkrypten

Alle unten beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee der University of Michigan genehmigt und durchgeführt. 1. Herstellung von Reagenzien zur Kryptenisolierung und -kultur (in Gewebekulturhaube vorbereiten) 50 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA): 50 ml 0,5 m Schaft zu 450 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung ohne Calcium (Ca2+)und Magnesium(Mg2+)hinzufügen, um 500 ml zuzubereiten. In diesem Protokoll bezieht sich PBS auf PBS ohne Kalzium und Magnesium, sofern nicht anders angegeben. Schüttelpuffer: 7,4 g Saccharose (43,3 mM) und 5 g Sorbit (54,9 mM) in PBS auflösen, um 500 ml vorzubereiten. L-WRN (L-Wnt-3A, R-Spondin und Noggin) Medien: Ergänzung Advanced Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Ham’s F-12 (DMEM/F12) (780 mL) mit 20% Fetal Bovine Serum (FBS) (200 ml), 1x handelsübliches Glutaminpräparat (10 ml), 100 U/ml Penicillin und 100 g/ml Streptomycin (10 ml) und Filtersterilisation mit 0,22 μm Filter. Holen Sie sich L-WRN-Zellen durch ATCC, wachsen Sie in T175-Kolben und wählen Sie mit Geneticin und Hygromycin. Medienwechsel und -sammlung für 12 Tage.HINWEIS: Jede Charge von Medien wird mit einem TOPflash Wnt Reporter-Assay auf Wnt-Aktivität getestet. In diesem Fall wurden die Michigan Medicine Translational Tissue Modeling Laboratory Protokolle (https://www.umichttml.org/protocols) befolgt. Die TOPflash HEK 293 Zelllinie wird in einem T75-Kolben bis zur Konfluenz gezüchtet, trypsinisiert und auf eine 96-Well-Platte plattiert. Am nächsten Tag werden verschiedene Verdünnungen der gesammelten Medien in die Zellen eingelegt und in einem 5% CO2 Inkubator bei 37 °C über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag werden die Zellen lysiert und der Firefly Luciferase-Assay wird gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Der Assay wird mit rekombinantem Wnt-3A normalisiert. Das Medium wird in 25 mL Aliquoten in 50 mL konischen Rohren aufgeteilt und bei -80 °C gelagert. Basismedien: Für 500 ml, Ergänzung Advanced DMEM/F12 (448 ml) mit 2x handelsüblichem Glutaminpräparat (10 ml), 20 mM HEPES (10 ml), 100 U/ml Penicillin und 100 g/ml Streptomycin (10 ml), 2 mM N-Acetyl-L-Cystein (2 ml), N2 Ergänzung (10 ml) und B27 Ergänzung (20 ml), Filter sterilisieren mit 0,22 μm Filter. Teilen Sie das Medium in 25 ml Aliquoten in 50 ml konischem Rohr und lagern Sie es bei -80 °C. LWRN-Komplettmedien: Kombinieren Sie 25 ml LWRN-Medien mit 25 ml Basismedien und ergänzen Sie sie mit 200 ng/ml Epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) (20 μL) und 2x antibiotisch-antimykotische Lösung (1 ml). Lagern Sie das komplette Medium bei 4 °C. Kollagen und Laminin: 5 mg Pulver in 5 ml filtersterilisierter 100 mM Essigsäure auflösen (60 μL Essigsäurestock zu 9,94 ml molekularem Wasser hinzufügen), um eine Stammkonzentration von 1 mg / ml zu erzeugen. Drehen Sie bei 4 °C für 4 h und machen Sie 100 μL Aliquoten in 0,2 ml Röhrchen. Bei -20 °C einfrieren. Laminin wird in einer Lagerkonzentration von 100 μg/ml gekauft. Komplette Medien ohne Wachstumsfaktoren (CMGF-): Supplement Advanced DMEM/F12 (500 mL) mit 1x handelsüblichem Glutaminpräparat (5 mL), 10 mM HEPES (5 mL), 100 U/ml Penicillin und 100 g/ml Streptomycin (5 ml). Differenzierungsmedien: Zu 9,2 ml CMGF-Medien werden 200 μL B27-Ergänzung, 100 μL N2-Ergänzung, 20 μL N-Acetyl-L-Cystein, 500 μL Noggin-Medium12 (aus Noggin-produzierenden Zellen) und 2 μL EGF hinzugefügt, um 10 ml Differenzierungsmedien herzustellen. 2. Vorbereitung von Platten, Kammerträgern und Zellkulturmembraneinsätzen Beschichtung von 48-Well-Platten- und Kammerträgern zur Beschichtung von 2D-Monoschichten: Verwenden Sie die Beschichtungslösung, die Aus Laminin (1:40 Verdünnung, siehe Materialtabelle)und Kollagen (1:30 Verdünnung) in kalter Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit Ca2+ und Mg2+ (DPBS) besteht. Fügen Sie 200 μL Beschichtungslösung zu jeder Vertiefung hinzu und bebrüten Sie den Platten-/Kammerträger in einem 5% CO 2-Inkubator bei 37 °C für mindestens 2 h vor. Beschichtung von 0,4 μm Zellkulturmembraneinsätzen: Kollagen in molekularem Wasser in 1:30 verdünnen und jedem Einsatz 200 μL hinzufügen. Halten Sie die Platte mit dem Membraneinsatz 30 min lang bei Eis bei 4 °C. Nach 30 min Inkubation die Platte in einem 5% CO2 Inkubator bei 37 °C für 1,5-2 h aufbewahren. Polyester- und Polycarbonat-Membraneinsätze liefern vergleichbare Ergebnisse.HINWEIS: Jede Gewebekulturplatte kann mit diesem Protokoll ausgesät werden (Up- und Downscaling kann durchgeführt werden), indem das Kollagen- / Lamininvolumen angepasst wird, um eine vollständige Abdeckung der Beschichtungsoberfläche zu erhalten. 3. Krypto-Isolation HINWEIS: Bevor Sie mit der Dissektion beginnen, bereiten Sie kollagen- und/oder lamininbeschichtete Platten-/Membraneinsätze/Kammerträger vor und lassen Sie sie in einem 5% CO2 Inkubator bei 37 °C. Bereiten Sie eine saubere Werkbank und sterile chirurgische Instrumente vor, die für die Operation geeignet sind, sowie eine biologische Sicherheitswerkbank für die Kultivierung von 2D-Monoschichten. Bestätigen Sie, dass alle anderen Standardgeräte für die 2D-Monoschichtkultur wie befeuchteter CO 2-Inkubator, Tischzentrifugen (bei 4 °C gehalten), Mikroskop und Pipetten (einschließlich serologischer Pipetten) fertig sind. Verwenden Sie C57Bl/6 Mäuse, 8-12 Wochen alt. Euthanasiern Sie Mäuse mit einer zugelassenen Methode der Euthanasie. Besprühen Sie die Mäusekadaver mit 70% igem Ethanol (EtOH) -Lösung, um den Sezierbereich zu reinigen und überschüssiges EtOH mit Papiertaschentüchern zu entfernen.HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Kryptationsreagenzien (z. B. PBS, 50 mM EDTA, Schüttelpuffer) kalt gehalten werden. Diese Reagenzien können einen Tag vorher zubereitet werden und sind bei Lagerung bei 4 °C mindestens 3 Monate gut einsetzbar. Stellen Sie außerdem sicher, dass das LWRN-Komplettmedium bis zur Verwendung in einem Perlen-/Wasserbad bei 37 °C aufbewahrt wird. Sezieren Sie mit einer sauberen Dissektionsschere und Einer Zette den Dickdarm vom Rektum bis zum Blinddarm. Halten Sie das Ende des Dickdarms mit einer Zette und spülen Sie den Kot sehr vorsichtig mit eiskaltem PBS in einer 10-ml-Spritze ab, die mit einem 20-G-Ernährungsröhrchen ausgestattet ist (Abbildung 1A). Stellen Sie sicher, dass Sie den Dickdarm nicht reißen. Entfernen Sie den proximalen Dickdarm. Dies ist der Teil des Dickdarms, der der ileozekalen Verbindung am nächsten ist. Mit einer Zette den distalen Dickdarm vorsichtig auf die 20 G-Zuführsonde schieben und den Dickdarm am Ende des Sondens durch die Spitze mit 4-0 Seidennähtfaden abkneiden (Abbildung 1B). Kehren Sie den Dickdarm von innen nach außen mit den Fingern über das abgebundene Ende und binden Sie das andere Ende mit 4-0 Seidennähtfaden. Schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere den Dickdarm unterhalb der Spitze der Ernährungssonde ab (Abbildung 1C,D, E). Öffnen Sie mit dem Kolben einer 1,25 ml Wiederholungsspritze vorsichtig das ungebundene Ende des invertierten Dickdarms auf die Spitze einer 1,25 ml Wiederholungsspritze. Schieben Sie den umgekehrten Doppelpunkt auf das Ende der Spritze und binden Sie ihn fest mit 4-0 Seidennähtgewinde (Abbildung 1F, G). Führen Sie den Kolben in die Spritze ein und blasen Sie den Dickdarm auf, um eine Wurst zu bilden. Aufblasen, bis die Darmwurst ohne sichtbare Falten turgen aussieht (Abbildung 1H). Legen Sie die Spritze/ den Dickdarm in ein 15-ml-Röhrchen mit 5 ml Zellrückgewinnungslösung für 20 minuten auf Eis, blasen Sie den Dickdarm einmal alle 5 Minuten auf und entleeren Sie sie (Abbildung 1I). Die Wurst muss während der Inkubation aufgeblasen bleiben. Mit 4-0 Seidennähtfaden unterhalb der Spitze der Wiederholungsspritze mit aufgeblasenen Dickdarm abbinden. Schneiden Sie die Wurst von der Wiederholungsspritze ab und geben Sie sie in ein 15-ml-Röhrchen mit 10 ml 50 mM (2 mM für Dünndarm) EDTA für 40 min und drehen Sie es bei 4 °C (Abbildung 1J, K). Dekantieren Sie die EDTA-Lösung und ersetzen Sie sie durch 5 ml Schüttelpuffer. Schütteln Sie die Wurst manuell in vertikaler Position (kräftig) für 2 min. Dekantieren Sie die Schüttellösung in ein neues 15-ml-Röhrchen und wiederholen Sie den Schüttelschritt für insgesamt 10 ml Krypten im Schüttelpuffer. Nehmen Sie 20 μL der Kryptensuspension in einer Petrischale und zählen Sie die Anzahl der Krypten unter einem Mikroskop. Berechnen Sie die Kryptenkonzentration in Krypten/μL. Je nach Konzentration verdünnen Sie die Proben, um zum Zeitpunkt der Beschichtung 5Krypten/μL (1000 Krypten/cm2) zu erhalten. Drehen Sie das Röhrchen mit isolierten Krypten mit einer Tischzentrifuge bei 400 x g für 10 min bei 4 °C. In der Zwischenzeit 48-Well-Platte/Insert/Kammerträger aus dem Inkubator entfernen und in die Biosicherheitswerkbank legen. Saugen Sie die Beschichtungslösung mit P200 an und lassen Sie die Platte mit dem Deckel leicht versetzt, bis die Zellen bereit sind, plattiert zu werden. 4. Kultivierung von 2D-Monolayern HINWEIS: Für ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung von Intestinalepithel-Monoschichten aus 3D-Kolonoiden überprüfen Sie die Protokolle von Estes und Kovbasnjuk Labs (7,11). Entfernen Sie den Schüttelpuffer mit einer serologischen Pipette von 10 ml. Stellen Sie sicher, dass das Pellet intakt ist und möglicherweise P1000 verwendet, um die verbleibende Flüssigkeit zu entfernen. Suspendieren Sie das Pellet in 3 ml LWRN-Komplettmedium erneut und pipetten Sie es mit P1000 auf und ab. 200 μL Krypten zu jeder Vertiefung eines vorbeschichteten 48-Well-Platten-/Kammerschlittens geben und in einem 5%igen CO 2-Inkubator bei 37 °C inkubieren. Am nächsten Tag saugen Sie das Medium mit P200 an und fügen Sie frische Medien hinzu. Die Zellen konfluenten in 24-48 h. Für Zellkulturmembraneinsätze fügen Sie 200 μL Krypten (5 Krypten/μL) an der Oberseite der Einsätze und 600 μL vollständige L-WRN-Medien an der Unterseite hinzu. Am nächsten Tag das Medium mit P200 absaugen und frisches Medium nur in die obere Kammer geben. Inkubieren Sie die Platte in einem 5% CO2 Inkubator bei 37 °C. Der transepitheliale elektrische Widerstand (TEER) wird täglich mit dem Epithelial Volt/Ohm-Messgerät (EVOM) gemessen.HINWEIS: Wenn die Kultur einen TEER-Wert von mehr als 300 Ω,cm2hat, sollen sie konfluent sein. Die Konfluenz wird in 3-4 Tagen erreicht. Wechseln Sie die Medien alle 2 Tage.